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摘要

暴露于香烟烟雾会增加人体内氧化修饰蛋白质、脂质、DNA/RNA和碳水化合物的形成。这些有毒物质涉及多种病理学，例如癌症。众所周知，抗氧化补充剂可减少氧化修饰蛋白质的形成，即羰基蛋白质。据估计，新开发的2-酮戊二酸/抗坏血酸/5-羟基甲基糠醛/肌肽组合可保护生成的羰基蛋白质在活的有机体内和在体外．

方法：采用酶联免疫吸附试验(Carbonylprotein ELISA)测定了15名吸烟者和15名不吸烟者血浆中的羰基蛋白含量，用分光光度法测定了红细胞蛋白中的羰基蛋白含量。15名吸烟者被随机分配到饮用2-羟戊二酸/抗坏血酸/5-羟甲基糠醛组合饮料4周。分别在补充2周和4周后测定血浆羰基蛋白。

在体外研究香烟改性蛋白质的缺乏或存在的组合2-oxoglutarate /抗坏血酸/ 5-hydroxy-methyl-furfur-aldehyde 2-oxoglutarate /肌肽或单独的物质,抗坏血酸,与羰基蛋白spectro-photometically 5-hydroxy-methyl-furfur-aldehyde测量方法之前,2后,15到30分钟。

结果:吸烟者血浆中的羰基蛋白（448±223 pmol/mg）显著高于非吸烟者（191±40 pmol/mg；p<0.02），红细胞蛋白中的羰基蛋白（26.8±12.9 nmol/mg vs.12.1±0.3 nmol/mg；p<0.001）显著高于非吸烟者。4周后，补充组的羰基蛋白（228±11 pmol/mg）显著低于未补充组（325±45 pmol/mg；p<0.001）。

在体外(2.18±0.34 nmol/mg vs. 5.94 nmol/mg±0.43 nmol/mg;P <0.001)、15(2.81±0.31 nmol/mg vs. 7.96±0.79 nmol/mg;P <0.001)、30 min(3.39±0.32 nmol/mg vs 9.89 nmol/mg±0.07 nmol/mg;(3.85±0.63 nmol/mg vs. 11.51 nmol/mg±0.94 nmol/mg;p<0.001)，而不添加BSA溶液。使用分离物质浓度的0.106毫米2-oxo-glutarate显示显著减少的羰基蛋白后2分钟。(48.5%),15分钟。(52.3%),30分钟。(54.6%)和60分钟。(54.7%)与香烟孵化,维生素C: 2分钟。(41岁的4%),15分钟。(41.8%),30分钟。(42.7%)和60分钟。(45.0%)。5-HMF: 2(13.8%)、15例(12.3%),30(7.8%)和60分钟。(10.9%)。

结论：体内对吸烟者和在体外研究表明，在含有2-氧代摩洛盐/抗坏血酸/ 5-羟基 - 甲基 - 呋喃酚 - 醛醛/肉桂苷的组合补充混合物存在下显着降低了氧化改性蛋白质。

介绍

吸烟含有许多有毒、致癌和致突变的化学物质，以及稳定和不稳定的自由基[1]。

香烟燃烧产生的烟雾取决于一系列机制，包括热解和燃烧产生的烟雾、气溶胶形成和物理传质过程产物[2]。众所周知，吸烟会导致各种疾病，因为它含有自由基。此外，可以证明非吸烟者组的总抗氧化状态（TAS）、维生素C和维生素E等参数显著高于吸烟者组，吸烟者的总氧化状态（TOS）和氧化应激指数（OSI）水平更高[1]。

人血浆暴露在气相和全香烟烟雾中，会引发或直接促进蛋白质、脂类、碳水化合物和DNA通过自由基、活性氧和氮(RONS)以及饱和和不饱和醛等约4000种化学物质的氧化修饰[3-6]。

这通常会导致各种退行性肺部和心血管疾病，如支气管炎、肺气肿、心肌梗死、精子数减少和慢性炎症，以及肺癌和其他恶性肿瘤[7,8]。慢性炎症激活多种炎症细胞，炎症细胞诱导并激活多种酶，如一氧化氮合酶、髓过氧化物酶、NADPH氧化酶和嗜酸性粒细胞过氧化物酶。这些酶产生高浓度的自由基和氧化剂，包括超氧阴离子(O₂^{* - - - - - -})、一氧化氮(NO_x，过氧化氢和次氯酸，而次氯酸本身会与一种更有效的氧化、硝化和脱氨试剂反应，这种试剂被称为过氧亚硝酸盐(ONOO)^-)[9]。该物种能够破坏DNA、RNS、脂质和蛋白质，导致酶和蛋白质突变增加和功能改变，如致癌基因产物的激活和肿瘤抑制蛋白的抑制[5,10-12]。

