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摘要

目的:探讨IGU (IGU)治疗类风湿性关节炎(RA)的新机制，利用软骨肉瘤细胞分析IGU引起的蛋白谱变化。方法:在100 μM IGU存在或不存在的情况下培养OUMS-27细胞。采用二维差分图像凝胶电泳(2D-DIGE)对蛋白进行提取和分离。用质谱法鉴定感兴趣的蛋白点。结果:IGU处理24 h和6 d的2D-DIGE结果分别检测到776和803个蛋白点。igu处理6 d后，22个蛋白点的强度为未处理的1.3倍或更高，15个蛋白点的强度为-1.3(1/1.3)倍或更低(p<0.05)。我们鉴定了37个位点中的15个，包括pre-mRNA的包装和剪接、信号通路/蛋白质折叠调控、先天免疫和炎症、转录、ATP合成、细胞保护和细胞骨架组织。有趣的是，IGU处理降低了RA滑膜和/或其动物模型中高表达的异质性核核糖核蛋白(hnRNP) A2/B1和A1的多位点强度。具体来说，hnRNP A2/B1被认为是RA的自身抗原，也是IGU的靶点NF-kB的促炎激活因子。结论:IGU影响软骨肉瘤细胞的蛋白谱。 The decreased expression of hnRNPs suggests novel mechanisms for anti-rheumatic effects of IGU.

关键字

软骨肉瘤细胞，iguratimod，质谱，蛋白质组学，类风湿关节炎

介绍

类风湿性关节炎(RA)是一种全身性炎症性疾病，可导致进行性关节破坏和功能丧失。尽管其病因尚不清楚，但早期诊断和靶向治疗方法被推荐为达到缓解[2]的标准治疗方法。生物制剂和小分子免疫抑制疾病修饰抗风湿药物(DMARDs)的发展，如甲氨蝶呤和janus激酶抑制剂，使这一策略成为可能[1,2]。然而，在相当一部分伴有恶性肿瘤和慢性感染等合并症的RA患者中，免疫抑制药物难以应用。此外，对于达到缓解的RA患者，应考虑应用免疫调节药物治疗。

从这些观点来看，传统的疾病修饰性抗风湿药物(cDMARDs)在RA治疗中的作用是重要的。免疫调节cDMARDs包括salazo磺胺吡啶和bucillamine，它们被RA治疗指南推荐作为甲氨蝶呤不耐受患者的替代品[3,4]。免疫调节cDMARDs可用于恶性肿瘤和感染患者。Iguratimod (IGU)是日本开发的一种新型免疫调节cDMARD，可抑制免疫球蛋白和促炎细胞因子的产生，如TNFa、IL-1b和IL-6[5-8]。IGU被认为通过抑制NF-kB，通过抑制RelA/p65的磷酸化和核转位而不干扰IkB来显示其抗风湿作用[6,7,9]。IGU还能抑制rankl诱导的破骨细胞分化中的ERK和NF-kB通路[9-11]。最近，在小鼠关节炎模型中，IGU被发现可以阻断IL-17信号通路，其靶点是IL-17受体适配器蛋白Act-1[12]。然而，IGU的作用机制，特别是对软骨细胞的作用机制仍不清楚。

在本研究中，我们综合分析了IGU引起软骨肉瘤细胞蛋白表达的变化。我们发现IGU影响软骨肉瘤细胞的蛋白谱。有趣的是，IGU抑制hnRNP A2/B1和A1的表达。具体来说，hnRNP A2/B1在RA中扮演自身抗原和促炎调节因子的角色，同时也是IGU靶点NF-kB的辅激活因子。我们的发现提示IGU治疗RA的新机制。

