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摘要

由于老化或环境因素，骨量可能会发生变化。了解表观遗传因素（如DNA甲基化）对骨代谢的调节对于进一步了解骨生物学和促进骨质疏松症的预防至关重要。到目前为止，已经报道了一项关于骨密度的表观基因组广泛关联研究（EWAS），而我们对骨生物学表观遗传学机制的认识是严格限制的。在这里，我们基于CD3的细胞类型特异性全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）进行了EWAS⁺/CD4⁺T细胞和CD14⁺⁺/CD16^-收集102名日本人的单核细胞，并筛选与骨量相关的DNA甲基化特征。基于每种细胞类型的分析表明，不同的DNA甲基化特征集与骨量相关。一些DNA甲基化标记的基因在骨代谢中具有已知的细胞类型特异性作用。我们综合筛选的结果可能还包含其他新的骨相关基因座，这可以进一步了解骨代谢的表观遗传学机制。除了少数例外，本研究中确定的细胞类型特异性DNA甲基化特征没有被广泛使用的阵列所涵盖。我们基于WGBS的EWAS强调了具有广泛基因组覆盖范围的细胞类型特异性分析的重要性，特别是在发现阶段。

关键字

骨量，CD3+/CD4+T细胞，CD14+/CD16-单核细胞，表观基因组广泛关联研究，全基因组亚硫酸氢盐序列

介绍

骨骼系统是支持人类身体活动的最重要的特征。骨折严重限制了基础活动，骨量减少是骨折的主要危险因素之一。因此，防止骨量减少对维持人类日常生活至关重要。骨形成的遗传机制已经得到了很好的研究，迄今为止，通过全基因组关联研究(genome-wide association studies, GWASs)已经报道了各种遗传标记与骨量和骨密度相关[1-3]。然而，由于年龄、钙和维生素D摄入量、体重、体力活动等后侧因素的影响，骨量和密度会暂时下降[4-8]。因此，一项关注表观遗传特征(如DNA甲基化)的关联研究应该为影响骨形成和稳态的后继表观遗传机制提供新的认识。表观遗传特征可能会随着生活方式和/或衰老而改变。

DNA甲基化(DNA methylation, DNAm)是一种可调节基因转录的DNA生化变化。与核苷酸序列不同，DNAm模式取决于环境因素[9]。因此，通过对DNAm模式的分析，我们可以推断环境因素对基因表达及后续表型的影响。

迄今为止，只有一项关于骨密度的表观遗传广泛关联研究（EWAS）发表。在这项研究中，作者使用了一个珠阵列（HM450，Illumina Infinium Humanmethylization 450 BeadArray），并确定了一个与骨密度相关的DNAm信号[10]。在基于阵列的实验系统中，目标CpG位点的数量是有限的，并且增加了忽略潜在重要CpG位点的可能性。HM450是人类EWA应用最广泛的平台，包括约480000个探针，仅覆盖人类基因组中2800万个CpG位点的1.7%（GRCh37）[11]。Illumina Infinium甲基化EPIC BeadChip是一个新设计的基于微阵列的平台，但仍然只覆盖所有人类基因组CpG位点的3.0%[12]。亚硫酸氢盐还原代表性测序（RRBS）覆盖了基因组中10%的CpG位点[13]，而甲基捕获测序，例如SureSelect Human methyl Seq（安捷伦科技公司），旨在捕获480万个靶区±200 kbp范围内的CpG位点，覆盖了基因组中17.1%的CpG位点[14]。甲基化胞嘧啶富集方法，如甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIP-Seq）和甲基化DNA结合域测序（MBD-Seq），可以覆盖人类基因组中约50%的CpG位点[13]。然而，MeDIP-Seq和MBD-Seq测量甲基化DNA的相对富集度，在定量DNA甲基化水平方面不太准确[15]，并且它们的DNAm定量缺乏单核苷酸分辨率[16]。同时，全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）可以通过单核苷酸分辨率覆盖人类基因组中约95%的CpG位点[17]。

