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摘要

本研究通过蛋白质组学分析鉴定了GnRH/GnIH诱导的卵巢蛋白，并与未治疗的对照组进行了比较。采用二维凝胶电泳和LC-MS/MS方法进行蛋白鉴定。从每个GnRH/GnIH处理卵巢的25个差异表达点中，我们随机选择18个通过LC-MS/MS鉴定的蛋白点。LC-MS/MS鉴定的14-3-3、prohibitin和超氧化物歧化酶(SOD1)蛋白进一步通过Western blotting进行验证，证实GnRH/ gnih诱导14-3-3、prohibitin和SOD1的表达变化与蛋白质组学观察结果相似。这些选择的蛋白，14-3-3,prohibitin和SOD1，进一步与卵巢的各种活动，如细胞增殖，存活或凋亡标志物相关。在鉴定的18个gnrh诱导蛋白中，9个表达上调，而另外9个表达下调。这一发现表明GnRH通过刺激和抑制蛋白质的表达来起作用。有趣的是，在GnIH诱导的卵巢中，18种蛋白中有15种显著下调，这表明GnIH主要通过抑制参与卵巢活动的蛋白的表达来起作用。因此，本研究表明，许多已鉴定的GnRH/ gnih诱导蛋白可能与卵巢卵泡发育、闭锁、类固醇生成和癌症有关。

关键字

促性腺激素释放激素(gnrh);促性腺激素抑制激素;rf-酰胺相关肽-3 (rfp -3);双向凝胶电泳;细胞凋亡;卵巢癌。

介绍

十肽促性腺激素释放激素(GnRH)或其激动剂(GnRH- ag)是一种主要的调节性神经肽，首次从哺乳动物下丘脑分离出来，参与脊椎动物生殖过程的初级控制[1-3]。包括人类在内的多种哺乳动物卵巢中均存在GnRH和GnRH受体，这有力地说明了GnRH在卵巢内的局部合成和生物作用以及垂体营养作用[4-10]。

GnRH对卵巢的各种活动既有刺激作用，也有抑制作用。在大鼠和小鼠卵巢中，一些研究报道了GnRH和GnRH受体在发情周期中表达的显著变化[9,11]。GnRH通过诱导卵母细胞成熟[12]和卵泡破裂[13]对排卵前卵泡有刺激作用。在较小的卵泡中，GnRH对促性腺激素受体的诱导有抑制作用[14]。在发情期和发情期GnRH浓度的升高表明这种神经肽可能参与了卵巢中卵泡生长、分化和闭锁的选择[9,11]。GnRH及其受体存在于窦卵泡鞘细胞中，提示该神经肽可能参与性腺类固醇生成的调节[8,15]。闭锁卵泡颗粒细胞中存在GnRH及其受体，提示GnRH在小鼠卵巢中诱导卵泡闭锁中的作用[9]。GnRH激动剂的治疗在活的有机体内已被证明可降低颗粒细胞的增殖活性并诱导细胞凋亡[16]。研究发现，GnRH的抗促性腺作用是通过下调大鼠卵巢中LH-和fsh受体的表达以及抑制类固醇生成酶的表达来介导的[9,17,18]。此外，有研究表明GnRH可能对黄体退化过程有纵容作用[19]。在人黄体化颗粒细胞中也发现了GnRH受体mRNA的表达[8]。然而，关于GnRH在哺乳动物卵巢中调节各种生理活动的作用模式尚不清楚。

另一种神经肽，哺乳动物GnIH肽，rf -酰胺相关肽-3 (RFRP-3)及其受体已在恒河猴和小鼠的卵巢中被证实[20,21]。大量研究表明GnIH也是抑制卵巢卵泡发育和类固醇生成的重要卵巢内因子[22,23]。既往研究发现gnih受体为GPR 147和GPR 74两种g蛋白偶联受体[24,25]。gnih受体定位于卵泡膜和颗粒细胞，与较小的生长卵泡相比，其在排卵前卵泡中的表达水平明显较低[9]。GnRH和GnIH的相对丰度主要存在于小鼠发情前期和发情期的窦腔卵泡中，这表明这些神经肽可能参与了卵泡生长和闭锁的选择。小鼠卵巢中GnRH和GnIH的表达提示这两种肽之间可能存在相互作用[9]。我们早期的研究表明，从出生到衰老，性腺中GnRH和GnIH水平呈正相关[26]。进一步研究发现，GnIH通常会抑制GnRH的分泌和作用[21,22]。

迄今为止的研究表明，GnRH和GnIH都是哺乳动物卵巢中重要的自分泌/旁分泌因子，调节卵泡发育、细胞凋亡、黄体生成素和类固醇生成。GnRH和GnIH也被认为是多种生殖功能障碍的可能治疗方法[10,27]。我们最近的研究表明，GnRH可以恢复多囊卵巢(pco -小鼠)的排卵，因此可以用作治疗多囊卵巢综合征的治疗剂[10]。GnRH也可用于治疗促性腺功能低下和抑制生育。由于GnIH是第一个被发现的对性腺功能有直接抑制作用的神经肽[20,21]，GnIH可能会发展成为抗生育药物[10]。然而，GnRH和GnIH在卵巢中的许多功能仍不清楚。在GnRH/GnIH的作用下，卵巢发生了特定的分子变化，这可能为这些神经肽调节卵巢各种活动的未知过程提供了知识。为了鉴定卵巢蛋白在GnRH或GnIH治疗下的表达变化(诱导或抑制)，本研究采用了由二维凝胶电泳和LC-MS/MS组成的蛋白质组学方法。为了验证蛋白质组学数据，通过Western blot分析评估了选定蛋白在小鼠卵巢中的表达水平。