方法

细胞培养

软骨肉瘤细胞系，OUMS-27 (C-2012-1583, Human Science Research Resources Bank, Sennan, Osaka, Japan)[13]，在DMEM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)和10% FBS (Hyclone, South Logan, Utah, USA)中培养，I型胶原涂层培养盘(AGC techno glass, Haibara-gun, Shizuoka, Japan)。分析IGU (Tokyo chemical industry, Chuo-ku, Tokyo, Japan)对细胞活力和生长的影响，1.5x10⁵在10-300μM IGU存在或不存在的情况下，将1/2的OUMS-27细胞接种并培养24小时。同样，为了分析长期（6天）效应，1.5x10⁵每48小时加入3次100 μM IGU。细胞是在上次治疗48小时后收获的。所有实验均为三次重复。

二维 -差异图像凝胶电泳（2D-DIGE）

如前所述，从OUMS-27细胞中提取的蛋白质通过2D-DIGE进行分析[14]。简单地说，从24小时培养的细胞样本（100μM IGU处理过的三个和未处理过的三个）的六个裂解物中提取等重量的蛋白质，混合并用菁染料3（Cy3，Cy染料DIGE饱和染料，GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA）标记，以制备内部对照“标准样品”。六个样本中的每一个都用菁染料5（Cy5，GE Healthcare）标记。将2.5 mg单独的Cy5标记样品与2.5 mg Cy3标记的标准样品混合。然后将每个混合蛋白样品应用于等电聚焦（IEF）凝胶条（pH值为3-11、24 cm、非线性、GE Healthcare的Immobiline干条）。蛋白质经等电聚焦电泳分离后，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步分离。使用图像分析仪（GE Healthcare的Typhone 9400 Imager）扫描产生的蛋白质斑点。通过使用定量分析程序（Progenesis，非线性动力学，英国纽卡斯尔），将每个蛋白质斑点的Cy5荧光强度标准化为相同斑点的Cy3荧光强度。使用Progenesis比较IGU处理和未处理蛋白质样品之间的标准化Cy5强度。同样，在经IGU处理和未经处理的OUMS-27细胞之间，比较6天培养细胞的蛋白质谱。

蛋白质的鉴定

蛋白通过质谱(MS)[14]鉴定。简而言之，用二维电泳分离了50 mg蛋白质。提取与感兴趣的蛋白质点对应的凝胶标本。然后用胰蛋白酶消化凝胶碎片中的蛋白质。用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS) (Ultraflex, Bruker Daltonics, Ettlingen, Germany)分析消化产生的肽。在质谱的基础上，选择一些多肽进行MS/MS分析。利用获得的质谱和质谱/质谱(MS/MS)对Swiss Prot human protein sequence数据库进行数据库检索(Mascot, http://www.matrixscience.com)。当MASCOT搜索结果提供显著的MOWSE评分时，接受蛋白质鉴定(p<0.05)。

蛋白质相互作用分析

通过ingenious Pathway Analysis (IPA) (Qiagen, Venlo, NLD)搜索鉴定的蛋白之间的相互作用。核心分析采用IPA数据库中所有物种所有细胞的所有鉴定蛋白的名称和差异倍数(IGU/Control)进行。

统计分析

通过Student的t检验计算2D-DIGE中细胞活力、细胞生长、蛋白点强度差异的显著性。

结果

IGU作用24小时对OUMS-27细胞的影响

我们首先用0-300 mM IGU处理OUMS-27细胞24小时，观察其对细胞活力和生长的影响。OUMS-27细胞在10 ~ 300 μM IGU存在和不存在IGU时的存活率均超过94%。除300 μM iguratimod(0.84倍)的生长水平略低(p<0.05)外，其余各条件下的细胞生长水平基本相同(0.95 ~ 1.05倍)。因此，我们测定了IGU浓度为100 μM，并在此条件下分析了OUMS-27细胞的蛋白谱。

