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摘要

肺动脉高压（PAH）以血管细胞生长和增殖为特征，导致肺血管阻力增加、肺动脉压升高、右心室衰竭和死亡。本研究的主要目的是探讨EC-SOD过度表达对慢性PAH动物模型的预防和治疗作用。通过将成年雄性C57BL6小鼠暴露于缺氧（FiO）中诱导慢性PAH_2.10%) 3周和Sugen[E Miller1]给药，每周一次(3次)。在暴露后3、7、11和14周进行血流动力学、组织学、免疫组化、NO通路、血管生成标志物和炎症标志物研究。与野生型小鼠相比，在相同条件下，过表达EC-SOD的转基因小鼠表现出较少的PAH，与轻度炎症相关，在暴露后11-14周，炎症缓解。慢性进行性PAH建立后过表达EC-SOD显示显著的治疗益处。与未转染的野生型缺氧动物相比，转染缺氧野生型动物肺实质水平的慢性变化的缓解与肺压显著降低相关。这些数据表明，EC-SOD在改善和逆转慢性进行性PAH方面具有显著和显著的作用。密苏里州鼠[E Miller2]德尔。[E Miller3]

关键字

肺动脉高压、慢性缺氧、降糖、EC-SOD、预防、治疗

背景

肺动脉高压(PAH)，发生在肺血管阻力(PVR)保持异常升高时。这进而导致严重的低氧血症，可能对传统的呼吸支持没有反应，并可能导致右心衰和死亡。PAH包括一组多因素肺血管疾病[2]。导致复杂发病机制的主要因素包括持续的血管收缩和进行性的固定血管重塑[3]。尽管对PAH发病机制的理解取得了巨大进展，但其起源的复杂性以及所涉及的通路相互作用仍需要进一步阐明。特别是肺平滑细胞与内皮细胞之间的平衡、血流动力学变化的复杂性、肺动脉高压的预防和逆转仍未得到解释。

缺氧是PAH病理生理的主要因素之一，在缺氧中起关键作用[5]，导致肺血管收缩，内皮细胞、平滑肌细胞和外膜成纤维细胞增殖，导致血管狭窄[5-8]。

大多数动物暴露于低水平的环境氧会导致肺泡缺氧，并可靠地导致慢性肺动脉高压和毛细血管前肺血管的形态改变[9-11]。经常被研究的肺动脉高压(由慢性缺氧引起)小动物模型的主要局限性是，它们并不总是发生与人类高死亡率和发病率相关的慢性和不可逆的变化[12,13]。因此，单独的缺氧(急性或慢性)不足以引起严重的肺动脉高压和/或慢性变化。正如十年前所描述的，两个hits模型继续被研究，并提供了肺血管病变的本质和心脏适应肺循环改变的机制的见解。在这些动物模型中，VEGF的结合[E Miller4]受体阻滞剂[E Miller5]慢性缺氧已被证明可诱发肺动脉高压和严重肺动脉病变，包括同心新内膜和复杂丛状病变;(13 - 15)。

在之前对缺氧诱导的PAH动物的研究中，EC-SOD过表达已被证明可以减弱、预防和逆转PAH[16-19]。然而，这些研究并没有在慢性进行性PAH与晚期血管病变相关的动物中检测EC-SOD。在我们之前的研究中，我们发现EC-SOD具有独特的地位来阻止PAH的发展，因为它能够催化超氧自由基的分解[20,21]，增加NO生物利用度[22]，减少与氧化应激相关的炎症反应[20,22]，并增加VGEF表达[23]。在目前的研究中，我们的总体目标是评估EC-SOD过表达在防止肺动脉高压发展到慢性和不可逆阶段中的作用。

方法和材料

所有的动物实验都是由范斯坦医学研究所的动物护理和使用委员会批准的。

动物模型

我们通过将雄性C57BL/6小鼠(9-11周龄)暴露于10%的低氧环境中，并在第0、7和14天腹腔注射血管内皮受体(VEGF)阻断剂SU5416 (Sugen)(每剂量20 mg/kg体重)，建立了慢性进行性PAH。硫根悬浮在0.5%羧甲基纤维素钠、0.9%氯化钠、0.4%聚山梨醇80和0.9%苄醇的去离子水混合物中。