材料与方法

抗体和试剂

化学物质和抗体:小鼠RFRP-3长型(VNMEAGTRSHFPSLPQRF-NH₂)，小鼠GnIH同源物，由日本东京早稻田大学生物系Tsutsui教授提供[28]。本研究使用的GnRH- ag为([DTrp6, Pro9-NEt] GnRH)。由美国国立卫生研究院避孕科Marvin Karten博士提供。本研究中使用的所有普通化学品均购自印度新德里默克公司。所用抗体的详细情况见表1。

表1。用于western blot的抗体细节

抗体	目标物种	单克隆/多克隆培养种	源	浓度(用于免疫印迹)
Prohibitin	人类	兔子;多克隆	GenScript (A0070640)	1:1500
SOD1	人类	兔子;多克隆	GenScript (A0100540)	1:3000
PARP-1	人类	兔子;多克隆	Santa cruz Biotechnology Inc (H-250,SC 7150)	1:1000
Caspase-3	人类	兔子;多克隆	圣克鲁斯生物技术公司 公司(H-277, SC 7148)	1:1000
PCNA	人类	兔子;多克隆	赛默飞世尔科技公司， 洛克福德，美国，PA1-38424	1:1500
BCl2	人类	兔子;多克隆	Santa cruz Biotechnology Inc. (H-61, SC 7938)	1:1500
肌动蛋白	β肌动蛋白	鼠标;单克隆	Sigma A2228, 128K4813	1:20,000
二次	兔子	山羊;多克隆	生物基尼	1:4000

动物

所有实验均按照印度巴纳拉斯印度教大学部门研究委员会批准的原则和程序进行。老鼠(亩骶在动物舍光周期控制室(光照12 h，黑暗12 h)恒温(24±2℃)和恒湿条件下饲养，饲喂商品食品(Pashu Aahar Kendra, Varanasi，印度)和自来水随意．实验采用体重相近、至少连续2个周期(4 ~ 5 d)的成年(12周龄)雌性小鼠。清晨行阴道细胞学检查，检查小鼠的发情前期。阴道细胞学检查显示有核上皮细胞的存在证实了骑车小鼠的发情前期[29]。将发情周期正常的小鼠随机分为三组。

实验设计

为了进行实验，在发情周期的发情前期，立即解剖小鼠卵巢(n=30)，并进行实验在体外在5% CO的湿化气氛中，37℃培养24 h₂．卵巢分为GnIH (100 ng/ml)组、GnRH-Ag (100 ng/ml)组和对照组(仅培养基)。取出卵巢，用PBS洗涤三次，保存在- 80°C，直到用于2-DE和免疫印迹，其中培养基用于激素测定。为了得到同样的结果，实验重复了三次。将两组2-DE凝胶的二维凝胶电泳斑点与对照组比较后，用PDQuest图像分析软件进行分析。由学生t检验(p<0.05)进行串联质谱鉴定。在25个差异表达点中，每组选择18个采用非靶向方法进行LC-MS/MS分析。

蛋白质组学研究的验证

为了验证蛋白质组学研究，LC-MS /MS分析鉴定的一个蛋白质点通过Western blot分析得到证实。之所以选择14-3-3 zeta/delta蛋白进行进一步研究，是因为它参与多种细胞过程的调控，如氧化应激、炎症、凋亡、细胞增殖和存活[30]。14-3-3可能参与小鼠卵巢发生的各种生理变化。除了14-3-3 zeta/delta，我们还选择了prohibition和SOD1来观察卵巢中发生的变化，以便进一步验证我们的结果。除此之外，卵巢颗粒细胞呈闭锁，可见凋亡标记物和细胞增殖标记物。因此，为了检查卵巢细胞中发生的变化，本研究进行了验证GnRH和GnIH是否调节凋亡标志物(Caspase-3和PARP-1)和生存因子(BCl)的表达₂和PCNA)。为了实现这一目标，我们对在发情前期收集的小鼠卵巢进行了凋亡标记和细胞增殖标记的免疫印迹。在此基础上，我们进行了14-3-3、prohibitin、sod1与凋亡和细胞存活标记蛋白调控卵巢生理的相关性研究。为了做到这一点，小鼠卵巢收集后在体外对14-3-3 zeta/delta、Prohibitin、sod1、caspase-3、PARP-1、PCNA和BCl进行免疫印迹分析₂蛋白质。通过western blots密度分析获得卵巢中蛋白质的相对浓度。14-3-3 zeta/delta蛋白、prohibition - tin、SOD1与凋亡标志物caspase-3、PARP-1、细胞增殖标志物(PCNA)、细胞存活标志物(BCl -1)浓度变化的相关性₂)进行分析。

