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摘要

背景:糖尿病是心血管疾病的一个危险因素。暴露于高血糖的心肌细胞中TGR5水平升高。本研究的目的是探讨糖尿病大鼠心脏中TGR5水平升高的潜在机制。

材料与方法:我们使用链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠(STZ大鼠)来评估高血糖在心脏TGR5水平升高中的作用。用Western blot检测心脏组织中TGR5及其磷酸化形式(p-STAT3)和原生形式(STAT3)的转录信号转换器和转录激活因子3的表达水平。

结果:经高血糖治疗后，暴露于高血糖条件下的心脏组织中TGR5水平和p-STAT3 / STAT3比值的增加得到逆转。此外，在高糖(HG)培养基中培养的大鼠心肌细胞系(H9c2)模拟体内观察到的变化，证实了这种作用的潜在机制。H9c2细胞暴露于HG后，TGR5的表达与p-STAT3和STAT3比值的增加平行增加，而这些影响在用足够剂量的静药抑制STAT3后被逆转。类似地，抗氧化铁也在H9c2细胞中产生了同样的效果。

结论:1型糖尿病模型中心脏TGR5水平的升高与高血糖有关，高血糖产生自由基，激活STAT3，使心脏中TGR5更高表达。因此，在糖尿病患者中，由肝脏疾病和/或其他疾病引起的循环胆汁酸升高应谨慎处理。

关键字

心脏，高血糖，STAT3, STZ大鼠，TGR5

简介

糖尿病(DM)是一种由遗传、免疫和环境因素相互作用引起的代谢性疾病。糖尿病是心血管功能异常的主要危险因素，包括糖尿病性心肌病[1]。糖尿病性心肌病是一种发生在糖尿病患者的心室功能不全，独立于已知的原因，如冠状动脉疾病或高血压。

糖尿病心肌病的标志是一个亚临床阶段，与细胞结构异常相关，包括心脏肥厚、心脏炎症、纤维化和细胞凋亡增加，最初导致舒张功能障碍，后来导致收缩功能障碍，最终导致心力衰竭[3]。糖尿病和心功能之间的联系是复杂和多因素的，虽然尚不清楚。然而，糖尿病中高血糖、高脂血症和氧化应激的发生已被广泛记录，并与各种心血管并发症的发病机制有关，包括心肌病[5]。因此，在各种治疗策略中，抗高血糖、抗高脂血症和抗氧化剂在预防stz诱导的糖尿病[6]的心肌病方面是有用的。高血糖在糖尿病疾病的发病机制中起重要作用，高血糖对糖尿病大鼠[7]的肺损伤已被证实。然而，除了心脏肥厚[8]外，高血糖对心脏的损害不太常见。

最近的观察表明，适当增加胆汁酸水平对宿主心血管状况有好处。这些效应归因于TGR5激活[9]。武田G蛋白偶联受体(TGR5)，也被称为M-BAR, GPBAR1或BG37，是G蛋白偶联受体(GPCRs)超家族的一员，通过G蛋白转导信号。TGR5在心肌细胞[10]中表达。因此，TGR5的激活导致心脏调节[11]的循环AMP (cAMP)积累。TGR5在啮齿动物和人类心脏中也有功能[10,12]，是健康和疾病状态下胆汁酸的靶标。然而，肝脏疾病中循环胆汁酸的病理升高(约200-300 μmol/L)对心脏是有毒的[10,13]。因此，心脏TGR5的高表达可能导致更敏感，对于胆汁酸过量的疾病应谨慎。

在小鼠[14]中，激动剂激活心脏中的TGR5可诱导心脏的细胞保护变化，并改善心肌对生理性、肌力和血流动力学应激的反应。在[15]高血糖条件下，TGR5表达在心脏细胞系(H9c2细胞)中增强，尽管其潜在机制尚不清楚。高糖处理增加了转录信号换能器和转录激活因子3 (STAT3)的表达[16,17]。此外，STAT信号通过调节靶基因[18]促进细胞转化。然而，STAT3在高血糖诱导的TGR5表达中的作用尚不清楚。因此，阐明在高糖条件下高TGR5表达的糖尿病大鼠的H9c2细胞和心脏组织中STAT3的中介作用具有特殊的意义。

