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摘要

本研究旨在检测哈达利叶对HT-29和CF-1细胞株的抗癌活性和增殖作用。根据MTT结果，选择5倍(H5)和10倍(H10)两种稀释度进行进一步分析。采用qRT-PCR检测细胞凋亡及抗氧化途径相关基因表达水平，采用tali细胞凋亡法检测处理24h和48h后死亡细胞、凋亡细胞和活细胞比例。

结果表明，哈达利叶对肿瘤细胞有一定的杀伤作用，其作用机制是提高Bax (H5为22.45±3.1倍，H10为6.49±0.1倍)、SOD和CAT活性，从而诱导肿瘤细胞凋亡。然而，当稀释五倍时，Hardaliye也会影响轻微健康的细胞，尽管稀释十倍时没有影响。从基因表达水平来看，抗氧化酶和凋亡抑制剂在24 h后表达量增加，而H5除GpX外的抗氧化酶在48h后表达量减少。可以预见的是，随着时间的推移，哈达利叶的抗氧化物质显示出抗氧化活性。

总的来说，这是第一个考虑到哈达利叶除对健康细胞有效外还有抗癌活性的报道。在这方面，这些初步结果可以表明哈达利叶作为一种食物支持预防结肠癌的潜力。

关键字

细胞凋亡，癌症预防，细胞生物学，结直肠癌，基因表达，多酚

缩写

DR:死亡受体;Fas:脂肪酸合成酶;XIAP: X-linked inhibitor of apoptosis;BAX: bcl -2相关X蛋白;BCL-2: b细胞白血病2;Cyct c:细胞色素c;IAP:凋亡抑制蛋白;热休克蛋白;Sod:超氧化物歧化酶;GpX:谷胱甘肽过氧化物酶; Casp: Caspase

介绍

癌症治疗是全世界关注的问题。除了化学制剂，还有对天然产品和食品成分的研究。因此，葡萄及其衍生物除了芥菜籽外，还是没食子酸、白藜芦醇和黄酮类化合物的良好来源，包括儿茶素、槲皮素，这些化合物对多种疾病和癌症都有益。事实上，体内研究表明，酚类化合物和花青素可以抑制结直肠癌的生长。以200 mg/kg高花青素含量的葡萄籽提取物喂养小鼠，8周后结肠肿瘤体积减少44%，并诱导结肠癌细胞凋亡和细胞周期阻滞。此外，以60 mg/kg剂量口服白藜芦醇49天的大鼠，癌前结肠病变减少[1-4]。

Hardaliye是色雷斯地区一种受欢迎的无酒精传统饮料，由葡萄、芥菜籽、酸樱桃叶制成，经乳酸菌发酵5-10天。众所周知，哈达利叶对贫血、心脏病有好处，人们认为它对癌症也有好处[5-7]。

细胞凋亡通路的缺陷导致恶性肿瘤的发生是由于缺乏程序性细胞死亡，而程序性细胞死亡可以保护细胞免受突变的影响，并提供生理生长控制和组织稳态[8]。细胞凋亡信号通路主要有两种，即发生在线粒体内的内源性通路和发生在线粒体外的外源性通路。后者由TNF(肿瘤坏死因子)受体超家族的死亡受体如TNF-α、dr4、dr5、Fas (cd95)[9,10]诱导，然后分别诱导caspase 8和caspase 3的活性，caspase 8和caspase 3是caspases的启动物和效应物[11,12]。然而，抗癌药物等刺激通过线粒体通透性的分化触发内在通路。随后释放细胞色素c，启动凋亡细胞形成。此外，其内在通路还包括Bcl-2蛋白家族的促凋亡和抗凋亡蛋白。在该家族中，Bax通过促进细胞色素c的释放而诱导细胞凋亡，而Bcl-2则抑制[14]。此外，凋亡蛋白抑制剂(IAps)如c-IAP1 (BIRC2)、c-IAP2 (BIRC3)、X-linked IAP (XIAP, BIRC4)、Survivin (BIRC5)会破坏caspase如casp-3和casp-9的激活[13,15]。