在体外研究

孕前期卵巢用于在体外因为它们含有许多腔卵泡，并且在所有群体中使用的卵巢阶段保持均匀。采用小剂量麻醉乙醚斩首处死成年雌性小鼠30只。在Dulbecco Modified Eagle 's medium (DMEM)培养基中迅速解剖卵巢并清除任何粘附的脂肪组织和输卵管;Himedia，孟买，印度)，含青霉素(250 U/ml)和硫酸链霉素(250 μg/ml)。卵巢按照前面描述的方法培养[22,31]。培养基为DMEM(含丙酮酸钠和l -谷氨酰胺)和Ham’s F-12 (1:1;v: v) (Himedia，孟买，印度)，含青霉素(100 U/ ml)，硫酸链霉素(100 μg/ml)和BSA (0.1% w/v, Sigma Chemicals Co.，圣路易斯，美国)。在含95%空气和5% CO的湿润环境中，用1ml培养基培养完整的子房(培养板中每孔一个)₂在37℃下保持pH 7.4 24 h。神经肽的剂量是根据我们实验室先前进行的研究选择的[22,31]。GnIH (rfp -3 LF) 100 ng/ml、GnRH 100 ng/ml和对照(不含任何神经肽)，每孔培养板的培养液总量为10 μl/ml。培养后将卵巢聚集在一起，用PBS洗涤几次，冷冻-80°C进行二维凝胶电泳和Western blot分析。保留培养基进行激素试验。每个治疗组进行三次试验，结果相同。

双向凝胶电泳

之后采集卵巢在体外1 M Tris (pH 7.6)，含1µg/ml抑蛋白蛋白，100µg/ml PMSF。匀浆后的蛋白在冰冷的丙酮中沉淀(样品:丙酮;1:10)在-20ºC下过夜，然后在4°C下以10,000 rpm离心5分钟。丙酮在离心后被丢弃，并允许球团干燥，直到丙酮的气味消失。然后将颗粒重悬在补液缓冲液中(7M尿素，2M硫脲，4% CHAPS, 50 mM DTT和0.2%两性石)。用Bradford法测定蛋白质含量。条带(pH 4-7, 11cm)被动再水化16小时，然后使用PROTEAN IEF细胞(Bio-Rad)进行40000 V-h的IEF。IEF完成后，用两种碱缓冲液(50 mM Tris/Cl, 2% (v/v) SDS, 6 M尿素和20%甘油)平衡试纸条，首先含有1.4 M二硫苏糖醇(DTT)，然后含有1.3 M碘乙酰胺。第二次元在12% SDS-PAGE上运行。用CBBG-250染色前，将凝胶洗涤三次，洗涤15分钟。 For quantification purposes, the stained gels were scanned (GS- 800 Densitometer, Bio-Rad) and analyzed with PDQuest image analysis software (Bio-Rad) followed by LC-MS/MS. Each treatment group was run in triplicate with the same results.

LC-MS/MS从2D凝胶点

从25个点中随机选择18个点，采用热翅宁LTQ质谱联用mulultimate 3000纳米流高效液相色谱进行LC-MS/MS鉴定。2D凝胶的斑点通常储存在干净的埃彭多夫管中(用质谱级乙腈冲洗)，以便运输或储存。斑点(凝胶塞)在100%乙腈中洗涤三次，每次洗涤至少10分钟，以去除任何污渍。最后一次清洗后，将斑点置于速溶真空中干燥20分钟。干燥后的斑点在胰蛋白酶消化缓冲液中再水化(50 mM碳酸氢铵;Bic)。首先用10 mM的二硫苏糖醇(DTT)在56℃下还原至少30分钟，然后在室温下用15 mM的碘乙酸在暗处烷基化30分钟。然后用质谱级胰蛋白酶20 ng/µl在37℃下消化4小时。在分析之前，将样品加入0.1%的甲酸进行酸化[32]。

2D凝胶上的斑点在mulultimate 3000纳米流HPLC上使用60分钟的LC/MS运行进行分析。将样品以5µl/min的速度加载到捕集器(C18 PepMap 100, 300µm X 5mm, Thermo)上，持续5分钟。然后切换多口阀，以200 nl/min的流速，以5%-30%的乙腈梯度洗脱到反相柱上，洗脱时间为10分钟。柱上的洗脱液通过纳米喷雾直接喷射到LTQ离子阱质谱仪中。使用X calibur 2.2软件(Thermo)收集光谱，阈值设置为200。使用Proteome Discoverer 3.1软件(Thermo)在小鼠Swiss-Prot数据库中检索光谱。使用渗透选择算法，将错误发现率设置为5%，以选择最佳数据库命中(表2和3)。

表2。斑点分析细节:GnIH治疗组

表3。斑点分析细节:GnRH处理组

免疫印迹

将2 ~ 3个子房放在悬浮缓冲液中(0.01 M Tris pH 7.6, 0.001 M EDTA pH 8.0, 0.1 M NaCl, 1µg/ml抑蛋白蛋白，100µg/ml PMSF)中进行超声匀浆，得到10% (w/v)的匀浆。此外，蛋白质提取和免疫印迹在我们的研究中进行了前面的描述。蛋白质定量采用Lowry的方法。等量蛋白(40µg)上SDS-PAGE(10%)电泳。然后将分离的蛋白在PVDF膜(Millipore, Billerica, MA, USA)上在4°C下转移过夜。非特异性部位用tris缓冲盐水(TBS)阻断60分钟;Tris 50 mM (pH 7.5)， NaCl 150 mM, 0.02% Tween 20)，含5%脱脂干乳，然后用14-3-3 zeta/delta抗体孵育，稀释倍数为1:4000;SOD1抗体按1:3000稀释;禁止抗体，PCNA和BCl₂抗体:1:1500;PARP-1和Caspase-3按1:1000的稀释比例(表1)在室温下稀释1小时，然后洗涤30分钟。用辣根过氧化物酶偶联的二抗(1:40 000 v/v)进行免疫检测，然后用PBS (0.2 M PBS, pH = 7.4)洗涤三次，每次10分钟。最后，用增强型化学发光(ECL)检测系统(Bio-Rad, USA)检测信号。Ponceau S染色或β-actin (Sigma)均证实负载相等。实验重复了三次，结果都一样。