研究设计

预防研究:野生型C57B6小鼠（WT）和转基因小鼠（TG）表达额外的人类EC-SOD副本，研究如下：

第一组(n=5): WT放置在室内空气中

第2组(n= 5): TG置于室内空气中

第3组（n=20）：WT置于缺氧+苏根中。

第4组(n= 20):甘油三酯在缺氧室+苏根。[E Miller6]

暴露3周后，所有动物都被安置在室内空气中。每组5只动物在每个研究时间点(暴露后3、7、11和14周)安乐死并进行研究。

治疗性研究:如上所述，慢性肺动脉高压在3周以上发生。暴露期后，半数动物转染hEC-SOD/活体jetpei[E Miller7]如前所述，全身麻醉下气管内灌注复合物50µL/剂量[24,25]。其余的动物未被转染。未转染和转染的动物随后被安置在室内空气中，5只动物/组被研究并在接触后7周和11周安乐死。

血流动力学研究

RT心室压评估老鼠(N = 5 /组):在缺氧暴露后3、7、11、14周进行评估，与[18]前描述的相同。简单地，用氯胺酮20 mg/kg/剂量麻醉动物，一根连接传感器的26号针经膈进入右心室。采用计算机血流动力学记录系统(HAEMODYN, Harvard Apparatus, MA, USA)测量并记录右心室收缩压(RVSP)。然后这些老鼠被放血安乐死。

RV/S+LV比值老鼠(N = 5 /组):取心脏，解剖，称重，计算不同心脏指标。心脏重量都被表示为一个的重量比右心室的隔膜+左心室(RV / S + LV),或右心室质量(右心室/体重- RV / W),是表示右心室的重量比动物的体重[20]。

微血管密度和血管壁厚度定量(N=5只/组):左肺灌注4%多聚甲醛(PFA)，恒压25cm H充气_2.O通过气管插管，在4°C下用4% PFA固定过夜，然后嵌入OCT，[E Miller8]随后，取5 μm厚的切片，并用苏木精和伊红(H&E)染色。微血管密度通过计算每个样本至少21张图像(5只动物，每个动物3个样本，前面描述的每个样本7个切片)中每张图像正像素的面积百分比来量化。

血管壁厚:用蔡司Axiovert 200M光学显微镜- CCD相机AxioCam (mRm)彩色相机测量，以占总血管尺寸的百分比表示。壁厚百分比计算为(2 ×壁厚)/外径× 100%(8,10)。每只动物测定50个肺泡血管(外径100-200 μm)的外径和内径，并由不了解治疗方案的独立研究人员记录。采用Zeiss轴向程序测量3个随机壁切片的血管壁面积与总面积之比(WA%)和肺小动脉壁厚度与血管外径之比(WT%)。

组织学研究(N=5只/组)

各组均进行肺形态测定。肺组织被石蜡包埋。连续切片用H&E染色。染色切片使用尼康Eclipse E400显微镜分析，使用尼康DS-Fi1相机和500万像素CCD获得图像。

免疫组化研究(N=5只/组)

免疫组化染色采用Vectastain Universal Quick试剂盒(Vector Laboratories, Burlingame, CA)(13)，使用抗体检测von Willebrand因子(Dako, Glostrup, Denmark)、平滑肌肌动蛋白(Abcam, Cambridge, Mass)和VEGF (Santa Cruz Biotechnology, CA)。

一氧化氮合酶途径、血管生成标志物和炎症反应的评估(N=5只小鼠/组)

肺组织灌流并用含有肝素（2单位/ml）的磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）冲洗，以去除任何红细胞和凝块，然后在48℃下均质^oC.使用1:1000的EC-SOD抗体，通过Western blot分析在肺匀浆中未进行通路分析（Santa Cruz，Biotechnology，CA）；ii）1:1000的小鼠单克隆内皮型一氧化氮合酶（eNOS）（BD转导，加利福尼亚州圣何塞）；iii）1:1000的兔多克隆磷酸一氧化氮合酶（pNOS）（马萨诸塞州剑桥Abcam）；iv）兔多克隆sGC[E Miller9]1:10 00(开曼化学，安阿伯，密歇根)。血管生成标记物sFlt-1 (sVEGFR-1)的检测使用Quantikine小鼠可溶性VEGFR1/Flt-1免疫分析试剂盒(R&D Systems, Minneapolis, MN)， cGMP检测使用Cayman Chemical酶免疫分析试剂盒。