抗氧化酶如超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)、谷胱甘肽转移酶(GST)和过氧化氢酶(CAT)通过将这些分子转化为无毒分子来抵御这些分子的有害影响。然而，抗氧化物质和元素如硒和锌是非酶促抗氧化剂，它们可以中和这些自由基的有害作用[16,17]。另一方面，热休克蛋白hsp70保护细胞应对应激条件的不利影响。然而，在肿瘤细胞中发现hsp70的过表达，并且hsp70通过内在和外在途径抑制细胞凋亡。因此，近年来热休克蛋白70已成为预测预后的标志物和药理靶点，其抑制剂已被研究[8-21]。

本实验首先测定了哈达里叶的酚类和金属含量，随后研究了哈达里叶对结肠癌细胞系HT-29细胞凋亡途径和抗氧化应答基因表达的影响，以及对小鼠胚胎成纤维细胞CF-1的增殖作用。虽然关于葡萄籽或酚类化合物对结肠癌或其他类型癌症的抗癌作用的研究很少，但这是关于葡萄籽抗癌活性的第一份报告。本研究结果表明，哈达利叶可降低HT-29癌细胞的生存能力并引发细胞凋亡。哈达利叶通过细胞凋亡抑制剂阻断健康细胞的凋亡，并降低大部分氧化应激相关基因的表达。

材料与方法

化学品、标准品和试剂

甲酸(98-100%)、甲醇(高阶LC质谱)、异丙醇(2-丙醇)和二甲基亚砜购自德国达姆施塔特默克公司。甲酸铵(HPLC级)来自德国Sigma-Aldrich。参考标准;没食子酸、儿茶素、2-5二羟基苯甲酸、反式咖啡酸、丁香酸、反式辛酸、反式对香豆酸、反式阿魏酸、白藜芦醇、水杨酸来自Fluka，原儿茶酸购自德国HWI Analytik Gmbh。MTT(3(4,5 -二甲基噻唑-2-基)- 2,5 -二苯四氮-溴化锂)购自安大略省剑桥Biomatik公司。磷酸盐缓冲盐水(PBS)和分子生物学级水来自Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA。仪器分析用的超蒸馏水阻力为18.2 MΩ。

样品制备

商业获得的Hardaliye样品在15000 g下离心30分钟，用PTFE注射器过滤器过滤(孔径0.22µm)。用50%的UPW稀释两倍;25%异丙醇，25%甲醇，用混合块混合2h。然后，用流动相a稀释5倍。样品转移到琥珀色小瓶中。重复分析三次，以均数±标准差表示。

液相色谱和质谱分析条件

酚类化合物的检测采用Agilent 1260 infinity LC与配备喷射流电喷雾电离源的Agilent 6460三重四极杆质谱联用系统(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)。分析柱为Agilent Poroshell 120 EC-C₁₈(4.6x50 mm, 2.7µm粒度)，设置在25^oC.流动相A由UPW、0.2%甲酸铵(v/v)、0.2%甲酸(v/v)组成。流动相B由甲醇、0.2%甲酸铵(v/v)、0.2%甲酸(v/v)组成。常温下流速0.3 ml/min。进样量为1µl, LC梯度条件为:0 ~ 1 min, 70% A, 30% B;3 ~ 7分钟;30%、70%;9 ~ 10分钟，50% A, 50% B;11 ~ 12分钟;70% A, 30% b，运行时间为12 min。

优化后的分析质谱参数为:气体温度为325℃^oC，雾化器气体压力设置为45psi，喷嘴电压设置为500V，在正负离子模式下进行毛细管监测(MRM)。

数据采集使用Mass Hunter(版本B.06.01)软件。碰撞能量、破碎电压、前体离子、生成物离子和极性见表1。氮(N₂)作为碰撞气体1.12 mTorr。

校正标准混合物以50%的UPW, 25%的甲醇，25%的异丙醇配制，校正浓度范围为1至200 ng/mL。

电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定硬苔叶中的金属

用0.22µm PTFE注射器过滤器过滤的Hardaliye样品用UPW稀释100倍，使用ICP-MS (Agilent 7700x, Agilent Technologies, USA)检测金属含量。ICP-MS工作条件:雾化器气体流量0.91 L/min，射频1200 W，透镜电压1.6 V，冷却气体13.0 L/min，辅助气体0.70 L/min。

