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摘要

目的:识别用于选择宫内植入胚胎的生物标志物可以提高体外受精(IVF)的成功率。评估从已知倍性状态的人类胚胎囊胚腔液体条件培养基中发现的凋亡分子标记，为研究早期胚胎发育过程中的模式和过程提供了机会。细胞凋亡发生在着床前发育过程中，可以选择性地从发育的胚胎中消除非整倍体细胞。因此，凋亡残余物如细胞游离DNA (cfDNA)可能驻留在胚胎的囊胚腔液中，并随胚胎倍性状态而变化。在本研究中，我们比较了来自整倍体和非整倍体胚的囊胚腔液体条件培养基的cfDNA含量。

方法:在Day-5 IVF胚泡的促肾小管（TE）活检后收集胚泡流体条件培养基。使用荧光光谱法量化来自89个胚胎的培养基中的CFDNA。

结果:人囊胚腔液体条件培养液中cfDNA含量随着倍性状态偏离整倍体而降低。

结论：CFDNA含量的改变可以代表胚胎是欧共倍体的胚胎的水平。除了通过分析肾小管胚胎细胞的细胞非倍性的遗传检测之外，揭示胚泡流体中的不同分子特征，这些胚胎胚胎是胚胎胚胎特有的，表明流体的分析可以提供额外的胚胎质量的量度，这是脊髓造成的额外侵袭性。

关键字

囊胚腔液，游离DNA，整倍体，非整倍体

介绍

反复流产是胚胎染色体异常的推测结果，即非整倍体，染色体的损失或获得。此外，大约30%的怀孕将导致活产，这一低数字是由于植入前和植入后的并发症[1]。非整倍体通常与高龄母亲有关，因为染色体异常通常来自母亲，由减数分裂的卵母细胞分裂错误引起。然而，受精后也可能发生染色体异常，这可能是由于发育中的胚胎[2]内的有丝分裂错误引起的。出生结果表明，一小部分非整倍体胚胎形成囊胚，成功植入并导致活产(即出生时患有唐氏综合症或特纳综合征的孩子)。有趣的是，非整倍体率已经被证明在从卵母细胞到囊胚的转变过程中是波动的，这表明着床前胚胎中可能存在某种自动校正的机制[2,3]。然而，胚胎着床前阶段某些细胞非整倍体的潜在纠正机制尚不清楚。

为提高活产率提出的一种治疗方案是利用体外受精(IVF)与胞浆内精子注射(ICSI)，胚胎活检和随后的染色体分析，称为着床前非整倍体基因检测或PGT-A[5]。鉴定整倍体胚胎的过程包括对体外受精产生的5天或6天囊胚期胚胎的数个滋养外胚层细胞进行活检。尽管临床胚胎学家目前采用了重要的技术能力来识别胚胎的倍性状态，但体外受精产生的整倍体胚胎植入仍然小于60%[6]。

使胚胎选择更加复杂的是，植入前胚胎通常是嵌合体，因此单个胚胎中的细胞在基因组成和倍性状态上可能彼此不同。单个胚胎内的这些差异已经被多种遗传方法绘制出来，包括微阵列分析，它说明了在一些嵌合胚胎[7]中甚至与相邻细胞的巨大差异。考虑到流行镶嵌性的人类胚胎估计~ 20%,与非整倍体率降低的证据在胚胎的囊胚阶段开发中,非整倍体胚胎的摆脱能力的细胞植入前通过监管和系统化的方式是一个可能的假设[7,8]。

细胞选择性死亡最著名的机制是细胞凋亡。细胞凋亡，被称为程序性细胞死亡，发生在着床前胚胎发育过程中，可能是一种纠正机制，牺牲细胞以提高胚胎的整体能力[9]。此外，细胞凋亡需要线粒体蛋白，而且母亲年龄和非整倍体胚胎都与线粒体[4]缺陷有关。此外，最近的一项研究发现，在非整倍体胚胎[10]中线粒体DNA (mtDNA)水平升高。在机制上，如果线粒体功能受损，这可能直接导致正常着床前胚胎发育过程中细胞凋亡的能力下降。如果凋亡的一个作用是胚胎通过消除非整倍体细胞进行自我校正，那么受损的凋亡可能会导致非整倍体细胞保留，从而导致胚胎不能植入。