微

随后扫描x射线片，然后通过密度测定法定量(Image J . 1.36, NIH, USA)。用Ponceau S染色和/或β-肌动蛋白评估装载和转移的质量。所有免疫印迹归一化为β-肌动蛋白。数据以每种肽的三个印迹的±S.E.M.表示。

孕酮测定

我们还测量了黄体酮，因为在发情前期，黄体酮是诱导退化黄体细胞凋亡所必需的[33]。孕酮激素测定采用LDN (Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG)酶联免疫吸附测定试剂盒。取25µl试样，按厂家说明处理。

统计分析

采用SPSS软件16 for Windows (SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)对不同组的数据进行比较，采用单因素方差分析(ANOVA)和Duncan’s多量程事后检验。所有数据均以均数±SEM表示。数据被认为是有意义的，如果p< 0.05。

结果

小鼠卵巢蛋白质组学分析在体外不管是GnRH还是GnIH

通过二维凝胶电泳和PDQuest分析来评估小鼠卵巢差异表达蛋白在体外与对照卵巢的蛋白质谱相比，GnRH或GnIH。胶体CBBG-250染色后，对照卵巢出现681个斑点。有25个差异表达蛋白点，我们从每个处理组中选择了18个差异表达蛋白点，采用非靶向方法进行LC-MS/MS分析。(图1 - 3)

图1所示。代表性的2-DE凝胶图像显示效果在体外GnIH (100 ng/ml)对发情前期小鼠卵巢蛋白表达谱的影响。蛋白质组学谱存在显著差异。18种蛋白中有15种显著下调，其余3种蛋白在对照卵巢(神经肽缺乏)中显著上调。箭头表示显著上调或下调的蛋白点

图2。代表性凝胶图像显示效果在体外GnRH (100 ng/ml)对发情小鼠卵巢蛋白表达谱的影响。在鉴定的18个gnrh诱导蛋白中，9个蛋白表达上调，9个蛋白表达显著下调。箭头表示显著上调或下调的蛋白点

图3。这个数字表示的影响在体外GnIH/GnRH对发情小鼠卵巢蛋白表达谱的影响。通过学生t检验(p<0.05)，以控制卵巢(神经肽缺乏)。14.3.3、prohibitin和SOD-1分别用红色标记的a、b、c三个区域表示

质谱法(LC-MS/MS)鉴定GnRH或GnIH处理小鼠卵巢差异表达蛋白斑点

每18个差异表达(选择)蛋白点从小鼠卵巢分离在体外用GnRH或GnIH与对照卵巢的蛋白谱进行LC-MS /MS分析，然后使用Proteome Discoverer 3.1软件(Thermo)对小鼠进行数据库检索，Swiss-Prot数据库。每个蛋白质点产生一个或两个重要的命中，通过使用反向数据库的错误发现率为1.0和5.0%来确定。当发现20%的序列覆盖率或从数据库搜索中首次命中时，认为蛋白质鉴定是可靠的。鉴定的蛋白如表2所示。

差异表达蛋白的Western blot分析验证蛋白质组学研究

为了验证2d蛋白质组学分析的数据，我们选择了14-3-3、prohibitin和SOD1三个蛋白。这些选择的蛋白质在卵巢处理中发生了显著的变化(或上调或下调)在体外与对照卵巢的GnRH或GnIH蛋白谱比较。Western blot法对小鼠卵巢14-3-3、prohibitin和SOD 1蛋白进行密度分析，分别在~ 30,30和18kda处出现单一免疫反应带，结果如图4-6所示。

图4。这个数字表示的影响在体外GnIH/GnRH对发情小鼠卵巢蛋白表达谱的影响。这里将14-3-3的凝胶图像切除并缩小，看到与原始凝胶的变化如图3所示，并指定为一个．14-3-3蛋白Western blotting验证蛋白斑点。箭头为14-3-3蛋白斑。数值用平均值±SEM表示。值(*)显著不同(p<0.05)。IRDV =综合相对密度值

图5。这个数字表示的影响在体外GnIH/GnRH对发情小鼠卵巢蛋白表达谱的影响。将prohibitin凝胶图像切除并缩小，可以看到与原始凝胶的变化，如图3所示，指定为b．蛋白斑点用禁止蛋白Western blotting进行验证。箭头为禁止蛋白斑点。数值用平均值±SEM表示。值(*)显著不同(p<0.05)。IRDV =综合相对密度值

图6。这个数字表示的影响在体外GnIH/GnRH对发情小鼠卵巢蛋白表达谱的影响。将SOD1的凝胶图像切除并缩小，看到与原始凝胶的差异，如图3所示，指定为c。用SOD1蛋白的Western blotting对蛋白斑点进行验证。箭头为SOD1蛋白点。数值用平均值±SEM表示。值(*)显著不同(p<0.05)。IRDV =综合相对密度值