HT-29和CF-1 (MEF)细胞的培养及其处理

人HT-29细胞培养系和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)购自ATCC (Manassas,VA,USA)。细胞初始培养于75 cm²DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基)添加10%牛血清和青霉素/链霉素(100 IU/100µg/ml) (Wisent Inc.， Canada)， 37℃培养^oC在5% CO的存在下₂直到70-80%的融合。37℃胰蛋白酶化细胞，PBS洗涤，接种于6孔板(~10℃)⁶细胞/孔)用于Tali细胞凋亡分析以及RNA分离，96孔板(每孔约5000- 10000细胞)用于MTT分析。用0.22µm无菌注射器过滤器过滤的Hardaliye处理指数生长的细胞，MTT实验依次稀释10 ~ 80倍，Tali细胞凋亡实验和qRT-PCR依次稀释5 ~ 10倍。每个实验都独立地重复了至少三次。

MTT细胞活力测定

MTT(3(4,5 -二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四氮-溴化锂)是一种测定细胞活力的方法，通过呼吸细胞将水溶性MTT转化为不溶性紫色甲醛。分别于实验24 h和48 h后进行MTT测定。加入20µl MTT (5mg/ml in PBS)， 37℃孵育^oC为4h。小心地从所有孔中取出含MTT的培养基，用200µl DMSO溶解甲醛晶体，37℃孵育^o使用MultiscanGo酶标仪(Thermo Scientific, USA)在492nm处记录吸光度。计算存活率%[23]。与未处理的细胞相比，吸光度降低50%的值被评估为ic50。

用Tali™图像细胞仪分析膜联蛋白V和PI凋亡

为了评估细胞凋亡，在处理后24小时和48小时用胰蛋白酶/EDTA收集细胞。Tali细胞凋亡检测试剂盒(Life Technologies, USA)按照制造商说明书操作。细胞用annexin-V Alexa Fluor®488和PI(碘化丙啶)染色，分别在黑暗中孵育20分钟和5分钟。将25µl染色细胞装入Tali细胞分析载玻片。用Tali图像细胞仪分析活细胞、凋亡细胞和死亡细胞。结果以均数±标准差表示。结果经反正弦平方根变换后进行统计学分析。

总RNA的分离和cDNA的合成

取出所有培养基，加入1ml lizzie缓冲液。根据生产商说明，使用PureLink®RNA Mini Kit (Life Technologies, USA)分离总RNA。RNA浓度通过NanoQ (Pathtech, Australia) 260 nm紫外吸光度测定。将rna平衡为100 ng/µl，使用高容量cDNA合成试剂盒(Life Technologies, USA)在Veriti 96孔热循环系统上进行反转录，程序如下:步骤1,25^oC, 10分钟;第二步，37^oC, 120分钟;第三步，85^oC, 5分钟。RNA在-80℃下保存^oC, cDNA保存在-20℃^oC用于后续步骤。

qRT- PCR检测细胞凋亡及抗氧化相关基因表达

凋亡通路相关的19个基因表达水平，即;肿瘤抑制基因p53、凋亡激活因子、Bax、凋亡抑制剂、c- iap 1、c- IAP2、Survivin (bırc5)、XIAP Bcl-2和cyt c、Dr4、Dr5、Fas、Casp 2、Casp 9、Casp 3以及抗氧化相关;Sod、Sod 2 (MnSOD)、Cat、GpX、hsp70(引物如表3所示)在ABI 7500 Fast qRT-PCR系统(Life Technologies, USA)上检测，方法如下:20µL反应，每个引物含0.2µM(24,25)， 10µL SYBR Select Master Mix (Life Technologies, USA)(2倍)和1.5µL模板cDNA。初始变性后1x 94^oC浸泡3分钟;扩增40个周期94^oC为45秒;58^oC为45秒;和72年^oc1min和1x72^oC 10min。GADPH mRNA表达作为归一化的管家基因。比较CT法测定mRNA表达水平的相对折叠变化(2)^−ΔΔCT方法)(26)，以mean±SD表示。所有的反应都是重复的。