我们比较了100 μM igu处理和未处理OUMS-27细胞的蛋白谱。我们共发现776个蛋白点(图1A, B)。在这776个蛋白点中，有41个蛋白点在两种条件下强度不同(p<0.05)(表1)。在这41个蛋白点中，有11个蛋白点在igu处理的细胞中强度是未处理细胞的1.3倍或更高。相比之下，igu处理的细胞中有5个点的强度为-1.3(1/1.3)倍或较低。结果表明，IGU影响OUMS-27细胞的蛋白谱。

IGU处理6天对OUMS-27细胞的影响

接下来，我们用100μM IGU处理OUMS-27细胞6天。细胞活力和生长水平足够高，在第6天时，IGU处理的细胞和未处理的细胞的活力和生长水平相似（100μM；细胞活力，100.1%，p=0.92；细胞生长，1.05倍，p=0.64）。因此，我们使用这些细胞裂解物进行2D-DIGE。

在2D-DIGE结果中共检测到803个蛋白点(图1C, D)。在803个蛋白点中，有150个蛋白点在igu处理和未处理的细胞中呈现不同强度(p<0.05，表1)。在150个蛋白点中，igu处理的细胞中有22个蛋白点的强度是未处理细胞的1.3倍或更高。相反，igu处理后的细胞中有15个斑点的强度是未处理的细胞的-1.3倍或更低。在6天治疗中，蛋白斑点(150个)变化为±1.3倍或更多，与24小时治疗(41个)相比，蛋白斑点的数量为3.7倍(表1)。

图1所示。IGU处理OUMS-27细胞的蛋白谱。图中显示了在100 μM IGU存在(左上)或不存在(右上)的情况下培养24小时OUMS-27细胞蛋白的代表性2D-DIGE结果。同样，在有100 μM IGU(左下)或没有100 μM IGU(右下)的情况下培养6天。

表1。IGU处理后OUMS-27蛋白谱的变化

为了跟踪蛋白表达的时间进程，我们观察了蛋白点的强度变化，IGU处理24小时后，蛋白点的强度变化为±1.3倍或更多。在9个强度增加的斑点中，几乎所有斑点的强度在6天处理中都降低了(图2A)。同样，在4个强度降低的斑点中，3个斑点的强度在6天处理中增加了(图2B)。24小时处理对OUMS-27细胞的影响是初步的。相反,当我们观察到蛋白质斑点强度显示±1.3倍或更多的变化6日处理,几乎所有的景点的22个intensity-increased斑点和15 intensity-decreased斑点同样24 hour-treatment增加和减少,分别(图2 c,D). 6天的治疗被认为反映了IGU对OUMS-27细胞的长期影响。

图2。在IGU存在下，OUMS-27细胞的每种蛋白质表达的时间过程。A、 B.在24小时治疗中，分别检测到11个蛋白质点中的9个和5个蛋白质点中的4个，其强度在24小时治疗中增加到1.3倍或更多（A），在24小时治疗中减少到-1.3倍或更少（B）（表1），并应用于时程分析。C、 D.在24小时和6天的治疗中，分别检测到22个蛋白质点中的14个和15个蛋白质点中的11个，其强度在6天的治疗中增加到1.3倍或更多（C），并降低到-1.3倍或更少（D）（表1），并应用于时程分析。对照样品（Cont）是来自未添加IGU培养24小时（A，B）和6天（C，D）的OUMS-27细胞的蛋白质。

IGU改变表达的蛋白的鉴定

我们试图识别IGU处理6天后斑点强度改变的蛋白。鉴定37个蛋白点，其强度变化为±1.3倍或以上。结果，从37个点中的15个点中鉴定出14个蛋白(图3、4、表2)。

图3。在2D-DIGE凝胶上确定的蛋白质点的位置。经6天IGU处理后，37个点中有15个点的蛋白强度变化超过±1.3倍。给出了标准样品的一个具有代表性的结果。

图4。比较igu处理和未处理条件下鉴定蛋白的斑点强度。图中显示了鉴定的15个蛋白点的代表性结果以及这些蛋白点在igu处理和未处理(对照)细胞之间的强度差异。误差棒，标准差，^＊p < 0.05。