除了染色体分析，提出了一种提高整倍体体外受精胚胎植入率的方法，即识别植入整倍体胚胎与未植入整倍体胚胎所特有的生物标记物。理想的生物标记物是一种可以通过非侵入性或最小侵入性手段从营养外胚层活检的早期胚胎中容易获得的生物标记物。通过对体外受精程序的检查，囊胚腔液显然符合标准。在体外受精过程中，胚泡活检完成后进行染色体分析(着床前基因检测非整倍体或ptt - a)，胚胎自行崩溃。这种塌陷导致囊胚腔液体挤压到周围的培养基中。胚泡液体培养基(通常被丢弃)可以被冷冻并随后进行评估。这种收集方法被称为囊胚穿刺术，是一种微创的方法，为研究提供5/6天胚胎的囊胚腔液，同时降低胚胎[11]未来发育潜力的风险。这种囊胚腔液是公认的细胞游离DNA (cfDNA)来源，可以作为发现胚胎倍性状态的代理[12-17]。一些研究报道了使用cfDNA检测的染色体状态与胚胎滋养外胚层活检[17]的PGT-A之间的有限一致性。在囊胚腔液中也检测到蛋白质、线粒体DNA、miRNAs和cfDNA，这些分子的来源可能是囊胚凋亡细胞的残留物[18-22]。 Most recently, microRNAs, some of which were linked to apoptosis, and extracellular vesicles were found in blastocoel fluid from human embryos [23]. Therefore, if apoptosis purges the embryo of aneuploid cells in the preimplantation embryo, detection of this activity may be possible through measuring cfDNA content in the blastocoel fluid.

在目前的研究中，我们在89天-5胚泡胚胎中评估了胚泡流体调节培养基中的CFDNA水平，与双重胚胎相比，各种胚乳胚胎中的CFDNA水平较高。胚胎中升高的CFDNA的一个来源可以是胚胎中凋亡细胞的残余物。我们假设归类为非产水合物（基于PGT-A）的人胚胎将经过较少和或不完全的凋亡细胞消除，这导致胚胎保留细胞染色体异常。我们提出分析囊胚液中CFDNA含量的分析是一种潜在的生物标志物，用于选择具有最佳机会的胚胎植入子宫植入。

方法

南卡罗来纳大学研究符合性办公室的机构审查委员会（IRB）授予研究批准。通常被丢弃的胚泡流体调节培养基被收集并保存从在合作诊所接受IVF循环的患者（San Antonio，TX，Swansea，IL和Raleigh，NC）中获得的IVF循环的第5天胚泡阶段人胚胎后活检。在预体内遗传测试的预体内遗传测试的过程中，在来自DAT-5胚泡阶段胚胎的细胞交叉点之间的激光脉冲之后，挤出的促肾小组（TE）细胞进行了活检。通过移液管除去活检TE细胞，并在商业测序公司通过下一组测序（NGS）置于缓冲液中进行PGT-A分析。完成胚泡活检后，胚胎自塌陷，导致胚泡流体被挤出到周围介质中。在向GreenVille发货之前，胚泡流体调节培养基的体积约为25μL的培养基在加入Greenville之前。活检胚胎是抑制结果的待处理结果。通过合作生育诊所提供除鉴定的数据，包括患者年龄，胚泡形态学分数和倍性地位。

无细胞DNA定量

采用荧光光谱法对来自89个胚胎的囊胚腔液体条件培养基中的细胞游离DNA进行了定量。使用AccuBlue NextGen dsDNA定量试剂盒(Biotium)，根据制造商的说明，由NanoDrop 3300荧光光谱仪(ThermoScientific)检测产生的排放。在生成标准曲线后，从89个胚胎中分别取2mL囊胚腔液体条件培养基进行独立定量。采用方差分析(ANOVA)和学生t检验比较倍性状态(≤-2、-1、0、+1、≥+2)和cfDNA含量。

结果

与双液滴胚胎相比，每倍体胚胎的平均无细胞DNA含量较高

在来自Day-5胚泡胚胎的89个胚泡流体调节介质样品中量化无细胞DNA（CFDNA），其特征在于倍增性状态并随后平均（图1）。正常的，各种胚乳阶段胚胎（n = 45）的平均CFDNA含量为44.9ng / ml。表现出单一染色体损失的胚泡胚胎（n = 18）的平均CFDNA含量为37.1ng / ml，缺失2或更多的那些（n = 6）的平均CFDNA含量为32.6ng / ml。表现出单一染色体增益的胚泡胚胎（n = 15）的平均CFDNA含量为42.2ng / ml，具有2或更多染色体（n = 5）的那些平均CFDNA含量为30.1ng / ml。各种液（44.9ng / ml）和非含倍差（36.8ng / ml）日-5胚泡之间的CFDNA差异有显着（P <0.05）差异。ANOVA揭示了一种显着的（P <0.05）相关性连接染色体状态（增益/损失/欧共差）和CFDNA含量。来自欧共倍体胚胎的胚泡液中的升高的CFDNA可以代表从进一步的胚胎内部的凋亡残余物，其接受了选择性消除的，从而可以通过细胞凋亡以与各大程度相同的程度来选择性地将这些细胞选择性地除去这些细胞作为欧共倍体胚胎。