Western blot实验(N=5只/组)

对照组织和实验组织在含有50 mM Tris·Cl（pH 7.5）、150 mM NaCl、1 mM EDTA的RIPA缓冲液中溶解[E Miller10]，1%Nonidet P-40，0.25%脱氧胆酸盐，0.1%十二烷基硫酸钠，1种蛋白酶抑制剂鸡尾酒（鸡尾酒组I，加州圣地亚哥Calbiochem），1毫米PMSF[E Miller11]、0.2 mM原钒酸钠。采用Bio-Rad蛋白测定法(Pierce, Rockford, IL)测定蛋白浓度。总蛋白裂解物(20 g/lane)[E Miller12]载于10%聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad, Hercules, CA)上，并使用Bio-Rad微型印迹仪转移到硝化纤维素膜上。硝化纤维素膜用一抗进行免疫染色，然后用适当的辣根过氧化物酶标记的二抗。印迹是用化学发光检测试剂盒(Pierce, Rockford, IL)开发的，并暴露于x射线胶片(Eastman Kodak, Rochester, NY)。在相同的Western blots上对B-actin蛋白(Santa Cruz Biotechnology, CA)进行免疫印迹分析，证实了相同的蛋白负载和蛋白转移。

统计数据

图中的值以至少三次取样的平均值±标准差报告。单因素方差分析与“Bonferroni’s多重比较检验”，后测使用GraphPad Prism version 5 for Windows， (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)， P值<0.05为显著性。

结果

预防研究

我们的数据显示，与WT小鼠相比，TG小鼠在第3、7、11和14周时的RVSP、RV/S+LV比率和RV/W比率显著降低（P<0.05），后者表现为慢性进行性肺动脉高压，如RVSP、RV/S+LV比率和RV/W比率显著升高所示（图1）。

图1所示。小鼠吸入10%吸气氧3周，注射血管内皮生长因子受体阻断剂Sugen (SU) 5416, 1次，1周，3次后肺动脉高压模型和心肌肥厚的评价。在暴露后3、7、11和14周，在RA对照组、TG低氧组和WT低氧组中进行动物研究。(A)右心室收缩压(RVSP)， (B)右/左心室+间隔比，(C)右心室/体重，(D)血管壁厚度百分比(PWVT)。图1B:小鼠吸入10%吸气氧3周，注射血管内皮生长因子受体阻断剂Sugen (SU) 5416, 1周1次，3次后肺动脉高压模型和心肌肥厚的评估。缺氧后，部分转染动物，其余部分不转染。动物研究是在接触后的3,7,11,14周进行的。(A)右心室收缩压(RVSP)， (B)右/左心室+间隔比，(C)右心室/体重。N /组= 5的动物。* P < 0.05

在肺实质水平（图2），TG小鼠在第3周和第7周表现出轻微的炎症变化（间质细胞数量增加），在第11周和第14周的改善程度与对照小鼠相当。野生型动物表现为进行性间质和周淋巴细胞浸润和异常肺泡化。在肺动脉水平（图3），TG小鼠在3周后显示正常的壁厚、内皮和外膜（与对照小鼠相当），并在暴露后11周保持其正常形态。然而，野生型小鼠在11周和14周结束时，随着时间的推移，显示出显著的渐进性肌壁厚度，而没有退化。血管生成标记物（包括α-平滑肌细胞、VEGF、VWF和可溶性家族成员如酪氨酸激酶1型（sFlt-1））（图4-7）和炎症标记物（图8）（IL 1、IL 6和TNF-α）在WT缺氧小鼠中增加，并且与TG小鼠和对照组相比在14周内保持增加（P<0.05）。通过评估环磷酸鸟苷（cGMP）和可溶性鸟苷酸环化酶（sGC），研究EC-SOD的过度表达和NO的生物利用度增加，与室内空气中的动物相比，WT缺氧动物在3周和14周时的EC-SOD和NO生物利用度降低（<0.05）（图9）。在低氧TG动物中，EC-SOD的过度表达对NO途径具有显著的保护作用。与RA对照组相比，所有低氧TG动物的cGMP和sGC水平相似。但显著高于缺氧动物（P<0.05）。