表2。IGU处理后蛋白斑点的强度发生变化

选择37个蛋白点进行蛋白鉴定，这些蛋白点的强度在IGU处理6天时增加到±1.3倍以上。37个斑点中有15个被鉴定出了蛋白质。MW,分子量。

*蛋氨酸的氧化。

在IGU处理后增加的7个点中鉴定出7个蛋白。它们是1)参与前mrna剪接的蛋白(cyclin L1 [CCLN1];2)调控信号通路和蛋白质折叠的蛋白(14-3-3 protein epsilon，酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白epsilon [YWHAE];3)参与先天免疫和炎症的蛋白(含NACHT、LRR和PYD结构域的蛋白3 [NLRP3])， 4)转录因子(人类免疫缺陷病毒1型增强结合蛋白2 [HIVEP2])，5)功能未知的蛋白(跨膜蛋白95 [TMM95])。

其余7个蛋白包含在IGU处理后强度降低的8个点中。它们是1)参与pre-mRNA包装的蛋白(heterogenous nuclear ribonucoproteins A2/B1 [hnRNP A2/B1];异源核核糖核蛋白A1;2)缺氧细胞保护蛋白(缺氧上调蛋白1 [HYOU1])， 3) ATP合酶(ATP合酶亚基α，线粒体[ATP5A1])， 4)细胞骨架蛋白(角蛋白，II型细胞骨架1 [KRT1];角蛋白，II型细胞骨架6B [K2C6B])。

有趣的是，hnRNP A2/B1在3个蛋白点(位点ID 784、794和797)中被鉴定(表2)。同样，hnRNP A1在2个蛋白点(位点ID 773和775)中被鉴定。在斑点ID 773中，只有hnRNP A1或hnRNP A1和hnRNP A1L2被认为是包括在内的。现货ID 376包括KRT1和/或K2C6B。TFIP11在位点ID 445、HIVEP2在位点ID 763、NLRP3在位点ID 1072的分子量均小于理论分子量，说明检测到的蛋白均为这些蛋白的片段。途径分析显示了14个鉴定的蛋白中11个的相互作用(图5)。hnRNP A2/B1、hnRNP A1及其位于网络中心的复合物。值得注意的是，NF-kB、Akt和p53(由TP53基因编码)是该网络的中继点。这些蛋白质将直接和/或间接地与鉴定的蛋白质相互作用。

图5。鉴定蛋白的相互作用。路径分析的结果。红色和绿色标记分别表示igu处理后所鉴定的蛋白强度增加和降低。实线和虚线分别表示直接和间接的相互作用。箭头表示激活。

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讨论

我们比较了软骨肉瘤细胞系OUMS-27细胞在IGU存在和不存在之间的蛋白谱。反复给予50 mg/d IGU 14 d后，血浆浓度最高可达5 μM，但体内浓度不均匀，在ra感染关节[15]等组织中会达到更高水平。100 μM IGU处理后，OUMS-27细胞的蛋白谱发生了显著变化，即24 h和6 d后，41个蛋白点和150个蛋白点的强度分别发生了变化(p<0.05)(表1)。与24小时相比，大多数检测点的强度在第6天大大增加或减少(图2C, D)。持续的IGU处理会增强其对蛋白表达的影响。

