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摘要

本工作的目的是首次报告一例过敏反应患者的Pseudomyrmexacanthobius/favidulus用整个蚁体制备一种提取物，研究其生化和免疫特性，并验证这种非商业提取物的皮下免疫治疗的有效性。1例阿根廷女性患者，19岁，儿童时期有变应性鼻炎和支气管哮喘背景，因未确诊的昆虫叮咬和既往免疫治疗而反复出现过敏反应。昆虫学分析表明，入侵昆虫是蚂蚁的一种Pseudomyrmex属acanthobius或favidulus物种。ELISA法检测血清总IgE水平(202 UI/ml)，结果显示6 mm蜂群和耀斑反应(提取液稀释1/100000)阳性在活的有机体内皮内试验。提取蛋白部分样品用SDS-PAGE进行分析。银染蛋白条带范围为20 ~ 220 kDa。在电印迹脱敏治疗前，患者血清免疫识别的过敏原提取蛋白约为160、90和42/46 kDa的双条带。有趣的是，特异性皮下免疫治疗后，上述双条带几乎消失。经过6年的治疗，血清总IgE值大幅下降，特异性皮内试验在1/10稀释度以下为阴性。对处理耐受性较好。总之，我们的研究结果表明，免疫治疗与全身-Pseudomyrmex蚂蚁致敏提取物疗效显著，免疫治疗后消失的IgE特异性双蛋白致敏提取物条带(42/46 kDa)是致敏休克的主要原因。

关键字

致敏原，致敏性全身提取物蚂蚁，免疫治疗，棘假麦，法氏假麦

简介

在世界范围内，由蚂蚁叮咬引起的过敏反应发生率很低，但在上述膜翅目昆虫流行的地区，如南美洲，这些事件代表了重大的健康问题。虽然大多数对火蚁的过敏反应是由火红蚁，关于来自Pseudomyrmex属过敏反应仅2例由p . ejectus在美国被描述过。蚂蚁的鉴定，除火红蚁而且Solenopsis richteri据报道在人类中引起不良反应[1-6]。然而，由于事件较少常见的物种Pseudomyrmex acanthobius或Pseudomyrmex flavidulus至今尚未注册。

在这种情况下，过敏专科医生的随访对于调查可能的原因、进行广泛的风险评估以及通过制定个性化的减少威胁方案(包括在可能的情况下开始过敏原免疫治疗)来避免未来的事件至关重要。然而，过敏反应制度指南虽已建立，但在[1]过敏反应的循证基础上仍存在许多裂缝。针对刺虫超敏反应设计了实践参数更新，但未针对制药企业的药物推广。相反，起伏不定的医疗环境，但并不是所有的建议都适合所有患者[2]。意识到除进口火蚁外的其他物种对蚂蚁蜇伤或咬伤也能引起严重的过敏或不良过敏(ige介导)反应，或类似过敏反应但机制未知的即时反应，将推动对这些蚂蚁进行更快速的评估和治疗，包括进一步研究这些蚂蚁的医学昆虫学火红蚁而且Solenopsis richteri，导致人类的不良反应。然而，蚁亚科、蚁亚科、松蚁亚科、Ectatomminae、蚁亚科、假蚁亚科等6个亚科以及红火蚁、蚁亚科、粉蚁科、粉蚁科、粉蚁科、粉蚁科、扁蚁科、扁蚁科、扁蚁科、扁蚁科、扁蚁科、扁蚁科、扁蚁科、扁蚁科等10个属被认为是引起严重反应的其他输入性火蚁[6]。在此，我们提出了一例阿根廷年轻女性患者，19岁，来自农村地区，背景过敏性鼻炎和支气管哮喘的童年，在10年期间，出现了反复发作的过敏反应，由一种未识别的攻击昆虫。这项工作的目的是

I)报告一例由Pseudomyrmexant刺痛,
Ii)用特定的全身蚂蚁制备提取物，
Iii)研究它们的生化和免疫特性，
Iv)验证这种非商业提取物的皮下免疫治疗的疗效。

材料和方法

致敏提取物的制备

提取物的制备遵循在[7]中描述的Frugoni-Hansen方法(1970)。用乙醚脱脂后提取蛋白。Pseudomirmex用磷酸盐缓冲盐水(PBS)提取蚂蚁，在4℃按1:5 (w/v)的比例搅拌。4℃、500 g离心40 min后，用PBS透析。提取液用Millipore过滤器(Bedford, MA, USA) (0.22 mm)消毒。无菌对照，提取液冷冻保存-20℃，以牛血清白蛋白[8]为标准溶液，采用Bradford法测定提取液的蛋白浓度。