材料与方法

动物

雄性SD大鼠，体重250 ~ 280 g，取自台湾台北国立实验动物中心。所有实验动物均被戊巴比妥钠麻醉(35 mg/kg, i.p)以减少痛苦。实验方案得到了Chi-Mei医疗中心机构动物伦理委员会(103120201)的批准。所有实验均符合《实验动物护理和使用指南》以及《动物福利法》的规定。

诱发糖尿病

大鼠禁食一夜，并接受单次静脉注射链脲佐菌素(60 mg/kg)，以诱导1型糖尿病模型，如前所述[19]。注射STZ后3天测定血糖水平。血糖水平大于300 mg/dl的空腹大鼠被认为是糖尿病[20]型。所有实验均在糖尿病诱导2周后进行。

用胰岛素或素治疗

将大鼠随机分为4组，每组6只，分别为对照组、stz诱导的糖尿病组、胰岛素治疗的糖尿病组和根菌素治疗的糖尿病组。简单地说，stz诱导的糖尿病大鼠腹腔注射胰岛素(1 IU/kg;Actrapid，诺和诺德，Bagsvaerd，丹麦)或菌素(1 mg/kg;Fluka Chemie AG，瑞士)，每天三次，连续7天，如上所述[15]。测定血糖后，麻醉下处死大鼠，收集心脏组织，称量，-70°C保存，以备进一步分析。

细胞培养

H9c2细胞(BCRC编号60096)在Dulbecco改良的Eagle’s培养基中培养(DMEM, pH 7.2;Gibco-BRL生命技术公司，Gaithersburg, MD, USA)添加10%的胎牛血清。细胞每3-4天传代一次，当融合度达到70-80% 5时进行继代培养。为了分化H9c2细胞，将细胞转移到分化培养基(含1% fbs的培养基，含1 μ M反式维甲酸，RA)中，培养7天，如前所述[21]。每天添加RA，每隔一天更换培养基。

分化后，将细胞置于不同浓度d -葡萄糖(终浓度为10、20或30 mM)的无血清培养基中孵育24小时。H9c2细胞暴露于含5.5 mM葡萄糖的正常培养基中进行比较。为排除高糖的渗透作用，在培养基中添加30 mM甘露醇。

Western blotting分析

总蛋白浓度由双二酚酸(BCA)蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific)定量。用10% SDS-PAGE分离等量的蛋白质。电泳后，将蛋白转移到膨大的聚偏二氟乙烯膜(默克Millipore, Burlington, MA, USA)，用5% BSA在TBST中阻塞2小时。然后将膜在抗β-肌动蛋白的一抗(1:5000;Sigma Aldrich, St。密苏里州路易斯，美国);p-STAT3 (1:1000)， STAT3(1:1000)和TGR5(1:1000)来自Abcam (Cambridge, UK)。孵育后，用TBST冲洗膜，与二抗室温孵育1 h。这些印迹是使用化学发光试剂盒(Thermo Scientific)开发的。用激光密度计定量免疫印迹密度。 The optical densities of the bands corresponding to p-STAT3 (92 kDa), STAT3 (92 kDa), TGR5 (35 kDa) and β-actin (43 kDa) were quantified using Gel-Pro Analyzer software version 4.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA).

实时逆转录聚合酶链反应

为了测量每个基因的mRNA表达，用TRIzol试剂(Carlsbad, CA, USA)从样本中提取总RNA。总RNA (200 ng)用寡核苷酸引物反转录成cDNA (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)。Real-time RT-PCR采用TaqMan Universal PCR Master Mix (Thermo Scientific)，反应体积为20μl，含50 ng cDNA。PCR使用Light Cycler系统(Roche Diagnostics)进行。相对基因表达量用靶基因浓度与β-肌动蛋白浓度之比表示。扩增TGR5和β-actin的引物如下:

Tgr5 f: 5 ' -tggctgctgtgactctttga-3 ';

Tgr5 r: 5 ' -tgtgacatcatgggtcttgg-3 ';

β-肌动蛋白F: 5 ' -CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3 ';