6天处理后，37个蛋白点的强度发生了1.3倍以上的变化(表1)。这种蛋白表达水平的变化被认为影响了蛋白质的功能。在鉴定的14个蛋白中，我们重点研究了3个蛋白，hnRNP A2/B1, hnRNP A1和PPIA(表2，图4,5)。IGU降低hnRNP A2/B1和hnRNP A1多个位点的强度(表2)。这表明，无论异构体和/或翻译后修饰的差异，IGU都会降低这些蛋白的总表达量。

hnRNP A/B蛋白是hnRNP颗粒的组成部分，其主要功能是将pre-mRNA包裹到hnRNP颗粒[16]中。hnRNP A/B还在端粒维护、转录、pre-mRNA剪接、mRNA核质输出、mRNA稳定性和翻译中发挥作用。有趣的是，在RA患者和/或关节炎模型的炎症关节中发现hnRNP A2/B1和A1高表达[17-19]。大约30%和60%的RA患者中检测到针对hnRNP A2/B1的自身抗体和自身反应性T细胞[17,20,21]。由于hnRNP A2/B1的消耗几乎完全阻止了胶原诱导关节炎(CIA)和K/BxN血清转移性关节炎的发展，hnRNP A2/B1被认为在炎症性关节炎[22]的发病机制中发挥了关键作用。除了在关节炎中作为自身抗原，hnRNP A2/B1还作为促炎调节剂。hnRNP A2通过上调A-Raf全长转录和减少A-Raf[23]短显性阴性亚型的产生，激活位于NF-kB上游的Raf-MEK-ERK信号通路。此外，hnRNP A2被丝氨酸/苏氨酸激酶Akt1磷酸化并激活，也作为NF-kB c-Rel的转录辅激活因子[24,25]。NF-kB p65和p50是IGU的靶标[6,7,9,11]。因此，hnRNP A2激活的NF-kB c-Rel也可能是IGU的靶点。 Moreover, depletion of hnRNP A2/B1 almost completely inhibited bone erosion in RA models [22]. Since IGU suppresses bone erosion via RANKL- and ERK-mediating pathways [9,11,26,27], its effect to suppress bone erosion may be also associated with the decrease of hnRNP A2/B1.

我们的IPA结果表明，hnRNP A2/B1和hnRNP A1都能与p53相互作用(图5)。然而，OUMS-27细胞的p53以及大多数癌细胞的p53都是突变型，因此不能作为肿瘤抑制因子[13]。有趣的是，抑制hnRNP A1/A2可诱导多种人类癌细胞的凋亡，而与p53的表达[28]无关。这是因为hnRNP A1/A2作为G-tail结合蛋白在癌细胞[28]中具有端粒的封顶功能。抑制hnRNPs可抑制RA滑膜细胞的致瘤生长。

另一个感兴趣的蛋白，PPIA，通过IGU增加，IGU具有伴侣和信号传感器的双重功能(表2，图4,5)。有趣的是，PPIA在RA和CIA滑膜[30]中高表达。PPIA使巨噬细胞向促炎M1表型分化，产生IL-1β、IL-6、MMP-2和MMP-9，从而加重关节炎[30,31]。极化依赖于ERK-NF-kB p65通路的激活，也依赖于PPIase活性[30,32]。另一方面，与NF-kB p65协同，PPIA介导bmp -2诱导的Sox9的产生和软骨形成信号[33]的调控。这些过程可能有助于类风湿性关节炎受损软骨的修复。由于IGU以NF-kB为靶点，因此PPIA的增加可能会恢复NF-kB的功能。

总之，我们发现IGU影响OUMS-27细胞的蛋白质谱。IGU特异性降低hnRNP A2/B1和A1的表达，这两种蛋白在RA及其关节炎模型的滑膜中高度表达。由于hnRNP A2/B1是RA中的自身抗原和NF-kB的激活剂，hnRNP的减少将下调自身免疫反应，并参与IGU的NF-kB靶向机制。hnRNP A2/B1的减少可能进一步与IGU抑制骨侵蚀有关。目前的数据应该在不久的将来使用RA软骨细胞和滑膜细胞进行验证。我们的结果提示了IGU作用的新机制。

确认

作者感谢麻生太郎的技术援助。

的利益冲突

Kimito Kawahata获得了来自安斯泰来、礼来、Chugai制药和辉瑞的研究资助，以及来自小野制药的个人费用。

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