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摘要

许多基于临床前模型所证实的疗效的临床试验未能达到预期的结果。临床前模型主要包括细胞培养和动物模型。此外，在过去的几年里，三维(3D)-类似的构造，如球状体和类器官正在被使用。一个独特的体外近年来，通过器官培养来阐明新药的作用机制和疗效的研究得到了广泛的报道。然而，它的使用还不广泛。在以前的工作中，我们报道了溶瘤病毒在结直肠癌组织模型中的选择性。在本研究中，我们评估了该模型与传统细胞培养的相关性。为此，我们对各种结直肠癌细胞系的基因表达进行了生物信息学分析，并将其与32例患者的结直肠癌组织的基因表达进行了比较。结果显示，包括与结直肠癌进展直接相关的基因表达在不同细胞系之间存在显著差异。相比之下，在来自患者的组织中，基因表达更加一致。

这一分析的结果强调了仔细选择反映待研究人体组织转录的细胞系的必要性。此外，我们得出结论，生物信息学分析可能是确定最合适的实验模型的有用工具。使用直接来自患者的器官培养可能是一个更准确的模型，以评估给定的治疗效果。

关键字

体外，器官培养，细胞培养，癌症模型，生物信息学，病毒-宿主相互作用

简介

大多数探索病毒-宿主相互作用、筛选、设计和评估抗病毒药物[1]以及研究病毒对癌症的影响(溶瘤治疗)的研究都是在细胞培养或中进行的在活的有机体内在动物模型中[2-4]。这两种方法都不能反映人类的处境。细胞培养从上世纪50年代开始使用，缺乏包含细胞外基质(ECM)的三维结构，缺少器官中存在的各种细胞类型，缺乏先天免疫因子。此外，在细胞培养中，细胞通常比在固体组织中复制和进化快得多。这一特性被转化为正常和肿瘤细胞系[5]的异质性。另一方面，细胞系不保留肿瘤异质性，这可能导致对实验结果的误解，并解释了临床前模型药物验证成功与随后三期临床试验失败之间的差异[5,6]。当试图将这些模型用于实际应用时，必须考虑这些限制。有必要确定哪一种模型最适合用于评估给定的治疗方法。在包括各种细胞类型的实验模型中，包括球形3D培养[7,8]，这是一个允许培养细胞向多个方向生长和分化的系统。基质凝胶(Matrigel)是一种基于ecm的天然水凝胶，它是另一种用于2D和3D细胞培养的有用模型，能够更好地附着细胞，使细胞具有类似器官的结构。 Also, by this method, different cell types can be combined to study the relations between them (https://www.sciencemag.org/features/2017/04/adding-depth-cell-culture)．动物模型也有局限性[9,10]，通常是基于使用免疫缺陷动物。这些模型通常不足以得出关于人类[11]最终治疗阶段的结论。

最近，一种新的模型被提出，它包含完整组织的三维结构[12,13]。这些人类体外器官培养更忠实地保存在活的有机体内组织结构和可以更好地代表疾病相关的变化，可能更适合于分析病毒与正常和癌症组织的相互作用[14-18]。使用这种方法，我们之前已经证明了新城疫病毒(NDV)在新鲜人结肠癌中的选择性溶瘤作用，与相邻的正常组织[18]相比。

当前分析的主要重点是确定来自同一类型癌症组织的培养细胞表达的一致性基因水平是否与从患者体内取出的同一类型实体癌症组织中发现的相似，并与他们的相邻正常组织进行比较。

为此，由于生物信息学数据描述了不同处理[15]的转录组反应，在本研究中，我们使用了基于生物信息学的分析来寻找模拟[15]的最佳实验模型在活的有机体内人类的反应。

材料和方法

为了研究来自同一癌症类型的不同细胞系和组织的基因表达变异性，我们使用了结肠直肠癌的可用数据。对于细胞系，我们使用了Array Express (E-MTAV-37[19])提供的20个细胞系的基因表达:col201、col320hsr、HCT15、HCT8、LS1034、LS174T、NCIH508、NCIH716、NCIH747、RKOE6、SW1116、SW1417、SW403、SW48、SW480、SW620、SW837、SW948、T84、WIDR。