Morris进行骨密度测定等．[10]使用全血样本。然而，他们强调需要进行细胞类型特定的研究，因为不同的血细胞类型可能在骨生物学中有不同的作用。例如，骨细胞活性由影响骨代谢的淋巴细胞或巨噬细胞产生的细胞因子调节(骨免疫调节)[18,19]。此外，破骨细胞从单核细胞分化而来，这意味着单核细胞与骨细胞有直接关系[20,21]。因此，与骨代谢相关的细胞类型特异性信号可以通过分析全血样本中的异质细胞混合物来减弱。

在这里，为了增加我们对骨生物学和表观遗传学在骨代谢中的作用的理解，我们使用基于wgbs的EWAS在CD3中筛选与骨量相关的DNAm标记⁺/CD4⁺T细胞和CD14⁺⁺/CD16^-从102名日本受试者中分离出单核细胞。

材料和方法

主题

在这项研究中，109名明显健康的受试者被纳入。参与者是Tohoku Medical Megabank社区队列研究(TMM CommCohort Study)的一部分。研究对象的人口学特征如表1所示。所有109名受试者都是日本岩手县的居民，并在岩手县八叶叶镇的八叶叶中心招募。招聘过程的细节之前已经报道过[22]。所有参与者都提供了书面知情同意书，该研究获得了岩手医科大学伦理委员会的批准(批准号:HG H25-19)。

骨量测量

双能X射线吸收仪（DXA）通常用于骨量测量[23]。然而，TMM COMMCOMQUOTE研究使用超声波设备Benus evo超声波骨密度计（日本东京日本Kohden公司）对跟骨进行定量超声测量（QUS），以评估骨量，因为该设备具有可运输的尺寸，并且避免使用电离辐射。Benus测量的小梁骨面积比与DXA法测量的骨密度显著正相关(R^2.= 0.351,P< 0.001) [24]. 因此，在本研究中，骨面积比用于表示骨量。对于109名受试者，按照制造商的说明，在Yahaba中心使用相同的超声波设备测量小梁骨量。

样品制备和DNA甲基化分析

样品制备和DNAm分析的详细方法之前由Hachiya描述等．[25]．简而言之，为分离外周血单个核细胞，每个参与者全血8 ml, CD3⁺/CD4⁺T细胞(CD4T)和CD14⁺⁺/CD16^-进一步分离单核细胞。从每个细胞类型中提取的基因组DNA经过亚硫酸氢盐转换和文库制备，然后是WGBS。去除适配器后，将序列reads(长度≥20 bp)映射到GRCh37d5参考基因组上。对端读取之间的重叠被剪掉了。然后，每个CpG位点的DNAm水平用包含未转化胞嘧啶的mapping reads的数量除以总mapping reads的数量来估计。数据集中排除了深度极深(< 6或> 300)或受试者丢失数据频率高(呼叫率< 50%)的CpG位点。

表观基因组广泛关联分析

我们根据DNAm谱进行了六项表观基因组广泛关联分析，分别为：（1）所有受试者的CD4T，（2）女性的CD4T，（3）男性的CD4T，（4）所有受试者的单核细胞，（5）女性的单核细胞和（6）男性的单核细胞。使用线性回归（LM）模型测试每个~2400万个CpG位点的DNAm水平与骨量之间的关系。性染色体和线粒体上的CpG位点被排除在分析之外。使用R版本3.2.0的LM函数进行LM，指定骨量为因变量，DNAm水平、年龄和BMI为解释变量。分析（1）和（4）进一步按性别调整。根据基因组膨胀因子（λ）和分位数-分位数图（QQ图）对每个分析进行评估。在这项研究中，一个不太严格的阈值P值=1.0×10^－７的发现标准，应用[26]。