β-actin R: 5 ' -GCCTGGATGGCTACGTACA-3 '。

统计分析

结果表示为每幅图图例中所示实验次数的平均值±SEM。多治疗组间比较采用单因素方差分析和事后Tukey检验。使用SPSS for Windows版本17 (IBM, Chicago, IL, USA)进行数据分析。P < 0.05为显著性。

结果

糖尿病大鼠心脏中TGR5的表达水平

未治疗的糖尿病大鼠空腹血糖水平(325.4±13.8 mg/dl, N=6)显著高于正常对照组(101.6±11.1 mg/dl;N = 6)。糖尿病大鼠经胰岛素或根根菌素治疗7 d后，血糖水平分别显著降低至128.7±9.9 mg/dl和148.3±13.6 mg/dl (N=6)。Western blot分析显示，与对照组相比，糖尿病大鼠心脏组织中TGR5水平和p-STAT3 / STAT3比值明显升高(图1A)。这些结果与我们之前的报道一致[22-24]。剂量足够治疗高血糖的胰岛素或根菌素治疗，逆转了糖尿病大鼠心脏中TGR5(图1B)、p-STAT3和STAT3水平的变化(图1C)。

图1所示。糖尿病大鼠心脏TGR5表达的变化。TGR5或β-actin的代表性表达，以及磷酸化的STAT3 (p-STAT3)和STAT3 (STAT3)水平(A)，分离自stz诱导的糖尿病大鼠，这些大鼠接受胰岛素或根菌素纠正高血糖，如方法部分所述。改变的水平，表示为TGR5与β-actin的比值(B)和p-STAT3与STAT3的比值(C)，在每列中显示为平均值±SEM (n = 6)。与正常组比较，*P < 0.05和**P < 0.01;与对照组比较，#P < 0.05和# #P < 0.01

高糖处理的H9c2细胞中TGR5和STAT3的水平

在经不同浓度葡萄糖处理的H9c2细胞中进一步检测了TGR5、p-STAT3和总STAT3的水平。与对照细胞相比，葡萄糖显著增加了TGR5的mRNA水平，且呈浓度依赖性(图2A)。葡萄糖也以同样的方式增加了H9c2细胞系中TGR5的蛋白水平和p-STAT3与总STAT3的比值(图2B)。然而，在H9c2细胞系中，在保持上述高葡萄糖培养基渗透压的浓度下，用甘露醇孵育后，没有记录到TGR5水平(图2C)和p-STAT3与STAT3的比值(图2D)的显著变化。排除了高渗介导的TGR5水平和p-STAT3与STAT3比值变化的可能性。因此，心肌细胞中TGR5的表达因高糖而增加。

图2。H9c2细胞暴露于不同浓度葡萄糖后TGR5或STAT3表达的变化以甘露醇处理组作为阴性对照(a)，比较H9c2细胞在含有指示浓度葡萄糖的培养基中培养时TGR5 mRNA水平的变化。用实时RT-PCR检测相对mRNA表达量，并以TGR5与β-actin的比值表达。在H9c2细胞中，除磷酸化的STAT3 (p-STAT3)和STAT3 (STAT3)水平外，TGR5或β-actin的代表性表达用Western blotting (B)法测定，细胞暴露于含有不同浓度葡萄糖的培养基中。蛋白质水平用TGR5与β-actin (C)或p-STAT3与STAT3 (D)水平的比值表示，每列用平均值±SEM (n = 4)表示。*P < 0.05和**P < 0.01与未添加葡萄糖的H9c2细胞暴露于正常培养基(含5.5 mM葡萄糖)中的值相比，#P < 0.05和# #P < 0.01与暴露于30 mM葡萄糖的H9c2细胞的值相比

stat3特异性抑制剂(Stattic)对H9c2细胞中TGR5表达水平的影响

静药剂量足以抑制STAT3[25]。静置后H9c2细胞中TGR5 mRNA水平的增加被显著逆转(图3A)。H9c2细胞系中TGR5的蛋白水平和p-STAT3与总STAT3的比值也以同样的方式被静态降低(图3B)。对H9c2细胞系中TGR5水平降低(图3C)或p-STAT3与STAT3之比(图3D)的定量分析支持静药的剂量依赖性效应，与之前的报告[26]类似。这些结果表明，在高糖条件下，STAT3增加了H9c2细胞中TGR5的水平。