表3。引物列表

与细胞凋亡和氧化应激途径相关的引物列表
DR4	F: cagaac gtcctggagcctgtaac R: atg TCC att GCC tgc TTC TTT GTG	草皮	F: GTTCGGTGACAACACCAATG 接待员:GGAGTCGGTGATGTTGACCT
DR5	F:嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎 R: acattgtccc ccagcc ccaggtcg	SOD2	F: CGTCACCGAGGAGAAGTACC 接待员:CTGATTTGGACAAGCAGCAA
Fas	F: TCTAACTTGGGGTGGCTTTGTCTTC 接待员:GTGTCATACGCTTTCTTTCCAT	猫	F: TACGAGCAGGCCAAGAAGTT 接待员:ACCTTGTACGGGCAGTTCAC
伯灵顿	F: ATGGACGGGTCCGGGGAG 接待员:TCAGCCCATCTTCTTCCA	GpX	F: CCAAGCCTCATCACCTGGTCT 接待员:TCGATGTCAATGGTCTGGAA
bcl - 2	F: CAGCTGCACCTGACG 接待员:ATGCACCTACCCAGC	HSP 70	F: CTTATCAGTGAAATTAAGCGAGAGC 接待员:ACAAGGATAACTTCATCAACCTTTG
CytC	F: TTTGGATCCAATGGGTGATGTTGAG 接待员:TTTGAATTCCTCATTAGTAGCTTTTTTGAG	生存素	F: GACGACCCCATAGAGGAACA 接待员:GACAGAAAGGAAAGCGCAAC
Caspase-2	F: TGGCACTGATGGCAAACTCC 接待员:ATCGGAGCGTGTAGGCAAAC	c-IAP 1	F: GCATTTTCCCAACTGTCCAT 接待员:ATTCGAGCTGCATGTGTCTG
Caspase-3	F: GTGGAATTGATGCGTGATGT-3 接待员:ACAGGTCCATTTGTTCCAAAA-3	c-IAP 2	F: ATTTTCCACCACAGGCAAAG 接待员:GCATTTTCCCAACTGTCCAT
Caspase-9	F: TGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTT 接待员:GTGAGCCCACTGCTCAAAGAT	XIAP	F: GGGGTTCAGTTTCAAGGAC 接待员:TGCAACCAGAACCTCAAGTG
p53	F: GCTCTGACTGTACCACCATCC-3 R: CTCTCGGAACATCTCGAAGCG-3	GAPDH	F: CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3 接待员:AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3

统计分析

采用统计软件JMP 12.0 (SAS Institute, Cary, NC, USA)分析对照组和处理组之间的差异，采用单因素方差分析，然后进行Tukey-Kramer多重比较检验。差异被认为在p<0.05，星号为*** p< 0.001， **p<0.01， *p<0.05。

结果

硬木叶的酚类和金属含量

葡萄和葡萄籽中天然存在的没食子酸和白藜芦醇在哈达里叶中含量最高(表1)。此外，哈达里叶含有大量的钾和镁，以及锌和硒，这些都是抗氧化金属(表2)。这与葡萄汁的分析结果一致(27)。

表1。阔叶草中酚类物质含量及基本LC /MS参数。数据以mean±SD表示，n = 3

表2。Hardaliye中的金属含量。数据以mean±SD表示，n = 3

金属	浓度(µg / L)	金属	浓度(µg / L)	金属	浓度(µg / L)
K	156656.73±1794	锰	190.03±5	Cr	12.70±0
毫克	11476.99±261	锌	131.41±3	倪	12.6±0
Ca	3132.32±70	老	67.20±4	某人	4.25±1
Na	2128.51±80	Se	26.58±1	有限公司	2.38±0
菲	441.20±14	Ag)	23.34±2	Cd	0.48±0
艾尔	234±3	铜	17.76±0