后果

所有109名受试者的骨量（%）平均值和标准偏差（SD）分别为28.94和4.51（表1）。与男性相比，女性的平均骨量值较低，sd较大（表1）（F检验）P值=0.032，Wilcoxon秩和检验P值=0.009）。女性的骨量随着雌激素水平的变化而大幅波动，尤其是在绝经早期[27,28]，这可以解释观察到的骨量性别差异。这些结果表明，研究对象的骨量存在性别特异性机制，并强调需要进行性别特异性分析，以探索骨代谢的表观遗传调节。

表1。研究队列的描述

	CD4T	单核细胞
N%（女性）	102 (52.90)	102 (53.90)
骨面积比(%)(平均值±SD)	28.94 ± 4.59	28.99±4.58
年龄（年）（平均值±标准差）	59.01 ± 11.30	59.50±10.87
分析的CpG站点数量	24,036,660	23,940,752

109名受试者中，102名和102名分别用于分析CD4T和单核细胞，95名受试者重叠。标准差，CD4T:CD3⁺/CD4⁺T细胞。

从109名受试者中，分别从102名和102名受试者（表1）中获得了CD4T和单核细胞的DNAm图谱，95名受试者重叠。对于CD4T，分析了24036660个CpG位点，分析了23940752个单核细胞位点。结果P基于不同数据集的各分析值以曼哈顿图和QQ图表示（图1和补充图S1）。每次分析的基因组膨胀因子接近1，表明在分析中混杂因子得到了很好的控制（补充图S1）。

图1所示。基于不同细胞类型和数据集的每个关联分析的曼哈顿图。红线表示P值=1.0×10^－７. CD4T:CD3⁺/CD4⁺T细胞。

中央人民政府网站P低于阈值1.0×10的值^－７表2和表3列出了每项分析的内容。在基于CD4T的两性分析中，仅女性和仅男性的CpG位点分别为18、4和9个P值< 1.0 × 10^－７分别地基于两性、仅女性和男性单核细胞的分析仅确定了18、22和7个CpG位点P值< 1.0 × 10^－７,分别。