许多研究表明，在发炎的组织中测量改性蛋白质的增加的浓度，例如肺癌患者和吸烟者的血浆[13]。如羰基蛋白的测量所证明的，人血浆中白蛋白，心脏和肝脏在猪肺中微粒蛋白质的蛋白质和肝脏降解的氧化损伤，心脏和肝脏，由水溶性抗坏血酸完全抑制并且仅部分由谷胱甘肽，但不是由其他抗氧化剂，包括超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（猫），维生素E和B-carotene [5,14]。这导致了大剂量抗坏血酸保护吸烟者免受氧化损伤和相关的退行性疾病的建议。就氧化损伤的化学预防而言，抗氧化剂的作用和浓度尚未完全定义。我们报道了由于非小细胞肺癌患者为肺手术患者口服补充2-氧代或5-羟基 - 甲基 - 呋喃 - 呋喃（5-HMF）的益处，导致运动和能量减少，氧化还原通过测量羰基蛋白LED来应力[15]。目前我们正在研究II期临床研究中的5-羟基 - 甲基 - 呋喃醛和2-氧代戊二酸，作为有效的细胞抑制和自由基清除剂作用物质[16,17]。

本研究的目的是阐明2-氧戊二酸/抗坏血酸/5-羟甲基糠醛/肌肽的组合是否能作为水溶性物质保护暴露在卷烟烟气气相中的蛋白质的氧化损伤。

材料和方法

2-氧氧化丁胺，肉核苷酸，抗坏血酸，5-羟基 - 甲基 - 糠醛醛，牛血清酶（BSA），胍胺-HCl，脱羟基 - 甲苯（BHT）来自Sigma Aldrich。从侥幸察中获得二硝基 - 苯基 - 肼（DNPH）。Alphah®来自HgPharma（维也纳，奥地利），其中含有20毫升浓缩管。Alphah®的主要成分是2-氧氧缺乏症（69 mm），抗坏血酸（40mM），5-羟基 - 甲基 - 糠醛（4mM）和肉毒肽（1.1mm）。

体内吸烟者和非吸烟者血浆蛋白损害的测量

为在活的有机体内采用ELISA技术测定15名吸烟者（42.5±6.2岁；8名女性和7名男性）和15名非吸烟者（38.5±4.2岁；6名女性和9名男性）血浆中的羰基蛋白（K7822；Immundiagnostik AG，Bensheim，Germany）。人血浆中的羰基蛋白以pmol/mg蛋白表达。

含有蛋白质的样品与DNPH反应。然后用超离心法分离非蛋白组分和未结合的DNPH。这些蛋白被吸附到ELISA板上，与抗dnph抗体和抗体连接的辣根过氧化物酶一起孵育。吸光度与氧化血清白蛋白制备的标准曲线有关。羰基蛋白含量由样品中估计的羰基浓度和总蛋白含量计算得出。因此，需要用BCA蛋白试剂盒平行测定蛋白质含量(Pierce，美国)。

体内吸烟者和非吸烟者红细胞蛋白损伤的测定

用Levine等人的方法测定了同样的15名吸烟者和15名非吸烟者红细胞蛋白组分中的蛋白质羰基(18)。采血和再移动血浆后，用0.01M磷酸缓冲盐水(等体积)洗涤红细胞，4℃，10分钟，2000 rpm离心。这个步骤重复了3次。用与红细胞体积相同体积的冷水溶解红细胞。裂解细胞离心后(4℃，10分钟，11000 rpm)，用20% TCA冷溶液沉淀上清。在额外的离心步骤(4°C, 10分钟，6000 rpm)后，沉淀在0.01 M磷酸盐缓冲盐水pH=7中溶解。蛋白测定采用BCA技术(BCA assay, Pierce, USA)。羰基蛋白含量由Levine等(16)按照上述方法测定。蛋白羰基数据以nmol/mg蛋白表示。