对于结直肠癌和邻近正常组织中的基因表达水平，我们使用了由NCBI-GEO数据集GSE8671[20]提供的32名人类患者的手术切除组织的数据。

使用Partek基因组套件软件7.18.0402进行统计分析。

采用基因表达路径进行RMA归一化，采用t检验、方差分析、火山图、PCA分析、维恩图计算和显示。直方图的创建使用Matlab程序版本7。在维恩图中，我们选择了两个视图。一是计算标准差(SD) <1的基因在两组(细胞系和组织)中的一致性基因表达;二是计算SD>1.2表示两组的非一致性基因表达。

为了证明一致性，我们从KEGG结直肠癌通路中选择了两个基因组(https://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa05210)和结肠直肠癌中另一种关键蛋白[20]。

结果

为了选择一个可靠的研究模型，我们首先对来自32名患者的两个数据集进行生物信息学分析，以观察癌变结肠组织与相邻正常结肠组织之间是否存在显著差异。

图1显示了癌组织和正常组织中基因表达水平的完全分离。主成分分析(PCA)图显示，基因表达水平在两种组织类型之间有显著差异。图2是癌组织和正常组织中基因表达水平的火山图，可以看出两种组织中基因表达水平的明显差异。

图1所示。主成分分析(PCA)图用于比较32例前瞻性收集的结直肠腺瘤的转录组与来自同一个体的正常黏膜的转录组。癌症(红色)和正常(蓝色)组织的基因表达之间有清晰的分割

图2。火山分析(x倍改变癌组织基因表达/正常组织基因表达，Y-p值)对32例前瞻性收集的结直肠腺瘤的转录组(c)与从相同个体获得的对应的正常黏膜的转录组(n)进行比较

对数据集中的特定基因进行了进一步分析。我们检测了结肠直肠癌的两个关键因子的表达，即TP53和CCND1 [20] (https://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa05210)．结果表明，结直肠癌组织与正常组织的基因表达水平一致。相比之下，在结直肠癌细胞系中，相同基因的表达差异很大(图3A和3B)。

图3．结肠直肠癌进展中三个关键基因的表达变异性:TP53 (a)、CCDN1 (b)和KIAA1199 (c)。注意结肠组织中表达的低变异性(左和中)，而在一些结直肠癌细胞系中表达的高变异性(右)。N -正常结肠组织，c-匹配癌结肠组织，命名为-细胞系

我们进一步评估的表达式KIAA199在细胞系和结直肠癌组织中，该基因先前被证明在结直肠癌组织[20]中上调。该基因被证明影响癌细胞[21]的增殖、粘附和侵袭性。结果显示，KIAA199在肿瘤组织中的表达是一致的，而在不同细胞系之间的表达是不同的(图3C)。

对从这两个数据集中获得的信息进行基因表达谱的标准差检验，以确定细胞系样本和患者癌组织样本中基因表达的一致性。据定义，高于1.2的标准偏差反映了某一特定基因缺乏一致性。结果(图4)显示，基因在细胞系中的表达更加分散，许多基因超过了既定的阈值。比较癌变细胞系与患者癌源组织的标准差，两组基因表达一致(图5A)和不一致(图5B)，基因重叠。在结直肠癌细胞系中，1005个基因不一致，标准差大于1.2，而在来自不同患者的结直肠癌癌变组织之间，只有101个基因表达不一致。两组基因表达不一致，仅有40个基因重叠。有趣的是，组织中不一致的基因表达与结肠癌的进展无关，而在细胞系中有几个不一致的基因表达与结直肠癌的进展有关。