图3。STAT3抑制剂(静态)对高糖水平诱导的H9c2细胞变化的影响比较静置处理(在指示剂量下)和未处理的H9c2细胞在含30 mM葡萄糖的培养基中培养的TGR5 mRNA水平的变化(A)。使用实时PCR检测的相对mRNA表达量，并将其报告为TGR5与β-actin水平的比值。表示为均值±SEM (n = 6)。代表表达TGR5或β肌动蛋白除了磷酸化STAT3 (p-STAT3)和STAT3 (STAT3)水平stattic-treated或未经处理的H9c2细胞暴露于介质包含30 mM葡萄糖相比也使用免疫印迹(B),蛋白质含量,表示为TGR5比β肌动蛋白(C)或p-STAT3 STAT3 (D)水平,以均值±SEM表示在每一列(n = 4)。*P < 0.05和**P < 0.01与H9c2细胞暴露于正常培养基(含5.5 mM葡萄糖)的值比较，#P < 0.05和# #P < 0.01与H9c2细胞暴露于30 mM葡萄糖的值比较

抗氧化铁对H9c2细胞中p-STAT3与STAT3比值及TGR5水平的影响

为了了解自由基在激活STAT3磷酸化中的作用，我们在H9c2细胞[13]中使用足够剂量的铁来抑制自由基。H9c2细胞中升高的TGR5 mRNA水平被铁以剂量依赖性的方式逆转(图4A)。在H9c2细胞系中，铁也以同样的方式降低了TGR5的蛋白水平和p-STAT3与总STAT3的比值(图4B)。对H9c2细胞系中TGR5水平降低(图4C)或p-STAT3与STAT3比值(图4D)的定量分析支持铁的作用。这些结果证明了自由基在糖尿病心脏TGR5水平升高中的作用。

图4。抗氧化剂(铁)对高糖诱导的H9c2细胞变化的影响。比较在含30 mM葡萄糖培养基中孵育的tirons处理或未处理的H9c2细胞中TGR5 mRNA水平的变化(A)。相关的mRNA表达，通过real-time PCR检测，并以TGR5与β-actin水平的比值表达。在暴露于含30 mM葡萄糖的培养基中，tiro处理或未处理的H9c2细胞中，除了磷酸化的STAT3 (p-STAT3)和STAT3水平外，还使用Western blotting (B)比较TGR5或β-actin的表达。蛋白质水平，表示为TGR5与β-actin (C)或p-STAT3与STAT3 (D)水平的比值，表示为每列的平均值±SEM (n = 4)。*P < 0.05和**P < 0.01与H9c2细胞暴露于正常培养基(含5.5 mM葡萄糖)的值比较，#P < 0.05和# #P < 0.01与H9c2细胞暴露于30 mM葡萄糖的值比较

讨论

在本研究中，我们发现1型糖尿病大鼠心脏组织中TGR5水平升高。胰岛素和素通过不同的机制有效降低糖尿病动物的高血糖;胰岛素通过受体偶联信号[27]降低血糖，而根菌素抑制肾小管葡萄糖重吸收[28]。胰岛素或根菌素治疗7天可纠正糖尿病大鼠的高血糖并逆转TGR5水平的变化。这些结果提示高血糖是心脏组织中TGR5表达增加的原因。此外，我们用高糖处理大鼠心脏细胞系(H9c2细胞)，在体外模拟糖尿病疾病，并证实了在高血糖期间TGR5表达的增加。此外，在体内和体外，p-STAT3与STAT3的比值也随着TGR5水平的变化而发生平行变化。STAT3的特异性抑制剂逆转了H9c2细胞中高糖诱导的TGR5水平升高。STAT3特异性抑制剂(静)还可减弱心肌细胞系中p-STAT3与STAT3的比值，从而提示STAT3可调节TGR5的表达。