阔叶菜对HT-29和CF-1细胞的影响

细胞活力和细胞活性测定:在实验24h和48h后评价哈达利叶的作用。根据MTT试验，10倍和20倍稀释的Hardaliye降低了%癌细胞的活力，即;24h后为58±3%，62±5%，48h后为34±2%，38±5%。然而，健康细胞的百分比几乎没有变化，相反，稀释20倍，40倍和80倍后，增加了20%。相应的，根据Annexin V-PI结果，H10作用24h和48h后对癌细胞的影响分别为47±11%和26±2%。但是，在这种方法中，H5使健康细胞的活力降低了40%，而HT-29的这一比例为25%。此外，Hardaliye可触发癌细胞的凋亡水平，而健康细胞的凋亡水平接近1-3%。

IC50检测值为10倍。其他实验分别用5倍和10倍稀释的Hardaliye进行，分别表示为H5和H10(图1和2)。

图1所示。紫檀叶对24 h和48 h后HT-29 (a)和CF-1 (b)细胞系的影响(Tali凋亡试验)。V:存活，D:死亡，A:凋亡。H5表示稀释了五倍的哈达利耶。H10表示稀释十倍的哈达利叶。上标中的不同字母表示对照和处理之间有统计学上的显著差异。数据集使用反正弦平方根变换进行归一化。数据以均数±标准差表示，n = 3: *** p< 0.001， **p<0.01， *p<0.05。

图2。用MTT法分析HT-29和CF-1 (MEF)的活力(%)。数据以均值±标准差表示，n = 3。

细胞凋亡及抗氧化标志物的实时PCR及基因表达

第一步是了解哈达利叶对HT-29细胞内源性或外源性凋亡通路标志物的影响。两种稀释剂处理48h后，H10触发DR5 2.39±0.36倍，H5触发FAS 3.39±1.02倍。然而，在两种稀释条件下，48h后Bax均急剧增加(H5为22.45±3.1倍，H10为6.49±0.1倍)，H10触发casp3，而非casp9和casp2。然而，H5在48小时后触发p53和cyctc水平。此外，Bcl-2也有所升高，但仍低于Bax和其他凋亡抑制剂，即Survivin、XIAP、CIAP 1、CIAP 2与对照组相比仍显著降低(图3和5)。

图3。紫檀叶处理24 h和48 h后对HT-29细胞株凋亡途径相关基因表达的影响H5表示稀释了五倍的哈达利耶。H10表示稀释十倍的哈达利叶。上标中不同字母表示差异有统计学意义。数据以mean±SD表示，n = 3: *** p< 0.001， **p<0.01， *p<0.05。

图5。紫檀叶对处理24h和48h后HT-29细胞凋亡及抗氧化途径相关基因表达的影响。H5表示稀释了五倍的哈达利耶。H10表示稀释十倍的哈达利叶。上标中不同字母表示差异有统计学意义。数据以mean±SD表示，n = 3: *** p< 0.001， **p<0.01， *p<0.05。

对于CF-1细胞，Fas;2.5±0.46倍，p53;2.4±0.15倍，cytc;2.3±0.15倍，casp 3;2.0±0.27倍，casp2在24h后表达，而casp9在H5处理后表达。尽管Bcl-2未升高，但其他凋亡抑制剂Survivin、XIAP、CIAP 1、CIAP 2均显著升高。48h后，基因表达量下降。相反，H10在24h后没有触发DR4、DR5、Fas、cytc、p53、Bcl-2和Bax，但在48h后，Bcl-2升高(1.7±0.05倍)。与各自的对照组相比，其他凋亡抑制剂也有所增加，而只有CIAP 2和casp 2略有下降(图4和6)。

图4。哈达利叶对CF-1细胞凋亡途径相关基因表达的影响H5表示稀释了五倍的哈达利耶。H10表示稀释十倍的哈达利叶。上标中不同字母表示差异有统计学意义。数据以mean±SD表示，n = 3: *** p< 0.001， **p<0.01， *p<0.05。

图6。紫檀叶处理24h和48h后对CF-1细胞凋亡及抗氧化途径相关基因表达的影响。H5表示稀释了五倍的哈达利耶。H10表示稀释十倍的哈达利叶。上标中不同字母表示差异有统计学意义。数据以mean±SD表示，n = 3: *** p< 0.001， **p<0.01， *p<0.05。