桌子2.与骨量相关的CpG位点(P< 1.0 × 10^－７)在CD3中识别⁺/CD4⁺T细胞

数据集	位置＊1	DNAm水平（平均值±标准偏差）	系数（95%CI）	P价值	基因
两性	12:100925094	75.80±29.19	-3.90 (-5.07 - -2.73)	2.15×9	NR1H4
	16:69898597	97.71 ± 5.11	-0.71 (-0.93 – -0.50)	2.85 × 10-9	WWP2＊2
	20:2119971	97.59 ± 2.92	-0.38 (-0.50 -0.26)	1.22×可达	STK35
	22:49949200	95.19 ± 5.08	-0.64 (-0.85 – -0.43)	1.69 × 10-8	RP1-29C18.10/C22orf34
	9:34115355	94.55 ± 6.92	-0.89 (-1.17 – -0.60)	1.73 × 10-8	DCAF12
	1:78131263	98.89 ± 3.26	-0.46 (-0.61 – -0.32)	1.79 × 10-8	ZZZ3
	3:54141925	97.46±7.70	-1.14 (-1.50 – -0.79)	2.21 × 10-8
	11:10061108	97.46 ± 4.62	-0.56 (-0.74 – -0.38)	2.61×可达	SBF2＊3
	1:246227233	97.04±3.09	-0.39 (-0.52 - -0.27)	2.62 × 10-8	SMYD3
	17:980028	98.17±2.88	-0.36 (-0.48 – -0.24)	3.09 × 10-8	上
	13:98739376	92.83 ± 9.98	-1.22 (-1.63 – -0.81)	4.52 × 10-8	FARP1
	22:49831298	92.28 ± 4.83	-0.60 (-0.80 -0.40)	4.74 × 10-8	C22orf34
	22:49967265	93.68 ± 6.72	-0.83 (-1.11 – -0.55)	4.90 × 10-8	RP1-29C18.9 /C22orf34
	1:145549040	1.07±2.81	0.35 (0.23 - 0.46)	4.99 × 10-8	ANKRD35
	11:609352	96.70 ± 6.47	-0.80 (-1.07 – -0.53)	6.28×可达	PHRF1
	5:176738773	0.47 ± 1.07	0.13 (0.09 - 0.18)	7.26 × 10-8	MXD3
	3:121842023	96.57±3.27	-0.40 (-0.54 -0.27)	7.56 × 10-8	CD86＊3
	2:226290206	95.65 ± 6.08	-0.75 (-1.01 – -0.49)	9.82 × 10-8	NYAP2
女的	1:21478594	95.61±7.46	-1.38 (-1.78 – -0.98)	1.18×可达	EIF4G3
	19:10127122	98.74±2.59	-0.46 (-0.60 – -0.32)	1.80 × 10-8	RDH8
	5:77319949	98.40 ± 4.02	-0.68 (-0.89 -0.48)	2.15×可达	AP3B1
	4:68576716	99.05±2.77	-0.49 (-0.64 -0.33)	6.60 × 10-8	UBA6-AS1
男性的	3:197772225	96.91 ± 3.43	-0.70 (-0.86 – -0.53)	9.36×10 - 11	LMLN
	5:99290935	96.48±2.76	-0.50 (-0.64 -0.35)	9.22 × 10-9	ctd - 2160 d9.1
	5:26240956	97.78 ± 3.46	-0.63 (-0.82 – -0.44)	2.59 × 10-8	RP11-351N6.1
	2:184159598	95.89±3.58	-0.65 (-0.84 – -0.45)	3.80 × 10-8	LIN28AP1
	19:8455454	0.61±1.52	0.27 (0.19 – 0.36)	4.92×可达	RAB11B/ RAB11B-AS1
	9:126673994	96.62 ± 5.29	-0.99 (-1.29 -0.68)	5.63×可达	DENND1A
	8:38854608	0.45 ± 1.40	0.25 (0.17 – 0.33)	6.76 × 10-8	ADAM9＊3
	12:69611102	94.12 ± 5.56	-0.98 (-1.29 – -0.67)	8.77 × 10-8	rp11 - 324 p9.1
	2:110449774	84.72±9.25	-1.66 (-2.19 – -1.13)	9.34×可达	BMS1P19

