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摘要

Objetives:描述和比较一个典型的口腔扁平苔藓患者和健康对照者的组织、血清和唾液的蛋白谱。

方法:我们首先分析了一例典型的口腔扁平苔藓患者组织样本的组织学特征。使用二维（2-D）电泳分析从口腔粘膜组织、血清和唾液获得的蛋白质图谱，并进一步与从健康对照获得的类似样本进行比较。

结果:(2-D)蛋白图谱由病理组织228个斑点、病理唾液206个斑点和病理血清216个斑点组成。我们在口腔扁平苔藓样本中观察到与正常样本相比的几种差异表达蛋白。在这些蛋白中，通过质谱鉴定了纤维蛋白原前体和唾液淀粉酶。

结论:与健康样本相比，我们在口腔扁平苔藓中检测到几种差异表达蛋白。尽管这项研究只是将单个患者与健康对照组的唾液和血清样本进行了比较，但它代表了在这种环境下以及可能在任何疾病中发现生物标志物的未来。最后，未来还需要进行更多的实验，识别其他差异表达蛋白，以检测该疾病的生物标志物。

关键字

扁平苔藓，唾液，血清，质谱分析，蛋白质组学

介绍

口腔扁平苔藓(Oral planus, OLP)是口腔黏膜较为常见的一种慢性炎症性疾病，是一种自身免疫性疾病[1-2]。它可以表现为孤立形式或伴有皮肤扁平苔藓[3]。生殖器粘膜表面、头皮和指甲也会受到影响。OLP往往是慢性的，复发的，很难治疗。

该病通常发生在生命的第四个十年，并且通常以4:1的比率影响女性。它可能存在于大约0.5-2%的世界人口中，并持续20年以上而没有自发缓解[5]。临床变异包括:网状、丘疹、斑块、糜烂、萎缩和起泡亚型[6]。严重的发病率与侵蚀型[3]有关。

虽然详细的病因学和生理病理仍不清楚，但已提示OLP中的炎症反应是由T-helper 1 (Th1)淋巴细胞[1]的积累和扩张所介导的。一些证据表明，复杂的细胞因子网络在OLP的恶化和延续中发挥了重要作用[1,7]。

最初的事件是基底角质形成细胞向CD4表达抗原特异性⁺淋巴细胞，由于内皮细胞中细胞因子介导的粘附分子的调节，淋巴细胞被基膜吸引。巨噬细胞、朗格汉斯细胞、淋巴细胞和表面角质形成细胞负责调节TNF-α、IFN-γ和IL-1。此外，肥大细胞脱颗粒释放促炎介质，如TNF-α、糜酶和胰蛋白酶。凝乳酶是一种肥大细胞蛋白酶，可激活MMP-9，进一步破坏基底膜。在OLP中，这些机制可能联合导致t细胞在固有层浅层积聚、基底膜破坏、上皮内t细胞迁移和角质形成细胞凋亡。因此，[8]建立了一个与慢性炎症性疾病相关的恶性循环。

另一方面，蛋白质组学，最广义的定义是蛋白质组学的研究:在特定条件[9]下，从基因组中表达的所有蛋白质的集合，包括所有的同型、多态性和翻译后修饰。双向电泳(2DE)结合质谱(MS)已被广泛用于分析蛋白谱、鉴别差异表达蛋白、发现早期诊断、预后和预测治疗结果的癌症生物标志物。然而，尽管蛋白质组学在癌症研究中有多种应用，但对口腔扁平苔藓的研究却没有类似的报道。

至今，与OLP相关的科学知识仍集中在其病理描述和免疫反应上。然而，关于OLP蛋白谱的信息很少，包括其他样本如血清，以及来自OLP患者的完整未刺激唾液蛋白谱。

本研究的目的是描述OLP的典型的临床病例,分析病理组织的蛋白质组表达谱,以及整个如果OLP患者的唾液和血清最后,比较这些蛋白质概况与从控制样本,以获得建议OLP的可能生物标志物。