第二步观察活性氧(ROS)中和剂的基因表达水平。H5在24h后没有触发这些酶的表达，但在48h后SOD和CAT的表达急剧增加，但线粒体Mn SOD2的表达明显增加。而在CF-1细胞中，虽然抗氧化酶的表达在24h后似乎有所增加，但在48h后均有所下降，但H5处理的细胞中GpX的表达有所下降(图6)。此外，H5处理的HT-29细胞中的Hsp 70水平仍然很低，而H10在48h后触发Hsp 70。CF-1细胞表现出相反的反应，48h后Hsp 70下降，这可能表明细胞内应激条件减少(图6)。

讨论与结论

植物、矿物质和动物等自然疗法的抗癌活性自古以来就作为一种替代疗法而引起人们的极大兴趣。事实上，从葡萄中提取的许多抗氧化化合物，如白藜芦醇，已被筛选为具有抗癌活性。除此之外，这是第一次报道Hardaliye的抗癌活性，Hardaliye是一种传统的乳酸发酵饮料，由芥菜籽、樱桃叶和葡萄制成。

Tali细胞增殖实验结果显示，H5和H10均能显著降低细胞数量。然而，有趣的是，H10比H5更能触发细胞凋亡，这似乎表明H5可以表现出急性细胞毒性。另一方面，CF-1细胞也受到H5处理的轻微影响，但凋亡水平非常低，与对照组相当。根据MTT实验，即使稀释80倍，HT-29细胞的活力也有所下降。24小时后，CF-1细胞不受影响，甚至有刺激增殖的作用。然而，当10倍和20倍稀释48h后，细胞增殖率略有下降，约为80-90%。

LC - MS/MS分析表明，哈达利叶主要含有没食子酸和白藜芦醇。这些多酚的含量与葡萄汁或葡萄酒的研究结果一致。没食子酸和白藜芦醇是多酚类物质，存在于葡萄、茶、葡萄酒和浆果中。其抗衰老、抗癌和抗炎作用已在大量研究中得到证实[29,30]。二alloylresveratrol是一种没食子酸和白藜芦醇的合成酯，已被证明可以剂量依赖性地诱导HT-29结肠癌细胞凋亡，并抑制细胞从S期向G2/M期的过渡。没食子酸还能诱导结肠腺癌细胞[31]凋亡。另一方面，没食子酸还与金属[32]一起具有剂量依赖性的促氧化活性。据此，在我们的结果中，H5在健康细胞中触发SOD的表达略高于H10，而其他三者在统计学上是相等的。然而，48h后显示出抗氧化作用，表达水平如预期的那样下降，但H5的GpX表达仍然很高，可能与上述活性有关。然而，HT-29细胞表现出预期的相反活性，SOD，尤其是CAT的表达急剧增加，从而诱导ros介导的癌细胞凋亡。 Interestingly, H5 drastically triggered BAX activity and also p53, ctyc and Fas. On the other hand, H10 triggered DR5, BAX and casp3 which seems to cause apoptosis of HT-29 cells via p53 independent way.

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热休克蛋白70在错误折叠蛋白的正常折叠和应激条件下的细胞保护中发挥作用。其抑制作用是减少癌细胞的关键因素[18,20,21]。在本研究中，Hardaliye在24h后降低HSP 70水平。48h时，H5处理后HSP 70水平仍低于对照组，而H10处理后HSP 70水平升高。然而，后者不会触发凋亡抑制剂，如Survivin。

哈达利叶主要含有钾和镁以及其他一些抗氧化金属，如锌和硒。如上所述，一些过渡金属除了具有抗氧化作用外，还具有促氧化能力。哈达利叶中检测到的金属或与多酚类物质一起具有强迫细胞凋亡的作用，或如前所述具有促氧化作用。

综上所述，哈达利叶是一种很好的预防结肠癌的食物。此外，哈达里叶还含有多种乳酸菌，已证实乳酸菌对结肠癌有抗癌作用。然而，尽管本研究试图证明和阐明哈达利叶对细胞的直接作用，通过观察这些抗癌物质的吸收水平进行生物利用度研究将有助于澄清这一研究。

致谢

本项目由Trakya大学研究基金资助。项目编号:2015-10。

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