的影响在体外GnRH和GnIH对卵巢孕酮合成的影响

GnRH和GnIH对卵巢孕酮合成的影响在体外如图7所示。与对照组相比，这两种处理都导致黄体酮合成显著减少。观察到，与GnRH治疗组相比，GnIH治疗组的黄体酮合成减少更多。

图7。具有代表性的图表显示的影响在体外GnIH/GnRH治疗对孕激素从发情前期卵巢释放的影响并与对照组比较。数值用平均值±SEM表示。值(*)明显较低(p<0.05)

的影响在体外GnRH和GnIH对卵巢卵泡生长和闭锁标志物的影响

目的:探讨GnRH/GnIH对大鼠卵泡生长标志物(BCl)表达的影响₂卵巢处理后检测卵泡闭锁标志物caspase-3、PARP-1在体外这些神经肽(GnRH/GnIH)结果显示，与对照卵巢相比，GnRH或GnIH处理的卵巢中caspase-3的表达显著增加。的在体外GnIH处理后，整体和裂解型PARP-1的表达均略有增加，而GnRH处理后，整体PARP-1的表达较对照组显著增加(图8)₂与对照组相比，GnRH处理组卵巢PCNA显著升高，BCl显著升高₂与对照组相比，GnIH处理的卵巢中PCNA表达显著升高(图9)。

图8。代表性的数字说明了……的影响在体外GnIH/GnRH对卵巢凋亡标志物(PARP-1和caspase-3)蛋白表达的影响。数值用平均值±SEM表示。(a)免疫印迹分析显示，对照组小鼠卵巢中PARP-1蛋白表达增加。(b)免疫印迹分析显示，与对照组相比，caspase-3蛋白在处理小鼠卵巢中的表达增加。数值用平均值±SEM表示。IRDV =综合相对密度值

图9。代表性的数字说明了……的影响在体外GnIH/GnRH对卵巢细胞生存标志物(BCl)表达的影响₂)和细胞增殖标志物(PCNA)。数值用平均值±SEM表示。(a)免疫印迹分析显示BCl表达升高₂与对照组相比，GnRH处理小鼠卵巢中BCl的表达降低₂在GnIH治疗组卵巢中。(b)免疫印迹分析显示，与对照组相比，治疗组卵巢PCNA蛋白表达增加。数值用平均值±SEM表示。值(*)显著不同(p< 0.05)，治疗组显著高于对照组。IRDV =综合相对密度值

的影响在体外GnRH和GnIH对卵巢14-3-3、prohibitin和SOD-1蛋白表达的影响及其与卵泡生长标志物(PCNA和BCl)的相关性₂)、闭锁(PARP-1和caspase-3)和孕酮合成

为了达到这个目的，对卵巢进行了治疗在体外并检测14-3-3蛋白、禁止素、SOD-1、PCNA、BCl的表达变化₂， PARP-1和caspase-3蛋白的表达与对照卵巢中这些蛋白的表达比较。14-3-3、prohibitin、SOD-1表达变化与PCNA、BCl表达变化相关₂PARP-1和caspase-3蛋白与孕酮水平的变化有关。结果如表4所示。的在体外GnIH处理后，整体和裂解型PARP-1的表达均略有增加，而GnRH处理后，整体PARP-1的表达较对照组显著增加。BCl表达的变化₂与对照组相比，GnRH治疗组卵巢PCNA显著升高，BCl显著升高₂与对照组相比，GnIH处理的卵巢中PCNA表达明显升高(表4)。

表4。14.3.3 zeta/delta、Prohibitin、SOD 1、凋亡标志物(全PARP-1、裂解PARP-1和Caspase-3)、细胞增殖(PCNA)和细胞存活标志物(BCl)变化的相关性研究₂)通过对发情前期小鼠卵巢细胞的处理在体外不同肽GnIH和GnRH-Ag，剂量分别为100 ng/ml和对照(不含任何肽)

	Prohibitin	SOD - 1	PARP-1 w	PARP-1 c	Caspase-3	基类库2	PCNA
14.3.3ζ/δ	-0.53115	＃	＃	-0.80103	＃	0.603508	＃
Prohibitin	NA	0.696654	0.917684	0.932667	0.997538	＃	0.999279
SOD - 1		NA	0.924342	＃	0.745245	0.918004	0.723394
PARP-1 w			NA	0.712568	0.943285	0.697234	0.932109
PARP-1 c				NA	0.905076	＃	0.918296
Caspase-3					NA	＃	0.999482
基类库2						NA	＃
PCNA							NA

注:#表示不显著;数据是重要的p< 0.05

讨论

几种哺乳动物的卵巢中不仅存在GnRH和GnIH的成熟肽mrna，还存在它们的受体，这清楚地表明这些神经肽在卵巢中有局部合成和作用[9,19,34]。卵巢内GnRH和GnIH的产生被这些神经肽对卵巢功能的直接影响所加强，如类固醇生成、卵泡生长、闭锁和黄体溶解。然而，GnRH和GnIH调节卵巢这些功能的机制迄今尚未得到详细评估。据我们所知，这是第一个研究GnRH和GnIH诱导小鼠卵巢中各种功能蛋白表达变化的研究。本研究旨在收集有关功能蛋白的信息，这些功能蛋白可能对调节GnRH/GnIH在小鼠不同卵巢活动中的作用具有潜在的重要作用。