病例报告

一位69岁的女性患者表现为双侧舌、颊粘膜、口底和牙龈的多发性口腔内病变，临床演变为三个月（图1）。根据临床分类[5]，以及世界卫生组织对OLP的定义，观察到网状和斑块亚型与红斑/溃疡亚型交替出现（图1）。与低痛症状有关。个人病理史显示：6岁时患有乙型肝炎。然而，乙肝血清学检测在51岁时进行，结果为阴性。自1997年以来，OLP被诊断为有三到四个缓解期和加重期。该患者在62岁时发生心肌梗死，接受冠状动脉支架植入术和乙酰水杨酸治疗，在活检前一周暂停治疗。阿托伐他汀钙治疗高胆固醇血症。在出现胃食管反流病（GERD）症状的四个月前，用氯硝西泮和阿普唑仑治疗由情绪问题引起的失眠。

图1．一例口腔扁平苔藓患者的口腔表现。A)舌的右外侧缘。诊断为斑块亚型与溃疡亚型交替。B)右侧颊粘膜，临床可见红斑/溃疡亚型。C)左侧颊黏膜，观察斑块亚型。

患者出现了OLP病变的加重和缓解期(图2)。在使用氟茚奈德、曲安奈德、泼尼松龙和他克莫司治疗后，对患者进行了3年的临床监测。

图2。随访3年OLP患者的临床表现。A)舌的右外侧缘。B)右侧颊黏膜缓解期，无症状期。

材料和方法

样品

在一家私人牙科诊所观察到疑似OLP的患者病变。随后，患者转至医院颌面外科Juárez de México。行两次切口活组织检查，一次为右侧舌外侧网状组织，另一次为右侧颊粘膜糜烂组织。

在蛋白质组学方面，使用了该OLP患者和4例对照病例。同时，活检前将唾液和血清样本置于标本缓冲液中。

本研究是在《关于医疗规程和伦理的赫尔辛基宣言》之后进行的，研究和伦理机构委员会批准了该研究(注册编号为第2号)。HJM 1996/11.03.08)。

样品制备

组织标本(包括病理组织和对照组织)在活检过程中从患者中提取。然后用生理溶液清洗，在液氮中冷冻，在-70℃下保存^oC直到使用。手术前从患者和健康对照组采集未受刺激的唾液和血液样本。使用0.22µm圆盘尼龙注射器和完整的蛋白酶抑制剂混合物过滤唾液样本™ （德国罗氏）加入，冷冻，并储存在-20^°直到使用C。

组织病理学

为了分析样品的形态，将其固定在10%的缓冲甲醛中，切片，安装在显微镜载玻片上，用苏木精和伊红[11]染色，并用光学显微镜(尼康H550 L，横滨，日本)检查。随后，两名合格的口腔和颌面病理学家(Universidad Tecnológica de México，墨西哥)对至少5个高强度领域的样本进行了审查。最后根据世界卫生组织[12]的组织病理学分类选择切片。

蛋白质的提取

从组织中提取蛋白，样品在生理溶液中漂洗，在液氮中冷冻，机械粉碎并悬浮在样品缓冲液(7 M尿素，2 M硫脲，4% CHAPS, 2% IPG缓冲液，40 mM DTT)中[200 mg组织/mL]，其中包含完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒™(罗氏，德国)。然后，用超声波对样品进行干扰。2万xg 4ºC离心5分钟，去除不溶性物质，保存上清。此外，用丙酮- tca和2D cleanup Kit (Amersham Biosciences, USA)沉淀蛋白质。沉淀物在添加2 mM DTT的复水化液(7 M尿素、2 M硫脲、2% CHAPS、0.5% IPG缓冲液和0.1%溴酚蓝)中溶解。根据制造商的建议，使用2D Quant Kit (Amersham Biosciences, USA)测量蛋白浓度。

血清样本

血清通过血液离心(2500 xg, 4°C, 5分钟)获得。然后，在含有完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒的样品缓冲液中加入100 mg血清/mL。2万xg 4℃离心5 min，去除不溶性物质，保存上清。此外，用丙酮-三羧酸沉淀蛋白质两次。然后加入血清样品[100 mg/mL]和600µL甲醇混合，再加入150 mL氯仿混合，最后加入450µL milliq水混合。离心去除不溶性物质(4ºC, 20000 xg, 5分钟)，保留相间白色盘。加入450µL甲醇混合，4℃20000 xg离心5 min，与Vortex混合，4℃20000 xg离心5 min。最后，在添加2 mM DTT的复水化液(7 M尿素、2 M硫脲、2% CHAPS、0.5% IPG缓冲液和0.1%溴酚蓝)中稀释沉淀。根据制造商的建议，使用2D Quant Kit (Amersham Biosciences, USA)测量蛋白浓度。