吸烟者补充2-羟戊二酸/维生素C/5-羟甲基糠醛肌苷的研究

补充研究对10名吸烟者进行(42.5±6.2年;女8名，男7名;每天8 -12支烟)。洗掉后阶段的2周没有任何维生素的补充,血液收集和10人开始饮酒的2-oxo-glutarate /维生素C / 5-HMF /肌肽(20毫升稀释集中在150 - 200毫升水)一天两次(上午和下午)。在2周和4周后，从这10个人和另外10个人身上采集血液，这些人没有服用抗氧化补充剂。在2周洗脱期后，各组改变补充，并在2周和4周后再次收集。

所有人类血液样本在4°C、10分钟、2000 rpm下离心，获得的血浆在-70°C下储存，直到测量。全部的在活的有机体内使用ELISA技术测量形成的羰基蛋白（K7822；Immundiagnostik AG，Bensheim，德国）。

在体外香烟烟雾自由基对蛋白质损伤的测定

在体外将50mg/mL牛血清白蛋白(BSA)溶于磷酸盐缓冲盐水中，测定香烟烟雾对牛血清白蛋白(BSA)的损伤程度。将4mL牛血清白蛋白(BSA)溶液装入吸液瓶，吸液瓶连接水泵。吸烟前，用1150µL 10mM pH 7.4 PBS(含40µM BHT)稀释两份100µL的BSA溶液，得到4mg/mL BSA溶液。用250µL 20%三氯酸(TCA)溶液移液250µL的4mg/mL蛋白溶液，沉淀1mg蛋白。在吸烟2分钟后，再用TCA稀释和沉淀等量物。玻璃被关闭并在37°C孵育。15、30和60分钟后，取出等价物，稀释并沉淀。所有沉淀样品在5000g下离心3分钟，取上清。将微丸溶解于含6 M胍pH 2.5的10mM DNPH中，室温孵育45分钟。根据Levine等人的研究，用蛋白质羰基测定法分光光度法测定蛋白质损伤(莱文RL羰基测定氧化修饰蛋白。方法Enzymol。1994;233:346-57)。蛋白质羰基数据以nmol/mg表示。

5-HMF 2-ketoglutarate浓度0.106毫米,0.106毫米或0.106毫米在单独用药和联合治疗中抗坏血酸(5-hydroxy-2-furalaldehyde 2-oxo-glutarate 0.069毫米,0.004毫米和0.04毫米抗坏血)溶解在BSA溶液和蛋白质羰基含量前后2、15、30和60分钟估计。

统计数据

统计学意义定义为p<0.05。对于患者和对照组的比较，数值变量采用非配对t检验，分类变量采用卡方检验。学生t检验用于比较测量分数，控制患者和参考组之间显著差异的人口统计学。

统计分析使用IBM“SPSS软件24.0,SPSS公司，芝加哥，伊利诺斯州，美国。

结果

体内吸烟者和非吸烟者血浆和红细胞蛋白损伤的测定

我们用ELISA（Immundiagnostik Ag，Bensheim）测量了吸烟者对非吸烟者的羰基蛋白质含量。如图1所示，吸烟者和非吸烟者之间存在显着差异（448±223 pmol / mg n = 15 vs.n±40 pmol / mg; n = 15; p <0.02）。

图1。吸烟者（n=10）和非吸烟者（n=10）血浆羰基蛋白的比较；*p<0.02。

此外，我们还从红细胞中提取了沉淀蛋白，并将其与Levine等人的分光光度测量进行了比较。吸烟者(26.8±12.9 nmol/mg, n=15)和非吸烟者(12.1±0.3 nmol/mg;n = 15;p<0.001)，如图2所示。

图2。吸烟者（n=10）和非吸烟者（n=10）红细胞羰基蛋白的比较显著效果p<0.001。

吸烟者补充2-羟戊二酸/维生素C/5-羟甲基糠醛/肌肽的研究

为了评估2-酮戊二酸/维生素C/5-羟基甲基糠醛/肌肽的任何保护作用，与未补充任何补充剂的吸烟者相比，10名吸烟者在4周内每天饮用两次。在吸烟者组中，使用ELISA技术对饮用2-酮戊二酸/维生素C/5-HMF/肌肽的吸烟者进行测量，结果显示，与研究开始时相比，2周后羰基蛋白显著增加（357±45 pmol/mg，n=10），而补充4周后羰基蛋白显著减少（228±11 pmol/mg，n=10 vs.273±55 pmol/mg，n=10；n<0.02）进行了测量（图3）。2周后，补充和未补充吸烟组的羰基蛋白含量没有差异（357±45 pmol/mg，n=10，与298±34 pmol/mg，n=10）。补充吸烟者2周和4周后，羰基蛋白含量的差异显著降低，从357±45 pmol/mg降至228±11 pmol/mg（n=10；p<0.001）。另外，与不服用任何补充剂的吸烟者相比，服用补充剂4周后的吸烟者（228±11 pmol/mg，n=10）显著减少（325±45 pmol/mg；p<0.001）。