随机选取GnRH或gnih处理卵巢各蛋白谱中的18个位点，与未处理对照卵巢相比，这些位点的表达差异最显著。随后用LC-MS/MS对这些选定的蛋白点进行分析。比较用GnRH或GnIH处理的卵巢之间蛋白质表达的变化，可以识别参与特定调节活动的蛋白质，这些神经肽通过这些活动调节不同的卵巢功能。所鉴定的蛋白或上调或下调，被认为参与多种卵巢过程，包括细胞周期调节、细胞增殖、细胞凋亡、信号机制、反应性氧化应激调节、类固醇生成、卵母细胞成熟以及卵巢癌和肿瘤发展的调节。结果进一步表明，许多这些蛋白在用GnRH或GnIH处理的卵巢中普遍表达。这些观察结果表明，GnRH和/或GnIH都通过一些共同的级联信号通路起作用，也可能调节一些共同的生物效应。在GnRH或GnIH处理的卵巢中显著表达的常见蛋白包括膜联蛋白a5、14-3-3蛋白、半乳糖凝集素-1、原肌球蛋白α -1链、原肌球蛋白β -1链、肾上腺素还毒素和磷脂酰乙醇胺结合蛋白。

Western blot和蛋白质组学分析结果显示，与对照组相比，GnRH和GnIH处理的卵巢14-3-3的表达显著下调，而prohibition的表达显著上调。相比之下，SOD-1蛋白在GnRH处理的卵巢中表达显著上调，而在GnIH处理的卵巢中与对照卵巢相比，SOD-1蛋白的表达没有显著变化。western blot分析发现，GnRH或GnIH处理卵巢14-3-3蛋白、prohibitin和SOD-1蛋白的表达率变化与蛋白质组学分析中这些蛋白的表达率变化具有显著相关性。因此，Western blot分析结果验证了蛋白质组学数据。

本研究进一步评估了GnRH或gnih诱导的14-3-3蛋白、prohibition - tin和SOD-1蛋白表达的变化及其与小鼠卵巢不同活性的相关性。本研究结果显示卵巢14-3-3蛋白浓度变化与细胞存活标志物(BCl)浓度变化有显著相关性₂)，但与对照组相比，GnRH或GnIH处理的卵巢中凋亡标志物(PARP-1)呈负相关。GnRH在颗粒细胞凋亡中的调节作用早前已得到很好的证实[16]。用GnRH治疗在活的有机体内增加大鼠胃窦前和胃窦卵泡颗粒细胞[19]和黄体[35]中的DNA片段化，这是细胞凋亡的标志。与GnRH类似，GnIH也是导致卵泡凋亡的重要卵巢内因子[22]。基于这些发现，我们可以推测GnRH和/或GnIH诱导卵巢14-3-3蛋白表达降低可能是抑制存活标志物和增加凋亡活性的原因。这些发现提示GnRH或gnih诱导的caspase-3、PARP-1和PCNA蛋白表达增加可能是卵巢细胞凋亡活性和细胞增殖增加的原因。Prohibitin是一种高度保守的线粒体蛋白，与黄体细胞凋亡(黄体溶解)有关[36]。先前的研究也证明了prohibition tin可能对未分化的颗粒细胞具有抗凋亡作用，从而导致细胞增殖速率增加[36]。当卵泡发育到早期或大中期时，在卵巢中观察到更强烈的禁止素表达。这提示GnRH可能在颗粒细胞增殖中起作用。Prohibitin对肿瘤具有抗增殖作用，具有抑瘤作用[37]。这些发现表明，GnRH诱导的SOD1水平升高可能是卵巢细胞存活和增殖标志物增加的原因。 This observation is in agreement with the earlier findings that SOD1 is required for the normal development of antral follicles and corpus luteum [38]. In an earlier study, the SOD1 alone, even in the absence of FSH, was shown to inhibit apoptosis in cultured large antral follicles [39]. In ovary SOD1 are normally expressed in theca cells of the antral follicles [40] and plays an important role in the protection of granulosa cells or theca cells from superoxide radicals generated during the increased steroid synthesis and active follicular development [41]. It has earlier been shown that the insufficient level of SOD1 may cause apoptosis in granulosa cells and follicular atresia [42].