图4．各种结直肠癌细胞系(a)和结直肠癌组织(b)基因表达标准差值分散分布的直方图

图5。细胞系与组织中水平高低的标准偏差维恩图。a-Venn的标准差低(<1)。b-标准偏差高水平(>1.2)的Venn。Stdev-standard偏差

在比较各组间基因表达的一致性时，不同癌细胞系之间的基因表达一致的有19019个，而来自所有患者的癌组织之间的基因表达一致的有20427个。

讨论

几十年来，有两种经典的方法被用于评估新药物和新疗法:细胞系和动物模型。细胞系主要生长在二维(2D)层中，具有许多局限性，这可能是临床试验失败率高的原因[22,23]。二维单分子层不能重现完整组织的构象、组织或固有结构在活的有机体内动物模型通常不能模拟人类疾病[10]。因此，其他模型，如3D球状体和类器官，正在被评估[6,8,10,24]。例如,Zanoni等艾尔。[8]使用3D球体增强抗癌药物评价的生物学相关性。

在之前的工作中，一种溶瘤性NDV在结直肠癌组织中进行了评估，发现对从患者获得的癌组织具有高度选择性，而在正常组织中，观察到很少或没有感染或细胞死亡的迹象[18]。在这项研究中，我们询问细胞系是否可以用于研究病毒-宿主的相互作用，或者是否有必要进行器官培养以获得可靠的结果。

为了建立一个更好的模型来筛选和评估药物，并更好地理解病毒-宿主相互作用，在本研究中，我们比较了从癌症结肠细胞系培养物与从患者获得的癌症结肠组织及其邻近正常组织的基因表达水平。对正常组织和癌变组织的基因表达进行计算分析，发现基因表达模式不同。此外，在另一项分析中，我们比较了肿瘤组织和培养的结直肠癌细胞，以检验两种模型之间可能的差异，并确定哪种模型更适合进一步使用。从结果来看，器官培养比传统细胞系更具预测性。在组织中，有几种屏障(如ECM)可能会限制病毒感染，而来自同一指征的单层培养物可能更容易感染，且结果不同[14-18]。因此，在研究中使用器官培养可以帮助在治疗手段和药物效率方面做出更好的决定。

在本研究中发现，与组织相比，细胞培养中存在高水平的基因表达变异。当我们检查这些变异时，我们发现，在32种不同的患者源性肿瘤中，只有101个基因表达差异，而在结直肠癌细胞系中有1000多个基因差异。缩小检查范围，我们发现即使是与结直肠癌转化和肿瘤进展相关的基因(CCND1、TP53和KIAA1199)在不同细胞系之间也有差异，但在癌症组织中更一致[20]，(https://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa05210)．因此，使用多种癌细胞系可能会显著改变结果，并导致对患者影响的错误预测。

使用适当的在体外培养可能为改进治疗和药物发现铺平道路[12,13,17]。使用类似的方法可能为了解溶瘤病毒与不同组织相互作用的差异提供基础，并有助于了解其作用机制[16,18]。同时,体外器官培养模型被发现对研究病毒-宿主相互作用和药物疗效评估具有很高的信息量，正如之前提到的寨卡病毒、疱疹病毒、流感病毒和冠状病毒[14,15,25,26]。的体外器官培养来自手术获得的新鲜组织，因此非常接近自然状态。

体外器官培养使我们能够识别与特定疗法相关的蛋白质。使用这种方法，可以对组织内的特定成分进行更具体和充分的治疗。正如我们在这项研究中所展示的，在细胞系中，有一种不连贯的基因表达，包括一些与结直肠癌进展直接相关的基因。3D新鲜组织培养可能对不同适应症类型的不同疗法预测更好的结果，使用来自特定患者的器官培养可能有助于更好地预测对特定患者[18]最有效的治疗方法。

总而言之，这份报告强调了……的重要性体外用于评估药物和病毒-宿主相互作用的器官培养这种模式可以填补之间的空白在体外，在活的有机体内以及临床试验，并加快走向个性化精准医疗的道路。

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