图3。4周内补充α h®(蓝色条，n= 10)吸烟者和未补充α h®(红色条，n= 10)吸烟者血浆羰基蛋白的比较*补充吸烟者4周前后效果显著(p < 0.02)， **补充吸烟者4周前后效果极显著(p < 0.001)。⁺⁺吸烟者在2周和4周后的效果非常显著(p < 0.001)。4周后补充吸烟者和非吸烟者之间的效果非常显著(p < 0.001)

在体外在2-羟戊二酸盐/维生素C/5-羟甲基糠醛不存在或存在的香烟烟雾自由基下测定蛋白质损害

图4显示了bsa溶液对羰基蛋白的抑制作用在体外主要成分如0.069 mM 2-羟戊二酸酯，0.004 mM 5-羟基-2-糠醛和0.04 mM抗坏血酸。α h®对受损蛋白的还原率为63.3%(2.18±0.34 nmol/mg vs. 5.94 nmol/mg±0.43 nmol/mg;p < 0.001;N =6)， 15分钟后64.7%(2.81±0.31 nmol/mg vs. 7.96±0.79 nmol/mg;p < 0.001;N =6)， 30岁后65.7%(3.39±0.32 nmol/mg vs 9.89 nmol/mg±0.07 nmol/mg;p < 0.001;N =6)， 60分钟后66.6%(3.85±0.63 nmol/mg vs 11.51 nmol/mg±0.94 nmol/mg;p < 0.001;n=6)与对照组BSA溶液比较。 After 15 min. of smoking carbonyl proteins in presence of 2-oxo-glutarate/vitamin C/5-HMF showed a significant increase compared to BSA in absence of 2-oxo-glutarate/vitamin C/5-HMF before smoking (1.99±0.09 nmol/mg vs. 1.83±0.15 nmol/mg; n=6).

图4。BSA在存在（紫罗兰棒）中烟草激进给药前后BSA羰基蛋白的比较或α（蓝棒）。**在存在和不存在α的羰基蛋白之间的高显着效果（p <0.001），⁺⁺烟基给药前后羰基蛋白的影响非常显著(p < 0.001)。

2分钟后。对BSA的直接激进攻击进行2-氧代戊二酸盐/维生素C / 5-HMF的吸烟是有效的，因为与对照BSA相比，可以没有显着。

在体外在没有或存在2-氧-戊二酸、抗坏血酸和5-羟甲基糠醛的情况下测定香烟烟雾自由基对蛋白质的损害

图5显示了在0.106 mM抗坏血酸、0.106 mM 2-羟戊二酸或0.106 mM 5-羟甲基糠醛单独孵育前后香烟烟雾自由基的保护性氧化损伤。在所有培养时间内，三种物质存在的牛血清白蛋白的羰基蛋白含量均比对照牛血清白蛋白显著降低。5-羟甲基糠醛的保护作用最弱，2-氧-戊二酸和抗坏血酸的保护作用最强，见表1。

图5。BSA羰基蛋白在存在（紫罗兰棒）中烟草自由基施用前后的比较或缺乏α的主要成分：维生素C，2-氧缩戊酸和5-HMF。**在存在和不存在0.106mm维生素C之间的羰基蛋白之间的显着效果高（P <0.001），⁺⁺存在和不存在0.106 mM 2-氧-戊二酸对羰基蛋白的影响非常显著(p < 0.001)，^＃0.106 mM 5-HMF的存在和不存在显著影响(p < 0.001)。

表格1。与对照组相比，烟雾自由基存在时维生素c、2-氧-戊二酸和5-羟甲基糠醛羰基蛋白的减少量(%)(每个时间点烟雾自由基存在时羰基蛋白= 100%)

表1	羰基蛋白的还原%
时间(分钟)	BSA +维生素C（0.106mm）	BSA + AKG (0.106mM)	BSA+5-HMF（0.106mM）
2	41岁的4	48岁的5	13日8
15	41岁的8	52岁的3	12、3
30.	42,7	54岁的6	7、8
60	45,0	54,7	10,9