讨论

我们在囊胚腔液体条件培养基中发现了整倍体和非整倍体人类胚胎之间的一个不同的分子特征。具体来说，整倍体胚胎的液体中cfDNA水平高于非整倍体胚胎。此外，在我们分析的非整倍体胚胎池中，cfDNA含量随着获得或丢失一条以上的染色体而降低。囊胚腔液体条件培养基中cfDNA的一个来源可能是非整倍体细胞在着床前发育早期选择性凋亡的细胞残余物。这些结果表明，囊胚腔液体条件培养基提供了可检测到的随胚胎倍性状态而变化的分子差异(图1)。此外，囊胚腔液体条件培养基可能保留了在着床前早期发育过程中特定非整倍体细胞凋亡消除的证据。凋亡细胞消除的程度可能是未来胚胎植入成功的一个指标。

图1．与双倍体胚胎相比，在来自各种百倍胚胎的胚泡流体调节培养基中检测到无细胞DNA含量的升高。使用荧光纳米玻璃评估来自Day-5胚泡胚的胚泡流体调节介质样品（n = 89），用于DNA含量。来自每个胚泡阶段胚胎的CFDNA通过Fluypectromety确定，均报告来自45个Euploid胚性阶段胚胎（绿棒），18个囊胚阶段胚胎，其表现出单一染色体损失，6个囊胚阶段胚胎，2个或更多缺失染色体，15个胚性阶段胚胎表现出单一染色体增益和5个胚泡阶段胚胎，具有2或更多染色体增益。ANOVA在染色体状态（增益/损失/欧共差）和CFDNA水平之间显示出显着的（P <0.05）差异

Hammond等人的一项研究进一步支持了在囊胚腔液体条件培养基中检测到的凋亡残余物的来源，该研究在废培养基[22]中鉴定了线粒体DNA。mtDNA的来源可能来自着床前发育过程中发生凋亡的细胞的线粒体。博尔顿在el使用化学药物，逆转素，在小鼠胚胎中诱导非整倍体，并发现小鼠着床前胚胎[24]的非整倍体细胞凋亡消除。该小鼠研究进一步支持了通过凋亡选择性去除非整倍体细胞的过程。

我们的研究结果支持囊胚腔液体条件培养基含有被植入前胚胎选择性牺牲的凋亡细胞的分子残余物的观点，因此囊胚腔液体中的cfDNA可能不是其他[25]所建议的倍性状态的最佳指标。本研究提出，凋亡残余(即cfDNA)的水平可能是胚胎倍性和未来胚胎植入潜力的一个分子指标。我们认为，非整倍体细胞在着床前胚胎内通过凋亡选择性自我牺牲是一个自然过程，如果进行到必要的程度，将产生一个整倍体胚胎，或潜在的非整倍体胚胎，可以胜任子宫着床。因此，我们认为，评估植入前胚胎的凋亡过程存在于囊胚腔液体条件培养基中。

伦理批准和同意参与

根据《联邦法规》(45 CFR 46)的规定，该研究本身作为非人类研究(因为所有流体样本都已去除标识)进行，并免于IRB审查。在患者知情同意的情况下采集囊胚腔液条件培养基。治疗知情同意书(美国生殖医学学会-辅助生殖技术学会同意书模板)被修改为包括任何未使用的生物材料可以用于当前或未来的研究。所有患者都签署了一份同意书，允许对TE细胞进行ptt - a治疗。

设施：VIOS生育研究所。所有方法都按照相关指南和法规进行。

设施：德克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥。所有方法都按照相关指南和法规进行。

设施：大西洋生殖医学专家。所有方法都按照相关指南和法规进行。

确认

南卡罗来纳大学Magellan学者资金支持JB并抵消了一些实验成本。

作者的贡献

RJC和WER设计了实验。SZ，TAC，RDR和JDW进行了样品收集，汇集了患者数据记录，并为本稿件进行了贡献。AL和JB帮助执行了数据分析的实验和帮助。AL LED数字建设，并帮助稿件写作。WER和RJC带领数据分析，解释结果和稿件写作。

