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收稿日期:2019年3月1日
接受日期:2019年3月15日
出版日期:2019年3月25日
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©2019 Yoon H.这是一篇开放获取的文章,根据创作共用署名许可条款发布,该条款允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制,前提是注明原作者和来源。
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Yoon H(2019)培养人多能干细胞的培养基、细胞外成分及分化。Integr Mol Med 6 DOI: 10.15761/IMM.1000360
干细胞研究中心,鸭鸥亭奇迹医院,韩国
干细胞研究中心,鸭鸥亭奇迹医院,韩国
DOI: 10.15761 / IMM.1000360
人多能干细胞(human pluripotent stem cells, hPSCs)的培养已成为再生医学和药物开发的重要因素。与其他哺乳动物细胞一样,人类多能干细胞在培养中对于微环境的形成也很重要,包括细胞间的相互作用、生长因子以及细胞与基质[1]的接触。干细胞的培养与标准的哺乳动物细胞培养相似,但分化或维持未分化状态可能是必要的。多能干细胞的表型特征(形态,集落评估,多能潜能)和分化细胞的表型特征(形态,分化标记,功能)应该被评估[1]。
hPSCs的培养需要使用哺乳动物细胞常用的培养方法,如培养方法的选择、培养基交换、传代、超低温保存、解冻冻存等。然而,尽管其与普通培养具有共性,并在再生医学中有积极的应用,但在培养方面仍有许多问题有待解决。(i)缺乏细胞培养的标准化规程,(ii)缺乏对生长困难、细胞凋亡和自发分化信号的有效分析,(iii)细胞生长过程中产生的杂质或异质性,(iv)与染色体异常相关的基因组不稳定性和(v)潜在致瘤性[2,3]。
在本内容中,我们将介绍hPSCs培养的特点、培养基、细胞外成分和培养中的分化
为了维持体外干细胞培养,有必要提供一个模仿体内条件进行代谢和生化过程的环境,同时保持细胞的表型和特性。细胞增殖与分化作用相反,细胞增殖趋于下降,以获得分化的细胞[1]。
第一代hPSCs培养基一般使用胎牛血清(FBS)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)[3]分泌成分。特别是胎牛血清是最常见的生长提供物质,在细胞培养基中提供生长成分。血清使用的优点包括重要营养素、生长因子、激素、附着因子胰蛋白酶抑制剂和保护剂,在低温保存中可作为冷冻保护剂。缺点是组件不是常数,因为特定的组件的内容是不同的每一单位的产品,产品的标准化是困难的,动物成分存在,很难预测细胞生长,因为它包含growth-inhibitory和刺激经济活动[4]。用于比较不同血清批次间细胞生长促进率的镀层效率试验是一种相对简单且应用广泛的方法。人血清只用于特殊目的,因为它具有潜在的人类病原病毒,如人类免疫缺陷病毒(HIV)或丙型肝炎病毒的风险。可以通过指定免疫球蛋白(细胞生长抑制作用)、内毒素(细菌污染指标、强有丝分裂原)、血红蛋白(一种有毒污染物,指示血清生产过程中溶血)等血清成分的最大允许水平来生产血清。
血清培养基的缺点导致了无血清培养基、无蛋白培养基和化学定义培养基的发展。
在干细胞培养中,可以在基础培养基中添加蛋白质、激素、生长因子和水解物。胰岛素、转铁蛋白和血清白蛋白等蛋白质可以从动物源中纯化,也可以在细菌、酵母或植物中重组产生,并添加到干细胞的生长和分化中。纯化的生长因子如激活素、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、上皮生长因子(EGF)等常加入到干细胞培养基[4]中。
必需营养素的消耗和酸性代谢物的增加导致细胞生长抑制。因此,有必要计划和实践更换(如介质的频率和数量)和及时传代(如分流比)。
如果使用了适当的设施、设备、无菌试剂和无菌技术,在细胞培养过程中就不需要使用抗生素。抗生素通常不用于检查特殊情况,如培养具有高污染可能性的原代细胞或支原体污染[4]。
细胞外成分包含多种来自动物细胞、水凝胶、单个基质蛋白、合成表面和无异种材料的有机基质。主要的商用产品包括CELLstart™(Invitrogen Inc.),它只在人类细胞中生产,stem坚持™(Primorigen Biosciences Inc.),它有一个完全定义的人类蛋白的基质,Synthemax®与独特的合成肽丙烯酸酯- r表面(Corning Inc.)。Matrigel-Matrigel是hPSCs免喂养培养中最广泛使用的细胞外成分之一。它是一种富含I、IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、entactin、硫酸肝素蛋白多糖、基质金属蛋白酶、未定义生长因子和化合物[5]的基膜基质。不适合培养用于临床的人乳头状细胞。许多细胞外基质蛋白可以用来决定人乳头状细胞的自我更新或谱系承诺。Vitronectin和特异性层粘连蛋白帮助维持hPSCs的自我更新[3]。
畸胎瘤试验:验证干细胞多能性的标准方法是畸胎瘤试验。然而,这种方法成本高,耗时长,重现性差,需要专业知识[4]。
胚状体的形成:胚状体是多能干细胞的三维聚集体。在不含抗分化因子的情况下,在培养瓶底部涂有不易粘附细胞的琼脂,在悬浮培养[6]中自发形成胚体。胚状体形成通常用于确认人类ESC和iPSCs的多能性,并评估特定基因和蛋白在三个胚胎层的表达[7,8]。提示外胚层分化的标记有SRY(性别决定区Y) -box 1 (Sox1)、paired box 6 (Pax6)、神经细胞粘附分子(NCAM)和神经外胚层干细胞标记(Nestin)。内胚层分化标志物包括α-胎蛋白、细胞角蛋白、生长抑素、骨形态发生蛋白4 (BMP4)、GATA结合蛋白4 (GATA4)、肝细胞核因子-4,中胚层分化标志物包括brachyury、α-心脏肌动蛋白和心房利钠因子[4]。
方案:HPSCs可通过不同的分化培养基、基质通过分化方案分化成特定的细胞系。体外氧浓度的控制、培养结构(单层/2D vs悬浮/3D)、通路调节剂和细胞的转录记忆也可能影响分化[9-11]。
传代和培养方法:未分化PSCs的传代和培养方法可能影响其分化效率[8]。
来源细胞的转录记忆:诱导多能干细胞在低传代时可能保留起源细胞的转录记忆,这可能影响它们分化为特定谱系的倾向[12]。
为了创建一个可重复的分化方案,必须去除不可控制的变量,如血清和共培养,并应优先使用确定的培养基和基质成分。
简短的沟通
收稿日期:2019年3月1日
接受日期:2019年3月15日
出版日期:2019年3月25日
©2019 Yoon H.这是一篇开放获取的文章,根据创作共用署名许可条款发布,该条款允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制,前提是注明原作者和来源。
Yoon H(2019)培养人多能干细胞的培养基、细胞外成分及分化。Integr Mol Med 6 DOI: 10.15761/IMM.1000360
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