病人病史

特应性过敏症患者对Pseudomyrmex一名来自布宜诺斯艾利斯农村地区的年轻女子在阿根廷CABA Clínicas医院过敏和免疫学科接受治疗。儿童时期有变应性鼻炎和支气管哮喘的临床病史，10年期间反复出现过敏反应。该患者表现为IgE水平升高，并在精心制作的蚂蚁提取物(蛋白浓度为0.5 mg/ml)的皮肤试验(稀释1/100.000)中呈阳性。

患者的血清

选择患者和对照受试者，经静脉穿刺取用于血清成分分析的血液，4℃凝固，1000 g离心15 min，分离未溶血血清，等分-70℃保存备用。

酶联免疫吸附试验

sin paréntesis按照上述方法对致敏性样本进行ELISA检测，并进行了一些修改。人血清中特异性IgE的测定如前所述[9,10]。简单地说，用每孔50毫升(100mg /mL碳酸钠缓冲液pH 9.6)包覆微滴板，37℃孵育90分钟，用3%脱脂牛奶在0.1 M PBS中封闭。洗净后，用100 mL 1:10稀释的人蚂蚁阳性血清37℃孵育过夜。再用PBS-T洗涤后，每孔加入100 mL 1:2000稀释的过氧化物酶结合山羊抗人IgE, 37℃孵育2 h。在柠檬酸缓冲液中，pH 4.6，过氧化氢中，邻苯二胺发生反应。使用自动ELISA仪(MR 700, Dynatech Lab, Chantilly, VA, USA)在492 nm读取吸光度。每项测定在三个单独制备的重复试验中进行

体内皮内皮肤试验

根据Aas和Belin(1972)[11]进行皮肤试验，以测量过敏试验的反应性，并对照提取物。在早上进行皮肤试验，并在20分钟后根据组胺对照组的损伤大小进行分级，这是常规建立的。皮试当天，过敏患者和对照组均未服用类固醇、抗组胺药和免疫抑制药物。在测试前，所有受试者例行获得知情同意。

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

根据Laemmli(1970)[12]，在十二烷基硫酸钠存在的情况下，用10%聚丙烯酰胺微凝胶电泳25微克过敏原单提取物样品和标准分子量标记物。蛋白质的乐队Pseudomirmex用改良的[13]银染色法对经SDS-PAGE分离的提取物进行染色。

免疫印迹

按照Towbin等人(1979)[14]的描述，将sds - page分辨的蚂蚁提取蛋白电转移到硝化纤维膜上。简单地说，将膜条在封闭溶液(TBS, 50 mM, Tris, 150 mM NaCl, pH 7.6，含3%脱脂干牛奶)中浸泡90分钟，用1/10稀释度培养Peudomirmex-超敏患者血清在PBS中4℃过夜，然后与1:1000稀释的山羊抗人ige -过氧化物酶偶联物在室温下孵育90分钟。采用4-氯-1-萘酚和过氧化氢甲醇/PBS溶液进行显色。此外，封闭后，膜条，以1:100稀释的人血清进行测试，然后与兔抗血清孵育90分钟;洗净条带，用山羊抗兔IgG抗体(1:2000)处理，在室温下与碱性磷酸酶偶联90分钟。阴性对照为非特异反应者血清和正常兔血清。对于IgG和IgE蛋白提取条带的识别行为，在免疫治疗前和后用免疫印迹法孵育条带。

结果

第一步是识别肇事者昆虫，昆虫学结果显示它是属于蚂蚁Pseudomyrmex属和到两个可能的种p . acanthobius或p . flavidulus(图1)。

图1所示。研究标本的分类和照片。左侧显示纲、目、超科、科、亚科、属和二可能种;在右边，可以看到原始标本的照片

化学发光法初步生化测定显示血清总IgE水平较高(202 UI/ml)。关于世界医学协会《赫尔辛基宣言》的伦理原则，在事先知情同意和保持患者匿名之后，采用了Clínicas医院伦理委员会批准的方法(编号:26 0168/07)。的在活的有机体内采用特异的全体蚂蚁制备提取液和阳性对照、阴性对照进行皮内试验，1/10万稀释度提取液阳性，与阳性对照、阴性对照比较。处方内容包括避免蛰伤昆虫的教育和自我注射肾上腺素的指导。此外，在6年的时间里，通过常规的缓慢进展的给药计划进行了一种特殊的皮下免疫治疗，使用按照Frugoni和Hansen(1970)[7]的方法制备的全蚂蚁提取物。

