口服木杂酚油对人体肠道菌群无杀菌活性

摘要

木杂酚油是一种简单的酚类化合物的混合物，作为一种止泻药已被长期使用了一个多世纪。虽然有许多药理学研究可以解释木杂酚油的止泻作用，但长期以来一直存在争议，木杂酚油的止泻作用是否归因于其假定的对人体肠道菌群的杀菌作用。我们研究的目的是调查假定的杀菌作用，木杂酚油在人体肠道给予普通治疗剂量。为此，我们使用体外试验来测量木材杂酚油对人体肠道中各种细菌的最低抑制浓度。此外，我们还对健康人类参与者在给予治疗剂量木杂酚油后的粪便中细菌16S核糖体DNA的拷贝数进行了量化。我们测定木材杂酚油的最低抑菌浓度为>128µg/ml，远高于常用抗菌剂的水平。人粪便中细菌16S核糖体DNA拷贝数与给药前相比无显著变化(p > 0.05)。综上所述，我们得出的结论是，在人体下肠中，以普通治疗剂量给予木杂酚油没有显著的抗菌作用。因此，木杂酚油的止泻特性不是由于它对肠道菌群的影响，而是由于它对肠道的其他影响。

关键字

木杂酚油、肠;菌群，最低抑制浓度，核糖体DNA

介绍

木材杂酚油(WC)是由木材焦油[1]分馏得到的酚、愈创木酚、对甲酚、甲酚、4-乙基愈创木酚等酚类化合物的混合物。在一些国家，WC的商标名为Seirogan，长期以来一直被用作止泻药[2]。WC及其组成化合物已知通过氯离子通道抑制肠毒素诱导的肠液分泌[3-5]，并抑制平滑肌收缩[6,7]。事实上，WC的主要成分之一，4-乙基愈橘醇，已知具有后一种活性[8]。根据Morino等人的发现。WC的抗运动作用是由于它抑制了Ca^2＋在胃肠道细胞中动员[9]。Ataka等人从对大鼠进行的实验结果中提出，应激性腹泻可能通过阻断结肠[10]中的血清素受体而受到抑制。

这些研究结果可以很好地解释WC的止泻作用。然而，WC的止泻作用是否与其假定的抗菌活性有关，长期以来一直存在争议。事实上，WC含有知名的无菌剂，如苯酚和对甲酚[1]，这些都是以前医院使用的防腐剂。口服普通治疗剂量的药用WC可立即从胃肠道吸收，其代谢物血药浓度在给药后30分钟达到峰值[11,12]。这些结果提示WC是从上消化道吸收，即胃和十二指肠[12]。此外，这些观察进一步表明，回肠下段和结肠中WC的浓度极低，而人体肠道细菌florasin主要分布在回肠下段和结肠中。因此，WC在下消化道的潜在抑菌作用是看不出来的。如果是这样的话，WC的止泻作用与其潜在的杀菌活性无关。本研究的目的是研究以普通治疗剂量口服WC在人体胃肠道中是否具有抗菌活性。

材料和方法

在vitrobacterial研究

WC的最低抑菌浓度(MIC)(批号TA-03;Taiko制药公司，大阪，日本)对各种人类肠道分离株(Don Whitley Scientific, Shipley, UK)的生长进行了根据报道的mic测试指南[13]测试。使用含有适合每种细菌的培养基的琼脂平板。在琼脂板凝固之前，将用蒸馏水稀释到不同浓度的WC加入到琼脂板中。特别注意通过剧烈搅拌使WC在水中形成均匀的原液(2664 g/ml)。在每个培养皿表面以两种细菌密度传播细菌后，培养皿在35 -42ºC的好氧或厌氧条件下培养24小时。孵育后，计数平板上的菌落数量并确定MIC。MIC定义为平板上未出现菌落的WC浓度。