在本蛋白质组学研究中选择和鉴定的大多数GnRH或gnih诱导的差异表达卵巢蛋白被证明与细胞增殖、凋亡、癌症的发生和进展有关[43]。大多数这些蛋白，如动力蛋白、凝集素、富含at的相互作用结构域蛋白、动力蛋白、白细胞介素-1受体相关激酶、Src家族激酶抑制剂，在使用GnIH治疗后在卵巢中下调，并且先前已被证明与癌症的发生和进展有关。最近已经证实了动力蛋白-1在癌症发生中的作用[44]。已有研究表明，dynamin-1可引起癌细胞的增殖和转移。gnih诱导的动力蛋白-1蛋白下调可能保护卵巢免于癌变。gnih诱导的半乳糖凝集素-1是一种多价碳水化合物结合蛋白，通过交联肿瘤微环境中的糖蛋白介导恶性细胞活动[45]。半乳糖凝集素-1在多种组织中发挥着独特的生物学作用，参与细胞迁移、分化、增殖和凋亡等过程[46-49]。此外,在体外研究表明半乳糖凝集素-1对猪卵巢颗粒细胞增殖有促进作用[50]。半乳糖凝集素-1在调节女性生殖系统炎症中也起着重要作用，并可能与多种病理状况有关，如子宫内膜异位症[50]。随后的研究表明，半乳糖凝集素-1在人卵巢癌细胞中的表达增加，支持半乳糖凝集素-1在调节癌细胞中的作用[51]。本研究发现了另一种卵巢蛋白-富含at的相互作用结构域含蛋白(ARID)，该蛋白在GnIH治疗后下调，被认为是人子宫内膜的肿瘤抑制因子。ARID经常发生突变，并参与卵巢透明细胞癌的发病机制[52,53]。本研究显示，GnIH在卵巢中可下调染色体相关蛋白激酶。最近，通过协调有丝分裂和细胞分裂，驱动蛋白在肿瘤发生和进展中的重要性已经变得明显[54]。白细胞介素-1受体相关激酶1部分负责il -1诱导的转录因子nf - κ B上调，并可能在卵巢癌症[55、56]。已知IL-1在卵巢癌和其他实体瘤的发生中起关键作用[57]。Src家族激酶成员也被证明在许多实体瘤类型的发展中起重要作用[58]。本研究在卵巢中发现gnih诱导的Src家族激酶抑制剂蛋白表达下调。目前的观察结果支持了先前提出的Src家族激酶抑制剂可用于治疗实体瘤的建议[59]。我们的研究结果表明，gnih诱导的蛋白抑制，如动力蛋白-1、半乳糖凝集素-1、动力蛋白、白细胞介素-1受体相关激酶、Src家族激酶抑制剂和ARID，主要参与保护癌变，因此这些蛋白是卵巢癌治疗的新靶点。本研究结果为进一步揭示卵巢癌变机制提供了理论依据。

GnRH作为卵巢表面上皮和卵巢癌细胞增殖的负调节因子的作用早前已被证实[60,61]。然而，GnRH和GnIH调节卵巢癌细胞的确切机制仍有待阐明。目前的研究表明，一些卵巢蛋白在GnIH或GnRH治疗后被上调，并被发现与癌症的发展有关。这些卵巢蛋白包括膜联蛋白A5、同源盒蛋白-2和补体组分1 Q亚组分结合蛋白。本研究显示，与未处理的对照卵巢相比，经GnRH/GnIH处理的卵巢中膜联蛋白A5的表达显著上调。目前的观察结果证实了早期的研究，即GnRH治疗刺激垂体促性腺激素和卵巢黄体细胞中膜联蛋白A5的合成[62]。随后的研究表明，膜联蛋白A5在包括垂体、甲状腺、肾上腺皮质、卵巢和睾丸在内的许多内分泌腺体中表达[63]。已报道的GnRH和膜联蛋白A5在不同细胞类型中的关系表明，在用GnRH治疗后，膜联蛋白A5具有共同的作用。本研究首次证实了经GnIH治疗后卵巢膜联蛋白A5表达的变化。膜联蛋白A5是一种钙磷脂结合蛋白，可抑制PKC和PLC，与细胞增殖有关[64]。 It has been suggested that GnRH induced annexin A5 via PKC may result in the inhibition of cell proliferation in uterus [65]. The presence of GnRH, GnIH and GnRH receptor are well documented in the granulosa cells [9]. It is likely that GnRH/GnIH via annexin A5 by modulating cell proliferation may participate in regulation of follicular growth and atresia [62]. Because earlier study also showed the presence of GnRH and annexin A5 in the CL, GnRH and annexin A5 may be involved in luteolysis as suggested [62]. Thus, annexin A5 (or annexin-V) may be considered as a biomarker for the effect of GnRH/GnIH in the ovary. Shibata等．[64]报道膜联蛋白- v参与子宫内膜癌细胞的抗增殖机制。因此，GnRH或gnih通过PKC诱导的膜联蛋白v上调可能参与了卵巢的抗增殖作用。GnRH也激活卵巢癌细胞中的PKC[66]。既往研究也表明，GnRH诱导PKC活化可抑制卵巢癌的增殖[67]。由于膜联蛋白A5抑制PKC和PLC，因此有人认为GnRH/ gnih诱导的膜联蛋白A5表达上调可能与癌症的抗增殖机制有关[65]。

目前的蛋白质组学数据还发现，在使用GnIH或GnRH治疗后，卵巢中同源盒嵌合蛋白和补体组分1q亚组分结合蛋白(CIQBP)等蛋白的表达显著上调，它们可能直接或间接地与卵巢癌的发生有关。本研究显示，与对照组相比，GnIH处理的卵巢中同源盒蛋白的表达显著上调。Engrailed是同源盒基因家族的成员，编码一种在早期发育过程中至关重要的转录因子。虽然有报道称许多同源盒型基因在卵巢癌中异常表达，但其在卵巢肿瘤发生中的功能意义还有待进一步研究[68]。GnRH作为卵巢表面上皮细胞和卵巢癌细胞增殖调节因子的作用已被充分证实。本研究显示，与对照卵巢相比，经GnRH处理的卵巢中C1QBP蛋白显著上调。C1QBP表达的增加与肿瘤进展的增加有关。C1QBP还与已知的增殖标志物PCNA的表达相关。下调C1QBP表达可显著降低T47D细胞的增殖和生长[69]。同源盒嵌合蛋白和补体组分1q亚组分结合蛋白作为卵巢癌生物标志物的潜在作用有待进一步研究。