*1 CpG位点的染色体数目和位置。

*2在骨发育和/或体内平衡中具有明显作用的基因。

*3在骨发育和/或体内平衡中具有建议功能或与之相关的基因。

DNAm：DNA甲基化，SD：标准偏差，CI：置信区间。

桌子3.与骨量相关的CpG位点(P< 1.0 × 10^－７)在单核细胞中鉴定

数据集	位置* 1	DNAm水平（平均值±标准偏差）	系数 (95%置信区间)	P价值	基因
两性	2:61108446	0.29 ± 1.38	0.21 (0.15 - 0.26)	2.91×10 - 11	AC010733.4
	22:47133916	0.84±2.80	0.40 (0.28 – 0.51)	3.73 × 10-10	塞克
	2:121815071	96.54±4.01	-0.56 (-0.72 -0.39)	5.95 × 10-10	Y RNA
	3:188489102	98.19 ± 3.52	-0.46 (-0.60 – -0.32)	3.02 × 10-9	LPP
	8:8750676	1.11±1.71	0.22 (0.15 – 0.30)	7.51 × 10-9	MFHAS1
	14:36295936	0.51 ± 1.43	0.19 (0.13 – 0.25)	1.30 × 10-8	rp11 - 317 n8.5 /BRMS1L
	2:195259677	85.29 ± 14.8	-2.22 (-2.89 - -1.55)	2.02 × 10-8	AC018799.1
	2:69941555	97.83±3.04	-0.39 (-0.52 -0.26)	2.66 × 10-8	ANXA4
	3:173900045	85.08 ± 18.96	-2.76 (-3.64 -1.89)	2.95 × 10-8	NLGN1
	2:190657692	96.39±3.84	-0.48 (-0.64 -0.32)	4.33 × 10-8	PMS1
	12:56474020	0.25±1.11	0.14 (0.09 – 0.18)	6.30×可达	ERBB3＊3
	17:1535968	92.9±13.44	-1.63 (-2.19 – -1.08)	6.43 × 10-8	SCARF1
	4:99080231	92.82±9.63	-1.41 (-1.86 -0.95)	6.45×可达	Y RNA
	8:21530651	94.44 ± 12.01	-1.60 (-2.13 – -1.07)	6.62 × 10-8	GFRA2
	2:240322590	0.50±1.79	0.22 (0.15 – 0.30)	6.72×可达	HDAC4＊3
	12:129772248	90.49 ± 7.00	-0.85 (-1.14 – -0.56)	8.41 × 10-8	TMEM132D
	3:16191417	96.63 ± 7.87	- 1.50 (-1.34 -0.66)	9.09×可达	GALNT15
	14:39639583	1.60 ± 2.61	0.32 (0.21 - 0.43)	9.11 × 10-8	TRAPPC6B
女的	6:35995637	0.37 ± 1.07	0.21 (0.16 – 0.25)	2.44× 10-11	MAPK14＊2
	18:59560980	0.51 ± 1.48	0.27 (0.20 – 0.35)	1.87 × 10-9	RNF152
	6:163371471	94.89 ± 8.66	-2.42 (-2.96 - -1.87)	2.54 × 10-9	PACRG
	21:17220599	97.23±4.77	-0.89 (-1.14 – -0.63)	5.16 × 10-9	美国药典25
	10:60936039	6.68±5.35	0.98 (0.70 - 1.26)	6.22×9	PHYHIPL
	11:497792	96.88 ± 4.27	-0.78 (-1.01 -0.56)	9.53 × 10-9	RNH1＊3
	4:81105396	0.52±1.96	0.35 (0.25 – 0.45)	1.84 × 10-8	rp11 - 377 g16.2 /PRDM8
	5:65423122	84.35±21.30	-3.75 (-4.89 – -2.60)	3.07×可达	SREK1
	4:76766071	97.61 ± 3.13	-0.55 (-0.72 – -0.38)	3.34 × 10-8	rp11 - 556 n4.1
	16:56225078	0.77 ± 2.84	0.50 (0.36 – 0.65)	3.68 × 10-8	RP11-461O7.1
	20:13765582	0.34 ± 1.48	0.26 (0.18 – 0.34)	3.78 × 10-8	NDUFAF5
	1:201449877	0.23 ± 0.96	0.17 (0.12 - 0.22)	3.86 × 10-8	CSRP1
	11:124035292	98.58±3.03	-0.53 (-0.70 - -0.37)	4.21×可达	OR10D1P
	16:15188395 (cg16603896)	0.96 ± 3.22	0.54 (0.37 – 0.71)	4.60×可达	RP11-72I8.1/PDXDC1
	2:24660027	92.65 ± 8.78	-1.53 (-2.00 – -1.06)	4.83 × 10-8	NCOA1
	5:64919917	0.23 ± 0.96	0.16 (0.11 – 0.21)	6.02 × 10-8	修剪23
	6:36954391	0.47±1.62	0.29 (0.20 – 0.39)	6.79 × 10-8	MTCH1
	7:29157080	98.58 ± 3.53	-0.61 (-0.81 -0.42)	7.31 × 10-8	CPVL
	2:10338969	97.26 ± 3.76	-0.64 (-0.85 – -0.44)	8.54×可达	C2orf48
	4:4377945	95.56±3.49	-0.61 (-0.80 – -0.41)	8.58 × 10-8	NSG1
	1:23857808	0.97 ± 3.41	0.72 (0.50 - 0.93)	9.08 × 10-8	E2F2
	2:230125683	84.64±9.88	-1.72 (-2.27 – -1.17)	9.61×可达	PID1
男性的	10:60540166	87.39±10.86	-2.06 (-2.64 – -1.48)	6.42 × 10-9	BICC1＊2
	1:3463645	93.37±4.07	-0.75 (-0.96 -0.54)	6.84 × 10-9	MEGF6
	19:47039387	98.04 ± 4.18	-0.84 (-1.08 – -0.59)	3.90 × 10-8	PPP5D1
	2:172721808	91.63±11.99	-2.36 (-3.07 – -1.65)	4.68×可达	SLC25A12
	12:6588863	96.45 ± 3.77	-0.66 (-0.86 – -0.46)	5.54 × 10-8	一国- 102 e24.6
	20:50007014	96.99 ± 4.16	-0.73 (-0.96 – -0.50)	7.50 × 10-8	NFATC2＊3
	14:93054727	92.29 ± 19.21	-3.50 (-4.60 - -2.40)	8.00×可达	RIN3＊3