图2。所有四个研究组的肺实质组织病理学研究：RA对照组、低氧WT组、低氧转基因组和低氧转染组

图3。所有四个研究组的肺动脉组织病理学研究：RA对照组、低氧WT组、低氧转基因组和低氧转染组

图4。RA、低氧WT和低氧TG组肺动脉平滑肌的组织化学研究。A: α平滑肌抗体(α-SMA)免疫染色。B:表格显示了α-SMA像素百分比的量化。N /组= 5的动物。* P < 0.05

图5。RA、低氧WT和低氧TG组肺动脉平滑肌的组织化学研究。A：血管内皮生长因子（VEGF）免疫染色。B：表中显示了VGEF像素百分比的量化。N/组=5只动物。*P<0.05

图6。RA、低氧WT和低氧TG组肺动脉平滑肌的组织化学研究。A：血管性血友病因子（vWF）免疫染色。B：表显示了vWF像素百分比的量化。N/组=5只动物*P<0.05

图7。血管生成标志物ELISA检测;可溶性家族成员，如酪氨酸激酶1型(sFlt-1);在RA中，低氧WT组和低氧TG组在暴露后3周和14周。N /组= 5的动物。* P < 0.05

图8。暴露后3周和14周，在RA、低氧WT和低氧TG组中，对炎症标记物（IL-1、IL-6和TNF-a）进行ELISA测定N/组=5只动物*P<0.05

图9。Western blot检测暴露后3周和14周，RA组、低氧WT组和低氧TG组NO通路。A: PeNOS/eNOS比值测定。B:可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)测定。N /组= 5的动物。* P < 0.05

治疗效果研究

与野生型缺氧动物相比，用EC-SOD质粒转染动物具有显著的治疗作用，可防止慢性肺改变进展，改善肺动脉高压状态(P<0.05)。转染小鼠(WT-T)右心室收缩压降低，右心室质量RV / W比和右心室/体重比(心脏质量指数)(RV / W)与WT老鼠在7周相比显著减少这些参数在11和14周接触后,RA对照组相比(图1)。在肺实质的水平,转染小鼠显示炎症变化的衰减与持续改进7周11和14周没有慢性肺的发展变化,这是明显的和重要的摘要WT老鼠(图2)。在肺动脉的水平,post-transfected, WT缺氧小鼠治疗组,暴露后7、11、14周肺动脉形态与对照组比较均正常。WT缺氧未处理组显示壁厚、肌肉化和内皮细胞增殖的进行性增加(图3)。

讨论

在本研究中，我们报道了一种可以预防和治疗慢性缺氧和SU5416引起的病理改变的干预方法[E Miller13]在成年小鼠PAH模型中。转基因小鼠(过表达EC-SOD)和转染小鼠(经气管内灌注hEC-SOD/活体- jetpei复合物)[E Miller14])，受到保护并经历肺动脉压力正常化和肺血管和肺实质慢性肺改变的减轻。

多环芳烃与高[E Miller15]从新生儿到老年人口各年龄组的发病率和死亡率。虽然，EC-SOD预防缺氧诱导PAH的作用已经被证实(16-20)，但这是首个在更严重的Su5416/慢性缺氧小鼠模型中显示EC-SOD预防和逆转PAH进展和慢性肺改变能力的研究。

安倍等（2010）表明Su5416/慢性缺氧是肺动脉高压的一个特别强大的模型[14]。丛状病变是严重肺动脉高压肺动脉病变的特征性结构，除血管病变的其他阶段（1-3）外，在SuHx模型的14周（常氧11周）也发现了丛状病变[14]。Vitali，等．(2014)报道，每周SU5416联合3周的缺氧，随后在正常缺氧10周，产生了肺动脉高压的增强和结构反应，导致小鼠比单独缺氧更深刻的PAH表型。但在随访10周时SuHx小鼠肺[27]中发现极少的血管闭塞性病变。最近，在SuHx小鼠[28]模型中发现糖酵解增强与肺血管和组织基质有关。在我们的SU5416联合缺氧3周的小鼠模型中，与单独缺氧相比，PAH表型的进行性和深刻形式与人类严重PAH[13]中观察到的相似。在我们的模型中，有明显的动脉病变，包括同心层状内膜增生和不可逆的改变，但在11周和14周随访时间点未见复杂的丛状病变模式，这与其他研究[27]一致。大多数研究都认为，SuHx小鼠模型可能是阐明PAH[29]相关多因素致病机制的重要工具。