利益争夺

两位作者宣称没有相互竞争的利益。

参考资料

1. Macklon NS，Geraedts JP，FAUSER BC（2002）概念对正在进行的怀孕：早期妊娠的“黑匣子”。哼天线转换开关的更新8: 333 - 343。(Crossref)
2. Fragouli E, Alfarawati S, Spath K, Jaroudi S, Sarasa J, et al.(2013)胚胎非整倍体的起源和影响。哼麝猫132: 1001 - 1013。(Crossref)
3. 罗伯克特C，Vanneste E，Pexsters A，D'Hooghe T，Voet T，等。（2010）早期人产前发育的体细胞基因组变异。咕咕叫基因组学11: 397 - 401。
4. Daughtry BL, Chavez SL(2016)哺乳动物着床前胚胎的染色体不稳定性:潜在原因、检测方法和临床后果。细胞组织Res363：201-225。
5. Brezina Pr，Anchan R，Kearns WG（2016）非整倍性的预催化试验：您应该使用哪种技术以及差异是什么？J协助red Genet33：823-832。
6. Fragouli E，Munne S，Wells D（2019）人胚囊的细胞遗传学构成：综合染色体筛查策略的见解。哼天线转换开关的更新25：15-33。
7. Mertzanidou A，威尔顿L，Cheng J，Spits C，Vanneste E，等。（2013）微阵列分析显示出超过70％的染色体互补物，占14％的14％的人类胚胎。嗡嗡声28日:256 - 264。
8. Schattman GL(2018)人类植入前胚胎的染色体镶嵌现象:另一个不容忽视的事实。Fertil Stillile.109：54-55。(Crossref)
9. Brill A, Torchinsky A, Carp H, Toder V(1999)凋亡在正常和异常胚胎发育中的作用。J协助red Genet16：512-519。
10. Fragouli e，spath k，alfarawati s，kaper f，craig a等。（2015）Wells D改变了线粒体DNA水平与女性年龄，非血磅和胚胎植入潜力的独立度量相关．Plos Genet.11: e1005241。
11. Gianaroli L, Magli MC, Pomante A, Crivello AM, Cafueri G, et al.(2014)囊胚穿刺术:植入前基因检测的DNA来源。初步研究的结果。Fertil Stillile.102：1692-1699。(Crossref)
12. Capalbo A, Romanelli V, Patassini C, Poli M, Girardi L，等(2018)标准临床条件下囊胚腔液和废培养基作为植入前基因检测DNA来源的诊断效果。Fertil Stillile.110: 870 - 879。
13. Tšuiko O, Zhigalina DI, Jatsenko T, Skryabin NA, Kanbekova OR, et al.(2018)囊胚腔液的核型与滋养外胚层和内部细胞团块的一致性都很低。Fertil Stillile.109：1127-1134。(Crossref)
14. 李p，宋z，姚y，huang t，mao r等人。（2018）预催化遗传筛选用水培养介质/胚泡液进行体外受精。Sci代表8：9275-018-27367-4。
15. 徐继，方岚，陈立，陈德，萧吉普，等。（2016）胚胎培养基对体外施肥的胚胎培养基基因组测序的非侵袭性染色体筛选．美国国家科学院学报113：11907-11912。
16. Magli MC, Albanese C, Crippa A, Tabanelli C, Ferraretti AP, et al.(2019)囊胚腔液中脱氧核糖核酸检测:胚胎倍性和活胎的一个新的预测因子。Fertil Stillile.111：77-85。
17. Ho JR, arach N, rhodeslong K, Ahmady A, Ingles S, et al.(2018)推动检测的极限:胚胎非整倍体筛选的细胞游离DNA研究。Fertil Stillile.110: 467 - 475。
18. Capalbo A，Ubaldi FM，Cimadomo D，Noli L，Khalaf Y等。（2016）废胚泡培养基中的MicroRNA源自肾小管细胞，可以探索人胚繁殖能力评估。Fertil Stillile.105：225-235。
19. Palini S，Galluzzi L，De Stefani S，Bianchi M，Wells D等人。（2013）人胚泡液中的基因组DNA。天线转换开关生物医学在线26日:603 - 610。
20. Poli M，Ori A，Child T，Jaroudi S，Spath K，等人。（2015）植入前单人胚胎分泌的蛋白质的表征和定量。Embo Mol Med.7：1465-1479。
21. (2014)囊胚腔液中含有非整倍体细胞边际化的胚胎DNA。Fertil Stillile.102：E205。
22. 哈蒙德呃，麦格里韦雷，BC，柳条SM，PEEK JC，炮轰A等。（2017）在胚胎培养基中表征核和线粒体DNA：鉴定遗传污染。Fertil Stillile.107：220-228。
23. Battaglia R, Palini S, Vento ME, La Ferlita A, Lo Faro MJ，等(2019)人囊胚腔液中细胞外囊泡的鉴定和miRNA表达谱的特征。Sci代表9：84-018-36452-7。
24. 博尔顿H，Graham Sj，Van der Aa N，Kumar P，Theunis K，等。（2016）染色体马赛克的鼠标模型揭示了一种单倍细胞细胞和正常发育潜力的谱系特异性耗尽。Nat Commun7: 11165。
25. Vera-Rodriguez M, Diez-Juan A, Jimenez-Almazan J, Martinez S, Navarro R, et al.(2018)着床前发育过程中人类胚胎培养废培养基中细胞游离DNA的来源和组成。嗡嗡声33: 745 - 756。