唾液样本

每个唾液样品[100mg唾液/mL]加600µL甲醇混合，再加150µL氯仿混合，最后加450ml milliq水混合。2万xg 4ºC离心5分钟去除不溶物，保留相间白色盘。加入450µL甲醇混合，4℃20000 xg离心5 min，混合后4℃20000 xg离心5 min。最后，在添加2 mM DTT的复水化液(7 M尿素、2 M硫脲、2% CHAPS、0.5% IPG缓冲液和0.1%溴酚蓝)中稀释沉淀。根据制造商的建议，使用2D Quant Kit (Amersham Biosciences, USA)测量蛋白浓度。

一维电泳(1-DE)

将35 μg蛋白用考马斯蓝[15]染色，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE 10%)分离，以验证蛋白的质量。

二维电泳(2 de)

为了获得病理样本的蛋白质图谱，同时分析其与对照组的差异表达，我们对宽范围两性电解质pH值3–10进行了2-DE。通过胶体考马斯蓝G-250染色进一步观察轮廓。为了最大限度地减少分析（凝胶）变化，为每个样品制作了二维凝胶。

该方案适用于组织、唾液和血清样本。蛋白提取液(160µg)悬浮在复水溶液(125 μL)中，室温下将pH 3-10为7 cm (GE Healthcare Life Science)的Immobiline Drystrip gel复水18 h。在Ettan IPGphor 3等电聚焦系统(GE Healthcare, USA)中进行等电聚焦，16-20 kVh, 5 h。然后，固定化pH梯度(IPG)条在还原和烷基化2-DE平衡缓冲液(6 M尿素，75 mM Tris-HCl, pH 8.8, 29.3%甘油，2%十二烷基硫酸钠和0.1%溴酚蓝)加65 mM DTT和135 mM碘乙酰胺。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- page)采用标准垂直电泳体系，10%聚丙烯酰胺凝胶(8 cm × 8cm)在Gibco BRL V16凝胶体系中进行。用胶体考马斯蓝G-250 (Bio-Safe Coomassie Stain, Bio-Rad Laboratories, USA)对凝胶进行染色。使用扫描密度仪(image Scanner, Amersham Biosciences, USA)获得凝胶的数字图像，并使用image Master 2D Platinum软件7.0版(GE Healthcare Life Sciences, Switzerland)进行分析。

质谱分析和鉴别分析

切除病理标本中仅存在的两个点，经凝胶内胰蛋白酶重复消化，采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析。使用MASCOT程序版本2.1(可在http://www.matrixscience.com上获得)在人类基因组数据库中搜索肽质量指纹和MS/MS数据，允许1 Da的单同位素质量耐受性。在数据库搜索中使用了蛋氨酸氧化和1个缺失的胰蛋白酶裂解。

结果

OLP的病理特征

在带有棘皮上皮的舌部组织中，我们观察到增厚的网状钉，锯齿状的外观和萎缩的上皮区域。在下面的结缔组织中，可见基底下和旁旁的淋巴细胞炎性浸润带(图3A)。基底膜液化，上皮基底细胞空泡化和破坏，基底细胞凋亡，亚上皮细胞分离(图3B)。

图3。OLP患者舌部组织的病理分析。A)增生性上皮表现为棘皮病，在基底下的结缔组织中有淋巴细胞炎性浸润带(H&E, 40X)。B)基底膜液化，空泡化和基底细胞破坏(箭头)，亚上皮分离(H&E, 400X)。

在从颊粘膜获得的组织中，观察到溃疡区域(图4A)。此外，该病变显示萎缩的上皮，固有层密集的淋巴细胞炎性浸润和血管组织充血(图4B)。因此，显微检查结果证实了OLP的诊断。

图4。右旋口腔息肉患者口腔黏膜组织的病理分析。A)溃疡区(箭头)显示结缔组织(H&E, 40X)。B)上皮增生和萎缩，固有层密集的淋巴细胞炎性浸润和血管充血(H&E, 400X)。

