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摘要

背景:Dickkopf-1蛋白(Dkk1)是Wnt/β-catenin信号通路的主要抑制剂，是一种分泌性糖蛋白，已被发现参与多种人类疾病的发病机制，并在多种癌症实体中提供了一种有前途的诊断和治疗工具。子宫内膜异位症与侵袭性肿瘤有一些共同特征。本研究旨在探讨子宫内膜异位症中Dkk1表达是否异常。

方法:188名受试者，包括109名经组织学证实的子宫内膜异位症女性和79名健康女性。用ELISA法测定了97例子宫内膜异位症患者和75例非子宫内膜异位症患者的血清Dkk1水平。采用定量聚合酶链式反应检测Dkk1-和β-catenin在28种不同人体组织类型(包括4种正常子宫内膜组织、8种正常腹膜组织和16种子宫内膜异位症组织)中的基因表达水平。

结果:子宫内膜异位症患者w预兆患者血清Dkk1水平明显高于健康女性[分别为2999 pg/ml(947-5104)和2216 pg/ml (1008-4109);p < 0.0001)。Dkk1基因表达水平在不同组织类型间无显著差异，但在子宫内膜异位症组织组内，其表达水平在病情较严重的情况下上调。β-catenin基因在子宫内膜异位症组织中表达较正常子宫内膜组织下调。

结论:据我们所知，这是第一个调查子宫内膜异位症患者血清中Dkk1水平的研究。我们的结果显示子宫内膜异位症中Wnt/β-catenin信号的两个主要成分表达异常。对这一信号转导途径的干预可以有助于疾病控制和治疗的新靶点的开发。Dkk1可作为诊断子宫内膜异位症的生物标志物。然而，还需要进一步的多中心大规模研究。

关键字

Wnt /β连环蛋白信号，dickkopf-1 (Dkk1)，子宫内膜异位、生物标志物、致病性

简介

Wnt/β - catenin信号通路是由β - catenin稳定性的严密调控介导的，众所周知，它参与了全身广泛的生理和病理过程。在Wnt存在的情况下，通过将Wnt蛋白结合到卷曲(Fz)家族受体和其他共受体(如脂蛋白受体相关蛋白(LRP)-5/6)的n端胞外半胱氨酸丰富结构域，信号传递得以继续。这种结合启动信号级联，抑制所谓的“破坏复合体”，以β-连环蛋白为靶点进行泛素介导的蛋白酶体降解。因此，游离的细胞质非磷酸化β-catenin积累并重新定位到细胞核中，并与不同的转录因子结合，促进Wnt下游靶标基因的广泛谱转录，包括促进细胞增殖和存活的靶标基因。在Wnt缺失的情况下，破坏复合体诱导β-连环蛋白磷酸化，导致其降解[1]。

在子宫内膜中，Wnt/β - catenin信号通路在子宫内膜腺体形成和间质发育中起决定性作用，参与异位子宫内膜[2]的粘附、侵袭和血管生成。Sanchez及其同事发现，子宫内膜异位症患者的黄体化颗粒细胞中Wnt通路的特异性成员及其中枢分子β-catenin的表达与对照组相比存在失调。这种异常表达以细胞凋亡增加为特征，提示Wnt/β-catenin信号通路可能参与了颗粒细胞闭锁[3]的发生。此外，已有研究表明，Wnt/β-catenin信号通路通过刺激的纤维化标记物的表达来触发与子宫内膜异位症相关的纤维化发生，这些作用可通过该信号通路的某些成分[4]的小分子拮抗剂治疗而阻止。张等．E2对人子宫内膜基质细胞(HESCs)的刺激增加了血管内皮生长因子(VEGF) mRNA的表达，而当细胞转染β-catenin si-RNA时，这种作用可以被阻止，这表明Wnt/β-catenin信号通路可能通过血管生成刺激[5]启动子宫内膜异位症。

Dickkopf (Dkk)蛋白，以Dkk1为例，是LRP5/6配体拮抗剂，被认为是Wnt/β-catenin信号[6]的有效抑制剂。Dkk1的过表达与多种疾病相关，包括各种类型的癌症。[7]和抗Dkk1抗体正在实验和临床中作为不同骨病和癌症的潜在治疗药物进行测试，初步结果显示其良好的安全性和有前途的治疗方案[8,9]。我们之前报道过，乳腺癌患者外周血中Dkk1蛋白水平比对照组女性高。此外，乳腺癌细胞和癌周围组织中Dkk1蛋白表达增加已被证实。此外，血液中Dkk1水平升高与肺癌和宫颈癌的不良预后呈正相关[11,12]。因此，血液中Dkk1的水平可作为某些癌症实体的非侵入性诊断和预后生物标志物。