糖尿病是心脏损伤的危险因素，临床研究表明糖尿病和[29]心肌病之间可能存在关系，尽管这种关系的复杂机制尚不清楚。糖尿病的主要特征是高血糖。TGR5与心脏功能[30]的维持有关。然而，高糖对TGR5水平的影响尚未被描述。在本研究中，我们发现糖尿病大鼠心脏中TGR5水平升高，并且通过血糖水平的修正，这种升高明显逆转。因此，我们在糖尿病大鼠心脏中发现了高血糖诱导的TGR5表达。STAT3是一种细胞质转录因子，可将胞外信号传递到[31]核。细胞核中激活的STAT3与特定的DNA启动子序列结合，调节基因[32]的表达。高血糖增加STAT3激活，从而促进组织损伤[22]的病理生理学。STAT3的激活和磷酸化的STAT3 (p-STAT3)与STAT3之比的增加可能促进核易位。 Moreover, p-STAT3 was induced at Y705 and S727 in cells with the activation of STAT3 by high glucose levels [33]. Therefore, in the current study, we focused on changes in the ratio of p-STAT3 to STAT3. Our data also demonstrated that the increased ratio of p-STAT3 to STAT3 was reversed with the correction of hyperglycaemia in the hearts of diabetic rats. Additionally, similar changes were observed in the cultured cardiac cell line (H9c2 cells) that was induced by high glucose levels. Moreover, a specific inhibitor of STAT3 in H9c2 cells markedly reversed the increased TGR5 levels triggered by high glucose. The pharmacological inhibitor specific to STAT3 (stattic) also reversed the changes in the ratio of p-STAT3 to STAT3. Therefore, the increased TGR5 level was regulated by activated STAT3. The specificity of stattic has been criticized [34,35]. However, stattic has been widely used as a specific STAT3 inhibitor in numerous studies [36,37] As evidenced by our findings, hyperglycaemia may increase STAT3 activation to enhance TGR5 expression, which could be a possible mechanism underlying cardiac disorders in diabetes.

STATs属于一组由自由基[38]激活的转录因子，而STAT3的激活与纤维化疾病[39]的发生密切相关。自由基和/或氧化应激与高血糖[40]有关。因此，STAT3的激活主要是由高血糖的自由基诱导的。在这份报告中，我们发现众所周知的自由基抑制剂铁能有效逆转心肌细胞系中TGR5水平的升高。因此，糖尿病期间高血糖产生的自由基可能激活STAT3，促进TGR5在心脏的表达。因此，在伴有肝功能紊乱的糖尿病患者或其他患者中，应仔细检查循环胆汁酸水平的升高。

显示高TGR5表达并模拟人类功能变化的心脏糖尿病并发症动物模型未在本研究中应用。因此，糖尿病性心肌病中TGR5水平的升高有待进一步的研究。此外，使用siRNA 1对STAT3的抑制比使用药理抑制剂更特异性。这是本报告的另一个局限性，应该在未来进行研究。

结论

综上所述，我们的数据首次证明了高血糖产生的自由基可能激活STAT3促进糖尿病大鼠心脏中TGR5的表达。我们的发现强调了糖尿病诱导的心脏并发症的潜在机制。此外，目前的研究结果还表明，心脏TGR5反应在高血糖状态下比在正常血糖状态下更为敏感。因此，在糖尿病患者中，由肝脏疾病和/或其他疾病引起的循环胆汁酸升高应谨慎处理。此外，在体内和体外高血糖时，TGR5配体或激动剂的应用应谨慎进行。

确认

我们感谢y.l.y Yen和y.c.c Chen对实验的帮助，并感谢美国期刊专家(AJE)对编辑工作的协助。

作者的贡献

作者对他们的贡献发表了以下声明:MCW构思和设计了实验，FYK和SPL执行了实验，FYK分析了数据，JTC和MCW贡献了试剂/材料/分析工具。FYK和JTC撰写了手稿。

资金

本研究得到了中华民国台湾科技部(MOST 104-2320-B-384-004-MY3)的资助。

数据和材料的可用性

支持本文结论的数据集包含在本文中。任何资料和材料的要求可以发送给相应的作者。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

发表同意书

不适用。

伦理批准和同意参与

所有动物实验方案均经台湾台南芝美医学中心伦理委员会(机构动物护理与使用委员会)批准。

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