*1染色体数目和CpG位点的位置。

*2在骨发育和/或体内平衡中具有明显作用的基因。

*3在骨骼发育和/或体内平衡中具有功能或与之相关的基因。DNAm: DNA甲基化，SD:标准偏差

讨论

我们通过基于WGBS的EWAS筛选与骨量相关的CpG信号。结果，在细胞类型和性别特异性分析中鉴定出不同的CpG特征集。位于CpG位点附近（在±1 Mbp范围内）的基因P值< 1.0 × 10^－７如表2和表3所示。其中，WWP2,BICC1,MAPK14，具有与骨发育或体内平衡相关的生物学功能。WWP2编码E3连接酶NEDD4家族的一个成员，在蛋白质泛素化中发挥作用。事实上，软骨细胞中WWP2蛋白对goosecoid的单泛素化可调节颅面骨骼图案[29]。此外，对Wwp2小鼠间充质干细胞等. [30]表明WWP2通过RUNX2泛素化作为成骨细胞分化早期所需的成骨的积极调节因子。因此，抑制基因的转录WWP2可能是导致骨量降低的原因，也可能解释了骨量与骨密度之间的负相关关系WWP2CD4T的DNAm水平。

BICC1是编码rna结合蛋白的基因。小鼠的敲除实验和人体骨密度的GWAS实验表明Bicc1/Bicc1在成骨形成中起重要作用，并影响骨密度[31]。简言之，BICC1积极调节成骨细胞的生成，并抑制BICC1表达导致骨密度降低。在老鼠和人类中，两者之间的联系Bicc1/BICC1男性受试者的骨密度也得到了证实。一致地，观察到男性受试者与男性受试者之间存在显著的相关性BICC1本研究中男性受试者单核细胞中DNAm与骨量的关系BICC1骨量意味着该部位的甲基化程度降低BICC1表达，导致男性受试者骨量降低。在所有血细胞类型中，只有血浆和单核细胞表达BICC1 (GeneCards数据库，http://www.genecards.org;2017年7月1日通过)，这可以解释为什么aBICC1在本研究中，DNAm标记来自单核细胞，而非CD4T细胞。

丝裂原活化蛋白激酶14 (p38α)MAPK14，具有骨吸收功能。破骨细胞分化所必需的基因表达，如SP7,ALPL,BGLAP，受p38α[32]调控。使用特定的p38α激酶抑制剂，破骨细胞分化被抑制。此外，提示破骨细胞成熟所需的小眼相关转录因子的磷酸化是由磷酸化的p38α[33]刺激的。由于破骨细胞的功能是骨吸收，刺激破骨细胞的形成可导致过量的骨丢失。p38α通过激活破骨细胞和破骨细胞功能负向影响成骨，这可能解释了骨质量与CpG DNAm水平之间的负相关MAPK14. 这种关联仅从基于女性单核细胞的分析中观察到。这与破骨细胞来源于单核细胞[20,21]的事实一致，并且p38α途径是绝经后妇女骨质疏松症的重要调节因子，并由雌激素缺乏引起[28]。

表2中列出的其他基因被认为在骨代谢中起作用，或通过GWAS与骨密度相关(ERBB3, [34];SBF2[35];RNH1, [36];NFATC2[37];RIN3, [38];ADAM9[39];HDAC4[40];和CD86, [41]).