与放置在室内空气中的WT处理组和对照组相比，经Su5416处理并暴露于缺氧的TG动物显示出正常的肺泡和实质结构（图2和图3）。α-SMA（图4）、VEGF（图5）和血管性血友病因子（vWF）（图6）的免疫染色显示内侧壁增生最小，没有进展为慢性变化（图2和图3）。有趣的是，在最初暴露于Sug5416/缺氧x3周（建立疾病）并随后转染EC-SOD（转染组）的WT小鼠中，显示其已建立的实质病理变化逆转的显著证据，在11周和14周的时间点，炎症明显改善并消退（图2）。在肺动脉水平，暴露后（3周）出现明显的肌壁厚度、肌层化和内皮细胞增生，并在11、14周的随访时间点开始明显消退（图3）。

与炎症和血管病变的结果平行，肺动脉压测量、右心室肥厚和血管壁厚度在研究组之间显示出相似的趋势。TG缺氧小鼠显示这些参数的正常限制,接触后与缺氧和对照组相比(图1)。虽然WT缺氧组,有显著提高RVP和右心室肥大的接触后,转染EC-SOD,开始逐步减少RVP展示和右心肥大,与未转染组相比，转染EC-SOD的暴露后11和14周时间点显示RVP逐渐增加(图1)。这些数据支持EC-SOD预防和治疗的作用，防止启动，以及引发血管重塑等病理变化的进展。

在我们的模型中，我们主要显示了炎症标志物的显著升高;IL-B1、IL-6和TNF-α;根据之前描述的人类特发性和家族性严重肺动脉高压的发现，并与最坏的结局[30]相关。在缺氧诱导肺动脉高压的实验证据中，野百合碱动物模型、糖缺氧大鼠模型中IL-1B的增加有多种证据，但在缺氧小鼠模型中未见报道[30,31]。

我们已经证明，野生型小鼠中的sFlt-1表达在缺氧+sugen模型下上调，在缺氧转基因小鼠和对照组中正常化，这与Xiong所证明的一致，等[32]。在野百合碱和缺氧动物模型中，VEGF-A过表达已被证明可以预防肺动脉高压[33,34]。sflt -1介导的VEGF-A抑制曾被认为有助于PAH的病理[35]。我们的研究结果与其他表明sFlt-1或正常水平下调的研究不一致[37-39]。以往研究结论与目前研究结论的差异，可能与不同类型微血管、急性与慢性不同应激源、不同缺氧模式[40]有关。

尽管肺总EC-SOD含量没有变化，但选择性清除smc来源的肺血管EC-SOD使慢性缺氧PAH[34]恶化。血流动力学测量和肺血管重构分析显示肺动脉高压增强。在该模型中，低血管EC-SOD环境下PAH的增强是由于cgmp依赖信号的受损，这表明eNOS活性受损可以解释在肺血管EC-SOD[41]不足的小鼠中PAH的夸大。我们的研究表明，有必要考虑氧化剂产生和抗氧化活性的区域化，以及细胞外氧化剂/抗氧化失衡对特定氧化还原敏感信号通路[42]的重要性。在我们的模型研究中，一氧化氮合酶途径显示WT缺氧小鼠的p-eNOS显著降低，缺氧转基因小鼠的p-eNOS升高，在暴露7周后与对照组小鼠相当(图9)。

我们认识到这项研究的一些局限性。慢性缺氧诱导的PH小鼠模型虽然具有可重复性和良好的特征，但不反映在人类疾病中观察到的肺血管重构或炎症的严重程度。虽然我们证实了内、外壁重塑的恶化，但该模型无法评估血管EC-SOD不足对内膜改变的影响，尽管这是临床中肺动脉重塑的一个重要特征。另一个局限性是，由于我们使用肺组织来评估sGC-cGMP-PDE5轴，我们可能没有检测到更细微的肺动脉表达或活动变化。肺的变化可能不能完全反映肺动脉的变化，正如大型动物模型或人类患者所显示的那样[10,11]。未来，我们计划测试更多与血管壁三层重构和炎症相关的肺动脉高压模型。

总之，我们能够在成年小鼠中建立慢性PAH。EC-SOD在改善和减轻缺氧引起的肺血管病变以及随后的慢性肺动脉高压进展中具有显著和重要的作用。在慢性肺动脉高压模型中，EC-SOD的过度表达导致与血管重塑相关的炎症过程消退。[E Miller16]

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