该研究证实了早期的研究结果，表明GnRH/GnIH参与卵巢类固醇生成的调节，尽管这些神经肽影响类固醇生成的机制尚不清楚。在本蛋白质组学研究中发现的GnRH/ gnih诱导的与类固醇生物合成相关的差异表达蛋白包括肾上腺素还蛋白、SOD1、半乳糖凝集素-1、白介素-1 α相关激酶。肾上腺素还蛋白是一种铁硫蛋白，存在于类固醇生成组织的线粒体中，作为线粒体细胞色素P450(包括胆固醇侧链切割酶P450scc)的电子传递中间体参与类固醇生成[70]。由于在卵巢中发现了两种形式的磷酸化和未磷酸化的肾上腺素，这两种形式都可以与细胞色素P450scc结合。未磷酸化的肾上腺素还可作为孕烯醇酮合成的竞争性抑制剂。磷酸化皮质铁氧还蛋白参与所有类固醇激素的生物合成。有报道称颗粒细胞中存在半凝集素-1[71]。此外，半乳糖凝集素-1介导抑制fsh诱导的P450_{鳞状细胞癌}和3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)基因转录已被报道。这些发现表明半乳糖凝集素-1参与卵巢类固醇合成的负调节[50,72]。白细胞介素-1受体相关激酶在产生il -1诱导的信号转导中起重要作用，通过抑制3β-HSD活性介导卵巢甾体生成的抑制作用，并可能积极参与卵泡闭锁和黄体溶解的尚未解之谜的过程[55,56]。本研究显示，GnRH处理后，卵巢中肾上腺素还毒素、SOD1和半乳糖凝集素-1均上调，而GnIH处理后，这些蛋白均下调。然而，本研究显示卵巢处理后黄体酮合成显著下降在体外不管是GnRH还是GnIH造成这种差异的原因尚不清楚，需要进一步调查。在我们早期的研究中，卵巢治疗在体外GnRH或GnIH通过直接抑制3β-HSD的表达而降低孕酮合成[22,34]。

本研究显示GnRH对卵巢活动既有刺激作用，也有抑制作用。在本蛋白质组学分析中鉴定的18种GnRH诱导蛋白中，与对照卵巢中这些蛋白的水平相比，其中9种显着上调，而其他9种显着下调。这些观察结果表明，GnRH通过刺激和抑制蛋白质的表达来调节卵巢活动。GnRH上调的蛋白包括FAM 117B、肾上腺素还氧素、膜联蛋白A5、磷脂酰乙醇胺结合蛋白、半乳糖凝集素-1、禁止素、ATP合酶、SOD1，这些蛋白主要与卵巢细胞增殖、凋亡和类固醇生成的调控有关。本研究的结果支持了早期的研究结果，即GnRH在调节颗粒细胞凋亡和黄体溶解中的作用[16,24]。有趣的是，用GnIH处理的卵巢对蛋白质的表达有抑制作用。在分析的18种蛋白质中，与对照组相比，其中15种蛋白质表现出显著的下调。目前的研究结果表明，GnIH主要通过抑制参与卵巢各种活动的蛋白质的表达在卵巢中起作用。经GnIH处理的卵巢部分蛋白如annexin 5A、homeobox-engrailed和nesprin2的表达均上调。这些蛋白与细胞信号传导、增殖和癌变有关。 Kif4 was shown to express in oocyte during meiosis [73]. Thus, GnIH-induced down-regulation of Kif4 protein may suggest the inhibition of oocyte maturation in mice. GnRH induced increased synthesis of phosphatidylethanolamine-binding protein (PE) regulates autophagy, whereas GnIH-induced decreased synthesis of PE may increase the production of ROS and induce cell-death [74]. GnIH-induced decreased the synthesis of N4BP2, which plays a role in DNA repair.

这些发现表明GnRH通过刺激和抑制卵巢中蛋白质的表达来起作用。有趣的是，在GnIH诱导的卵巢中，18种蛋白中有15种显著下调，这表明GnIH主要通过抑制目前参与正在进行的卵巢活动的蛋白的表达来起作用。大多数鉴定的GnRH/ gnih诱导蛋白被认为参与多种卵巢功能，包括细胞周期调节、细胞增殖、细胞凋亡、信号机制、反应性氧化应激调节、类固醇生成、卵母细胞成熟以及卵巢癌和肿瘤发展的调节。在本研究中发现的许多GnRH/ gnih诱导的差异表达蛋白可能与癌症的进展和发展有关。因此，本研究结果表明，GnRH或gnih诱导的卵巢蛋白变化可能影响各种生理过程，如卵泡发育、闭锁、类固醇生成和癌症。其中一些蛋白最终可能作为卵巢癌检测的诊断性生物标志物。然而，需要进一步的研究来证实这些发现。

致谢

我们感谢美国国立卫生研究院避孕科的Marvin Karten博士慷慨捐赠GnRH-Agonist ([DTrp6, Pro9-NEt] GnRH-Ag)。我们非常感谢David C. Pallas博士(埃默里大学医学院Winship癌症研究所生物化学系)慷慨捐赠的14-3-3抗体。我们还要感谢Jane Chu在莫尔豪斯医学院分析化学和蛋白质谱(ACPP)核心方面的技术支持。AK感谢巴纳拉斯印度大学动物学高级研究中心和B.H.U DST-Purse的财政支持。Anushree Dave感谢印度大学教育资助委员会提供研究奖学金。作者声明，不存在会影响科学工作公正性的利益冲突。

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