此外，上述以外的基因可能在骨代谢中具有未报告的功能，包括骨生成和破骨细胞生成。例如，NR1H4，也被称为法氏蛋白X受体(FXRα)，是配体依赖转录因子核受体超家族的成员。CpG位点chr12:100925094，其DNAm水平与骨量显著相关，位于NR1H4. 该受体是糖异生途径的激活剂，也是糖皮质激素受体表达和活性的已知调节器[42]。糖皮质激素通过抑制成骨细胞的分化和复制，并通过抑制成熟成骨细胞的功能，对骨形成和体内平衡产生有害影响[43]。此外，糖皮质激素可诱导成骨细胞凋亡增加，糖皮质激素可降低骨细胞的功能[43]。由于其抗炎和免疫抑制特性，糖皮质激素已被广泛用作治疗剂，即使糖皮质激素治疗可导致患者骨质流失和骨折。骨量与骨髓DNAm水平呈负相关NR1H4在本研究中观察到的CpG暗示DNAm抑制基因的转录或功能NR1H4，导致骨质流失。

先前的骨密度EWA报告了8个CpG位点作为个体队列中的提示性DNAm信号，但未发现研究队列中常见的任何DNAm信号[10]。在这项研究中，这八个先前报道的CpG位点与骨量无显著相关性(P大于0.130的值（补充表S1）然而，我们分析了日本个体，将QUS测量的跟骨骨面积比作为骨量，并使用纯化的CD4T和单核细胞测量DNAm水平。这两项研究中使用的不同材料和方法可能是导致不同结果的原因。因此，我们的结果并不否认可能的关系Morris提出的CpG位点的骨密度和DNAm水平之间的关系等. [10].

我们注意到，参与本研究的受试者人数约为100人，并且采用QUS测量的跟骨小梁骨面积比作为表型变量。因此，我们的研究基于有限的数据。此外，关联分析是基于单个日本队列以及DNAm水平与年龄之间的关联进行的骨量没有在任何其他独立队列中得到验证。因此，本研究中报告的相关性仍有待其他研究证实。

尽管存在上述局限性，本研究中应用的全基因组DNAm分析可能为DNAm在骨代谢中的作用提供新的见解。在目前的EWA中确定的78个DNAm特征中，只有一个CpG位点[chr16:15188395（cg16603896）；表3]是人类DNA甲基化研究最常用的平台HM450的目标。此外，在这项研究中，有几个CpG位点被鉴定为DNAm标记，具有较小的特异性P数值，而签名周围的相邻CpG位点未显示DNAm水平和骨量之间的这种关联（补充图S2）。这一结果意味着，如果没有高基因组覆盖率，DNAm关联研究可能忽略了大量潜在的DNAm信号。因此，本研究强调了基于WGBS的分析在最高基因组覆盖率下的重要性，特别是对于需要全面筛查且基因组区域遗漏很少的发现阶段。

本研究的目的是利用基因组覆盖范围最广的细胞类型特异性分析筛选与骨量相关的DNA甲基化特征。我们已经成功地进行了分析，并提交了候选DNAm签名。EWAS和更大规模的队列集中于本研究中确定的特定区域，将进一步阐明表观遗传机制在骨生物学中的作用。

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作者对东北医疗超级银行项目的参与者表示赞赏。我们要感谢岩手医科大学(IMM)和东北大学(ToMMo)的成员们的鼓励和支持。我们非常感谢小野嘉娜子女士对样品加工和处理的帮助。

资金信息

• 重建机构，教育、文化、体育、科学技术部(MEXT)
• 日本医学研究开发机构

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