另一方面，该提取物的银染SDS-PAGE显示20 ~ 220 kDa的银染蛋白带[12,13]。此外，western blotting分析显示，在脱敏治疗[14]前，患者血清IgE在大约160、90和42/46 kDa处识别出致敏提取物蛋白条带。有趣的是，经过免疫治疗后，上述双带几乎完全消失。相比之下，患者的血清IgG在治疗后才识别出一个双相似的表观分子量条带(图2)。

图2。Immunerecognition分析Pseudomyrmex提取液采用Western Blot检测，每道25 g。在图的左边，银染SDS-PAGE的10%Pseudomyrmex提取显示;1、2道分别对应IgE, 3、4道分别对应免疫治疗前后的IgG识别

对治疗的耐受性很好，尽管她在形成阶段意外地遭受了蚂蚁螫伤，导致过敏反应和第二次，在维持阶段，只有局部反应。治疗结束时，血清总IgE值降至正常水平在活的有机体内使用特定全身蚂蚁的皮内试验在1/10稀释度的提取物下呈阴性。

讨论

在此，我们报告了一个成功的使用全身提取物免疫治疗的案例Pseudomyrmex蚂蚁。这种免疫疗法能够诱导病人对蚂蚁的耐受。蚂蚁腹部部分可能包含多种与患者过敏反应无关的蛋白质，但考虑到此前文献[15]中对全身准备的丰富报道，我们选择全身作为最佳的手术可能选择，而不是只选择蚂蚁头部部分。此外，火蚁全身提取物不同于其他膜翅目全身提取物，保留其致敏活性，是诊断测试和免疫治疗的充分材料。此外，火蚁过敏的诊断很容易通过放射过敏吸收试验(RAST)或用火蚁全身提取物进行皮肤试验。有报道称，火蚁全身提取物免疫治疗可预防严重的反复全身反应[16]。一些人对美国三家主要商业供应商进口的火蚁全身提取物的检测或免疫治疗没有反应，这表明迫切需要对用于诊断和治疗进口火蚁敏感的致敏提取物进行标准化。众所周知，为了排除提取物制备过程中微生物污染的可能性，根据常用制备致敏提取物的Frugoni和Hansen方法(1970)，通过过滤器采用合适的过滤方法，避免了潜在的感染[7,17]。

几十年前，蚂蚁毒液被认为是经典和替代补体通路中有效的激活/灭活因子。在热带蚂蚁的毒液中发现了两个因子，F1和F2Pseudomyrmex sp．表现出胰酶样和强大的反互补活性。此外，当盘电泳本地蚂蚁毒液的热带蚂蚁Pseudomyrmex sp．毒液凝胶过滤后，除175 KDa和32 KDa洗脱的两种补体激活剂外，在聚丙烯酰胺凝胶电泳后，发现F1和F2与175 KDa和32 KDa之间的糖蛋白双带同时迁移。F1和F2具有相似的表观分子量，符合ige免疫反应双带42/46 kDa。我们可以认为，本研究中发现的双条带可能与之前提到的被命名为F1和F2因子[18]的糖蛋白相对应。然而，这需要进一步分析。

总之，我们的研究结果表明，免疫治疗与过敏原提取物制备的全身Pseudomyrmex结果表明，提取物中存在的IgE特异性识别的双蛋白带(42/46 kDa)与过敏反应有关，免疫治疗后消失。与这些结果相一致的是，免疫治疗后观察到一对表观分子量相似的蛋白条带(42/46 kDa)，并被IgG特异性识别。进一步的蛋白质组学研究应该会增加和揭示我们对这些迷人昆虫的知识，并确定特异性致敏蚂蚁提取蛋白，这不是本研究的目的。

值得一提的是，我们并不是假装向读者推荐这种免疫治疗方法，我们只是将其描述为一种独特的病例报告。为了推荐它，需要统计病人的数量。我们相信，这些案例报告可能有助于读者了解这种类型的案例出版物在拉丁美洲的存在，并取得良好的结果。

确认

我们要感谢Josens R.和Galvis Llanos J.博士在蚂蚁标本鉴定过程中提供的技术援助，以及Leticia Orellana提供的技术援助。

的利益冲突

作者没有利益冲突声明。

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