在所有时间点上，2-氧-戊二酸对羰基蛋白含量的降低大于抗坏血酸的降低:吸烟2 min后，2-氧-戊二酸对羰基蛋白含量的降低为48.5%(3.06±0.07 nmol/mg)，而对41.4%(1.85±0.1 nmol/mg);15分钟后:52.3%(3.80±0.22 nmol/mg) vs 41.8%(4.63±0.4 nmol/mg);30分钟后54.6%(4.49±0.1 nmol/mg)对42.7%(5.67±0.53 nmol/mg)， 60分钟后54.7%(5.21±0.75 nmol/mg)对45.0%(6.33±0.50 nmol/mg)。

5-羟基甲基糠醛在2分钟后降低13.8%（5.12±0.34 nmol/mg），15分钟后降低12.3%（6.98±0.31 nmol/mg），30分钟后降低7.8%（9.12±0.32 nmol/mg），60分钟后降低10.9%（10.9±0.63 nmol/mg）。

讨论

尽管在香烟烟雾中发现许多物质会导致有害疾病，如肺癌、口腔鳞状细胞癌(OSCC)或不育症、黄斑变性、糖尿病、动脉硬化或膀胱癌和慢性阻塞性肺病，但烟草烟雾是一种有毒的气相混合物，由多种有机物组成，以及自由基中间体。香烟燃烧产生的烟雾取决于一系列机制，包括通过热解和燃烧产生有毒物质、气溶胶的形成和物理传质过程。因此，从这项调查中可以明显看出，香烟烟雾中含有被认为对吸烟者健康有害的表面结合自由基[2]。当活性氧(ROS)的释放超过内源性抗氧化能力[19]时，就会发生氧化应激。烟草烟雾是自由基和氧化剂的重要外源性来源。由于活性氧的高反应性，这些物质能够通过一系列反应氧化磷脂，通过脂质过氧化形成蛋白羰基[20]。可以证明，香烟烟雾导致人血浆中蛋白质羰基的形成[21,22]。与年龄匹配的非吸烟者相比，吸烟者增加的羰基蛋白作为氧化损伤的标志被Kapaki E等使用低分光光度技术。因此，吸烟者组的结果仅略有升高。我们使用了一种夹心ELISA，其中所有血浆蛋白都与抗血浆蛋白的IgG抗体结合。使用抗DNPH衍生抗体，作为这项新技术中的报告抗体，我们确定吸烟者的数量是健康老年非吸烟者的两倍以上，具有很高的意义。此外，我们还首次在红细胞中检测到大量羰基蛋白。水果和蔬菜摄入量低并不能减少或保护吸烟者体内羰基蛋白的生成[23]，橄榄油酚也不能减少或保护羰基蛋白的生成[24]。我们已经在吸烟者中应用了2-酮戊二酸/维生素C/5-羟基甲基糠醛/肌肽的补充组合，并且可以检测到羰基蛋白的显著减少在活的有机体内与使用上述ELISA技术的非补充吸烟者进行比较。有趣的是，经过两周的补充，我们发现血浆中羰基蛋白的含量更高了，这可能是从组织中溶解的预制羰基蛋白转移到血液中。

众所周知，维生素C能与自由基直接反应，从而防止蛋白质的氧化修饰在活的有机体内(Dal and Sigrist, 2016， #8136)。但在这个反应过程中，它本身被激进化了。因此，为了从这个反应中回收维生素C，我们加入了2-氧-戊二酸、5-羟-甲基糠醛和肌肽，这些已知的还原自由基的物质如过氧化物(H₂O₂，onoo^-)[5,6,25,26]，从而恢复维生素c的抗氧化能力体外研究比较了这些物质在等摩尔浓度下卷烟烟雾孵育BSA的反应。与维生素C相比，2-氧氧化氟化物可以达到来自氧化的最多保护效果，使用5-羟基 - 甲基-Furfur-醛-Aldehyde确定最低的影响。以αAhah®提供的，通过组合所有四种物质来达到最高保护氧化的最高保护，并且与测量的任何单一物质相比，可以高度显着降低3倍或66％的羰基蛋白的量。此外，吸烟后的羰基蛋白的产生几乎停止了。这可能导致协同抗氧化作用。

总之，烟草烟雾含有许多有毒物质和自由基。这一观察表明，在阿尔法h中结合的抗氧化物质对香烟烟雾产生的自由基具有很高的保护作用在体外和在活的有机体内并且意味着未来研究抗氧化剂消耗对多种疾病的保护作用也应该考虑吸烟状况。因此，需要进一步的研究来更好地阐明抗氧化营养素的益处和自由基影响或引起的疾病。

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