人类的研究

该研究是一项没有安慰剂对照的单家医院公开试验。34名年龄在20 - 50岁之间的健康成年参与者最初被招募，其中5名男性和5名女性参与者符合这项研究的条件。每位参与者均获得书面知情同意。排除标准为正在接受医生或牙医治疗、发烧或腹泻、怀孕或可能怀孕、对WC过敏、便秘、正在用药或研究开始7天内服用其他药物者。在研究开始前，对每个参与者进行了标准的血液化学分析、尿液分析和物理分析，包括心电图检查，并确认所有数据均正常。研究方案和同意书由日本北海道宫崎整形外科临床研究伦理委员会批准。该研究在大学医院医学信息网络(UMIN临床试验注册;在审判开始之前。

在研究的第1天、第2天和第3天收集每个参与者的粪便。WC(胶囊药、Seirogan Quick C、Taiko制药)于第4天口服，每次3粒(每粒WC 45 mg)，饭后30 min内口服。每次给药(一天三次);每个参与者在第4天总共服用了9粒胶囊。第5、6、7天再次收集粪便。当无法在预定的日期获得粪便时，在第二天收集粪便，整个研究计划推迟到以后的一天。所有粪便均冷冻保存，待分析。在分析当天，DNA被提取从粪便中如前所述[14]。其次，采用SYBR premix Ex Taq II (Takara, Otsu, Japan)和Qiagen, Hilden, Germany) real-time PCR方法，定量长双歧杆菌16Sribosomal DNA (rDNA)的拷贝数。在一些实验中，采用数字PCR[15]对粪肠球菌、脆弱拟杆菌和产气荚膜梭菌的DNA样品进行16S rDNA拷贝数的定量，使用Taqman基因表达主混合和生物标记系统(Fluidigm, South San Francisco, CA, USA)。 The copy number of 16S rDNA was expressed pergram of feces.

统计分析

每个细菌16S rDNA的拷贝数首先表达为每个受试者在给药前三天(第1、2和3天)的平均值和标准差。然后，获得每个参与者服药后3天(第5、6和7天)的平均值和标准偏差。然后，通过成对单侧学生t检验比较每个参与者的剂量前和剂量后均值。如果p < 0.05，则被认为是显著的差异显著。

结果

首先，我们尝试使用实时PCR来定量粪便中细菌16S rDNA的拷贝数。长双歧杆菌在粪便中16S rDNA拷贝数变化的时间历程见表1。虽然男性和女性的16S rDNA拷贝数都有一定的波动，但两名参与者在WC给药前后比较差异无统计学意义(p分别为0.33和0.47)。在其他参与者中也发现了类似的趋势(数据未显示)。在调查其他细菌时也得到了类似的结果(数据未显示)。接下来，我们比较了5名男性参与者和5名女性参与者给药前和给药后来自长双歧杆菌(表2)、脆弱拟杆菌(表3)、产气荚膜梭菌(表4)和粪肠球菌(表5)的拷贝数均无显著变化(p分别为0.48、0.36、0.13和0.14)。因此，我们得出结论，按常规治疗剂量口服WC对杀灭肠道菌群无效。然后测定了WC对人分离菌的MIC。由表6和表7可知，所有被试菌的WC的MIC为>128µg/ml，说明其抗菌活性不显著。

表1。16S rDNA拷贝数的时间历程双歧杆菌longum在两个实验对象的粪便中

主题名称	实验一天	每克粪便复制数
男性5	1	9.0 x 10¹⁰
男性5	2	1.5 x 10¹¹
男性5	3.	2.1 x 10¹¹
的意思是SD(每天1、2、3)		1.5 x 10¹¹6.0 x 10¹⁰
男性5	5	2.3 x 10¹¹
男性5	6	6.6 x 10¹⁰
男性5	7	6.2 x 10¹⁰
的意思是SD(天5、6、7)		1.2 x 10¹¹9.6 x 10¹⁰
p值(第1、2、3天vs 5、6、7天)		０．３３
女性6	1	2.2 x 10¹⁰
女性6	2	2.4 x 10¹⁰
女性6	3.	4.4 x 10⁹
的意思是SD(每天1、2、3)		1.7 x 10¹⁰1.1 x 10¹⁰
女性6	5	1.7 x 10¹⁰
女性6	6	1.1 x 10¹⁰
女性6	7	2.1 x 10¹⁰
的意思是SD(天5、6、7)		1.6 x 10¹⁰5.0 x 10⁹
p值(第1、2、3天vs 5、6、7天)		０．４７