OLP的蛋白质组学图谱

双向电泳凝胶显示唾液、血清和病理组织的蛋白谱。病理和对照样本的组织和血清显示每个组织的蛋白谱相似，超过100个蛋白点(表1)显示分子质量从>250到5kda, pI值在3到10之间。然而，在病理和健康样本中，一些蛋白点的表达一致显示出显著差异。图5、6显示了病理和对照样本的代表性DE。有趣的是，患者和对照唾液的蛋白谱差异很大(图7)。

表1。从对照和口腔扁平苔藓样品中鉴定过表达蛋白

样本	TS	作为
控制组织	169
病理组织	228
控制唾液	81
病态的唾液	206	1
控制血清	104
病理血清	216	1
TS:在2-DE凝胶中获得的总斑点。AS:采用LC-MS/MS分析斑点。

图5。OLP患者对照组织(CT)和病理组织(PT)的2DE蛋白谱。A) CT蛋白图谱。B) PT蛋白图谱。在2DE中提取分离TC和PT蛋白。胶体考马斯蓝G-250染色。在两个样本之间的差异表达的蛋白质被标记(箭头)。CT显示169个斑点(A)， OLP患者的病理组织228个斑点(B)。

图6。口腔扁平苔藓患者血清2D蛋白谱中纤维蛋白原过度表达的鉴定。A） 健康对照患者血清蛋白谱。B） 口腔扁平苔藓患者血清蛋白谱。从两个样品中提取蛋白质并在2DE中分离。凝胶用胶体考马斯蓝G-250染色。标记两个样本之间差异表达的蛋白质（箭头）。口腔扁平苔藓患者血清中持续出现显著上调的点由框架指示。C） 图中显示了由正方形和微分强度分析包围的光斑的放大率。从凝胶中切下被正方形包围的斑点，随后通过LC-MS/MS进行分析。MS/MS分析确定差异斑点为纤维蛋白原前体，氨基酸序列如图所示。LC-MS/MS鉴定的肽放大并加粗。最后，对照血清显示104个斑点（A），患者血清显示216个斑点（B）。

图7。口腔扁平苔藓患者唾液二维蛋白图谱中唾液淀粉酶过表达的鉴定。A)健康对照患者唾液蛋白谱。B)口腔扁平苔藓患者唾液蛋白谱。在2DE中提取并分离两种样品中的蛋白质。然后用胶体考马斯蓝G-250对凝胶进行染色。在两个样本之间的差异表达蛋白被标记(箭头)，其中一个点在口腔扁平苔藓患者的唾液中一致显示显著上调，用框架表示。口腔扁平苔藓患者血清中一致显示显著上调的斑点用框架表示。C)被正方形包围的光点的放大和强度差分析显示。从凝胶中切除被正方形包围的斑点，然后用LC-MS/MS进行分析。经MS/MS分析，差异位点为唾液淀粉酶，氨基酸序列显示。 The peptides identified by LC-MS/MS are enlarged and bold. Finally, the control saliva showed 81 spots (A) and the saliva from patient showed 206 spots (B).

纤维蛋白原前体和唾液淀粉酶在OLP患者样本中过度表达

从唾液和血清凝胶中，选择两个OLP样本中差异表达的点进行质谱分析(图6-7)。与对照组相比，这些斑点是在病理样本中过度表达的斑点中选择的。

在血清样本中选择的点(图6)显示moyilecweight为51 kDa, pI为5.3(图6，线方点)。谱质量分析表明,这种蛋白质点对应于“纤维蛋白原的前体(表2)。现货从整个如果唾液获得对应于唾液淀粉酶(链)(表2)。这种蛋白质点显示8.0 35 kDa,π的分子量(图7中,一方点)。

表2。口腔扁平苔藓中差异表达蛋白的鉴定

样本	NCBI没有。	的名字	理论的蛋白质 ID质量 KDa /π	分数	序列 报道	主要功能
血清	胃肠道6650830	纤维蛋白原- a链亚型前体	50103/5.7	1693	56％	纤维蛋白原参与血液凝血，被凝血酶激活形成纤维蛋白凝块。
唾液	胃肠道27065641	链A，人类唾液淀粉酶	56495/6.21	3273	37％	它在人唾液淀粉酶的底物结合和酶活性中具有移动环的作用。