表2。16S rDNA的拷贝数双歧杆菌longum每克粪便。

主题名称	给药前(平均3天)	服药后(平均3天)
男1	5.1 x 10¹⁰	3.1 x 10¹⁰
男2	3.3 x 10⁶	1.1 x 10⁷
男3	7.3 x 10⁸	8.6 x 10⁸
男4	2.9 x 10¹⁰	3.6 x 10¹⁰
男性5	1.5 x 10¹¹	1.2 x 10¹¹
女性6	1.7 x 10¹⁰	1.9 x 10¹⁰
女7	1.2 x 10¹¹	1.4 x 10¹¹
女8	6.7 x 10⁶	6.4 x 10⁶
女9	1.9 x 10¹¹	1.8 x 10¹¹
女性十	9.0 x 10⁹	4.6 x 10¹⁰
的意思是	5.6 x 10¹⁰	5.7 x 10¹⁰
SD	7.0 x 10¹⁰	6.4 x 10¹⁰
p= 0.48(服药前vs服药后)

表3。16S rDNA的拷贝数脆弱拟杆菌每gramof粪便。

主题名称	给药前(平均3天)	服药后(平均3天)
男1	3.3 x 10⁸	2.8 x 10⁸
男2	6.1 x 10⁸	9.2 x 10⁹
男3	3.1 x 10¹⁰	7.5 x 10⁸
男4	1.4 x 10¹⁰	7日2 x 10¹⁰
男性5	3.4 x 10⁹	1.5 x 10⁹
女性6	4.9 x 10⁸	5.7 x 10⁸
女7	1.8 x 10⁹	3.0 x 10⁹
女8	4.4 x 10¹⁰	3.9 x 10¹⁰
女9	1.7 x 10⁹	8.8 x 10⁸
女性十	6.3 x 10⁹	2.7 x 10⁹
的意思是	1.0 x 10¹⁰	1.3 x 10¹⁰
SD	1.5 x 10¹⁰	2.4 x 10¹⁰
p= 0.36(用药前vs用药后)

表4。16S rDNA的拷贝数perfringens梭状芽胞杆菌每gramof粪便。

主题名称	给药前(平均3天)	服药后(平均3天)
男1	2.9 x 10¹⁰	8.7 x 10¹⁰
男2	3.2 x 10¹⁰	6.6 x 10¹⁰
男3	5.0 x 10¹⁰	3.2 x 10¹⁰
男4	1.4 x 10¹⁰	4.5 x 10¹⁰
男性5	1.5 x 10¹⁰	2.5 x 10¹⁰
女性6	7.3 x 10⁹	4.0 x 10¹⁰
女7	1.9 x 10¹⁰	1.0 x 10¹⁰
女8	4.6 x 10¹⁰	4.9 x 10¹⁰
女9	5.0 x 10¹⁰	4.8 x 10¹⁰
女性十	5.7 x 10¹⁰	2.2 x 10¹⁰
的意思是	3.2 x 10¹⁰	4.3 x 10¹⁰
SD	1.8 x 10¹⁰	2.2 x 10¹⁰
p= 0.13(服药前vs服药后)

表5所示。16S rDNA的拷贝数粪肠球菌每gramof粪便。

主题名称	给药前(平均3天)	服药后(平均3天)
男1	2.7 x 10¹⁰	9.5 x 10¹⁰
男2	3.4 x 10¹⁰	5.2 x 10¹⁰
男3	4.1 x 10¹⁰	2.6 x 10¹⁰
男4	9.5 x 10⁹	3.5 x 10¹⁰
男性5	1.7 x 10¹⁰	3.1 x 10¹⁰
女性6	6.0 x 10⁹	4.4 x 10¹⁰
女7	4.6 x 10¹⁰	3.4 x 10¹⁰
女8	4.3 x 10¹⁰	5.3 x 10¹⁰
女9	5.4 x 10¹⁰	4.7 x 10¹⁰
女性十	5.6 x 10¹⁰	2.5 x 10¹⁰
的意思是	3.3 x 10¹⁰	4.4 x 10¹⁰
SD	1.8 x 10¹⁰	2.1 x 10¹⁰
p= 0.14(用药前vs用药后)