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讨论

口腔扁平苔藓是一种由慢性炎症介导的自身免疫性疾病，常见于口腔黏膜[3]。OLP和T淋巴细胞介导的免疫反应的详细炎症机制尚不清楚[4,5]。

在本研究中，我们分析了一个OLP患者病理组织中表达的蛋白谱，以及该患者血清和唾液中检测到的蛋白谱。此外，我们比较了同一患者病理组织和健康组织的蛋白谱。使用健康人的唾液和血清蛋白谱进行比较。

一旦获得蛋白质谱分析，我们检测到OLP患者的病理组织、血清和唾液中与对照样本相似的模式。

然而，我们发现样本中存在不同的差异表达点（图5-7）。与癌症等许多其他疾病一样，基因和蛋白质表达发生改变，从而改变导致疾病进展或慢性疾病等的细胞和分子过程。根据我们的理解，这是第一份考虑OLP患者和健康样本的组织、血清和唾液分析的蛋白质组表达谱研究报告。

这份报告中获得的结果可能对未来的研究有用，因为完整的蛋白质谱在以前发表的科学报告中没有显示。然而，我们认为我们的结果并不是结论性的，因为在本研究中报道的病例有大量的临床和药理史。此外，更多的患者和样本复制可能有助于更好地理解OLP的蛋白质组学谱。

第一个被确定为纤维蛋白原前体的位点属于OLP患者的血清。此外，在视觉分析中也在OLP患者的病理组织和唾液中发现了这种斑点。在唾液中检测到的第二个位点是唾液淀粉酶(链A)，选择该位点是因为在该液体中有明显的专属表达。识别新的潜在的非侵袭性或最小侵袭性生物标志物是非常重要的。唾液甚至血清中可用的生物标志物可能对早期诊断、监测疾病进展或接受过最低限度培训的人员[16]有潜在的帮助。这些生物液体很容易获得，可以为系统性和口腔疾病提供有用的信息[17,18]。

未受刺激的唾液被认为是一种平衡状态，受唾液腺的影响较小[19]。

尽管之前有分析报告，直到2290个蛋白质在全唾液中发现，大约27%的全唾液蛋白在血浆[18]中发现。在我们的实验中，我们在OLP患者的唾液中发现206个斑点，在血清中发现216个斑点。该项目是为了在唾液和/或血清中识别至少一种生物标志物。获得纤维蛋白原前体作为生物标志物可能有重要的意义，因为它在所有的病理样本中都被发现。这种潜在表达的生物标志物还有待于在更多的患者中进行大规模的验证。

只有一份科学报告显示，在OLP和对照样品中，总共有31个蛋白点代表14个蛋白，其丰度至少有两倍的差异。他们认为新的生物标志物可能在OLP[20]的炎症和免疫反应中发挥作用。

纤维蛋白原γ链亚型- a前体在OLP发病机制中的确切作用可能与慢性炎症过程和口腔黏膜修复反应有关。纤维蛋白原参与血液凝血，被凝血酶激活形成纤维蛋白凝块。该蛋白在疾病生理病理中的确切意义仍有待研究。

结论

我们观察到许多差异表达的蛋白，我们相信其中一些最终可以作为血清或唾液中OLP的生物标志物。然而，目前尚不清楚这些蛋白质是由于OLP疾病产生的，还是由于患者服用的药物引起的变化。在发现表达差异的点中，纤维蛋白原是相当重要的，不仅因为它的功能，而且因为它在所有分析的病理样本中的表达。在OLP患者的病理组织和血清中纤维蛋白原过表达可以认为是正常的，因为口腔黏膜不断受到免疫和炎症的挑战，这涉及到这个分子。然而，OLP患者唾液中纤维蛋白原过度表达是一个意外的结果。唾液淀粉酶蛋白被认为在口腔中有一个正常的作用。淀粉酶蛋白在OLP患者中的过表达需要进一步验证。最后，我们认为有必要进一步分析更多的样本，评估OLP患者的差异表达蛋白谱。在OLP疾病的生物学过程中差异表达蛋白的意义以及这些蛋白作为新的特异性生物标志物的使用仍有待研究。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢Leticia Cortés-Martínez提供的技术援助和“PAPCA: FESI-DIP-PAPCA-2016-8”项目提供的支持。

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