表6所示。木杂酚油对本地菌株的最低抑菌浓度(MIC， ?g/ml)。

名字的细菌	应变的名字	的浓度原始汤 (cfu /毫升)	稀释 1-fold	稀释 100倍
双歧杆菌longum	DWC 2285	3.6 x 10⁸	> 128	> 128
双歧杆菌adolescentis	DWC 1480	4.1 x 10⁸	> 128	> 128
脆弱拟杆菌	DWC 0310	1.2 x 10⁹	> 128	> 128
Bacteroidesdistasonis	DWC 0308	1.7 x 10⁹	> 128	> 128
perfringens梭状芽胞杆菌	DWC 2246	3.0 x 10⁸	> 128	> 128
艰难梭状芽胞杆菌	DWC 2178	2.7 x 10⁸	> 128	> 128
粪肠球菌	DWC 1706	3.4 x 10⁸	> 128	> 128
粪肠球菌	DWC 1687	3.9 x 10⁸	> 128	> 128

表7所示。最小抑菌浓度(MIC，µG /ml)。

名字的细菌	应变的名字	的浓度原始汤 (cfu /毫升)	稀释 100倍	稀释 10000倍
肠炎沙门氏菌	DWC 2224	6.9 x 10⁸	> 128	> 128
菲尔绍沙门氏菌	DWC 2223	8.2 x 10⁸	> 128	> 128
志贺氏杆菌 sonnei	DWC 2216	3.5 x 10⁸	> 128	> 128
Shigelladysenteriae	DWC 2201	2.9 x 10⁸	> 128	> 128
空肠弯曲杆菌	DWC 2030	3.7 x 10⁸	> 128	> 128
弯曲杆菌杆菌	DWC 2032	> 5.0 x 10⁸	> 128	> 128

讨论

对3天剂量前粪便样本和3天剂量后粪便样本16S rDNA拷贝数的平均值进行定量。相对较短的翻倍的基础上在人类肠道细菌(例如,金黄色葡萄球菌(16)60分钟),我们推断,三天是一个合适的时间长度测量意味着副本数量的16 s rDNA为了估计数字在肠道内的细菌。事实上，如表1所示，16S rDNA拷贝数的时间历程在每个3-期间没有显著变化日采样周期。因此，我们得出结论，在WC给药前和给药后三天的粪便采样时间足以估计肠道内的细菌数量。

常用抗生素的MIC为0.1 ~ 10µg/ml[17,18]。本实验检测的细菌WC的mic均大于128µg/ml(表6、7)。此外，口服WC可立即从上消化道[12]吸收。这说明在肠道菌群分布较多的下消化道，如回肠下段和结肠，以普通治疗剂量口服WC的浓度不会超过128µg/ml。因此，我们推测WC的止泻作用不是由于其假定的抗菌作用，而主要是由于其通过氯离子通道抑制肠道运动和肠液分泌的作用[3-8]。此外，口服WC没有明显的抗菌作用，提示其不会干扰人体肠道菌群。

相互竞争的利益

我们宣布没有竞争利益。

参考文献

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编辑信息

主编

伊凡痛风
伦敦大学学院
里卡多·h·阿尔瓦雷斯
美国癌症治疗中心

文章类型

研究文章

出版的历史

收稿日期:2018年2月5日
录用日期:2018年2月21日
发布日期:2018年2月24日

版权

引用

Ogata N, Miura T(2017)口服木杂酚油对人体肠道菌群没有杀菌活性。IntegrMol Med 4: DOI: 10.15761/IMM.1000321

相应的作者

绪方正雄，医学博士

日本京都619-0237，太子制药有限公司研发中心，邮编:81-774-98-2716;传真:81-774-98-2737