许多受影响的妇女对子宫内膜异位症的诊断往往被拖延，导致生活质量降低，生殖潜力和生育能力下降，造成严重的经济负担[13,14]。尽管直接腹腔镜可视化和组织学确认仍然是诊断子宫内膜异位症的金标准，但一种非侵入性工具可以促进早期诊断和干预，最终改善疾病后果。血液中Dkk1的水平被认为是一种有利的生物标志物，因为它是非侵入性的，检测方案简单，量化成本低。本研究旨在研究子宫内膜异位症女性与健康女性相比，血液中Dkk1蛋白水平和/或其组织基因表达是否存在失调。

材料与方法

研究参与者和抽样

我们的研究包括188名妇女，其中79名健康妇女和109名子宫内膜异位症妇女。研究案例系列的细节如图1所示。患者队列从2013年5月至2016年12月在我科收治的有子宫内膜异位症体征的女性中招募。入选标准为组织学证实的子宫内膜异位症，近期无宫腔病理发现。从97例女性患者中提取血清样本。患者特征见表1。抽取样本时患者的中位年龄(范围)为34岁(16-52岁)。根据修订后的美国生殖医学学会(rASRM)[15]确定疾病分期。收集75例年龄匹配的健康女性[30岁(19-52岁)]血清。这些健康队列是从我们大学附属医院输血医学研究所献血前进行过全面体检的人群中招募的。 All serum samples were frozen in aliquots at -80°C until being analysed.

图1所示。研究案例系列的详细信息

表1。血清中检测Dkk1水平的患者特征

	患者人数	％
所有的病人 年龄:中位数(范围)年	97 34 (16-52)	100％
疾病发生 首次诊断的患者 复发一次的患者 患者有一次以上复发	54 30. 13	55.7 30.9 13.4
疾病分类__ 浸润不深 深层渗透	83年‡ 14	85.6 14.4

†病例根据修订后的美国生殖医学会(rASRM)。‡包括轻度子宫内膜异位症47例，轻度子宫内膜异位症17例，中度子宫内膜异位症19例。

从22例腹腔镜手术中子宫内膜异位症的妇女中收集组织样本。标本包括16个子宫内膜异位症组织和8个正常腹膜组织，其中2个匹配的正常腹膜和子宫内膜异位症组织来自同一患者。此外，我们还收集了4例因子宫内膜异位症以外的良性适应症而接受腹腔镜手术的妇女的正常子宫内膜组织样本。健康对照组排除了子宫内膜病变。组织直接在液氮中快速冷冻，并立即转移到-80°C直到使用。

所有研究参与者都没有怀孕记录，也没有恶性肿瘤史。

这项研究得到了萨尔州医学协会当地伦理委员会的批准(参考编号:23/16)。在签署一份经伦理委员会批准的书面知情同意后，从所有个人收集人体血液样本和组织样本。

血清分析

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测75名健康女性和97名患者女性血清中Dkk1的蛋白水平，使用来自R&D Systems®(德国)的人Dkk1 (QC241)和人Dkk-1 Quantikine ELISA试剂盒(DKK100B)的Quantikine免疫测定对照集921。使用96孔微板阅读器(Sunrise-Tecan, Life Science)测量光密度。Dkk-1浓度通过与标准曲线拟合的四参数逻辑曲线得到，并使用Magellan 7.2墨水数据分析软件(Life Science-Tecan)乘以稀释因子。所有测量均重复进行。

组织分析

组织学检查:从获得的组织样本进行冷冻切片，然后根据冷冻组织的苏木精和伊红(H&E)协议进行染色。然后在Zeiss显微镜下(Axioskop 40, Carl Zeiss, Germany)分析染色切片，并使用Axiovision Documentation Rel.4.8程序用附带的数码相机(AxioCam MRC, Carl Zeiss, Germany)拍摄选定的图片。组织学评估由我们大学医院病理科一位经验丰富的病理学家完成。子宫内膜异位症的组织学诊断可通过子宫内膜腺体和间质伴或不伴含有血红素的巨噬细胞来确认。所有腹膜组织检查均为阴性诊断(图2)。

图2。子宫内膜异位症组织冷冻切片的苏木精和伊红(H&E)染色。子宫内膜异位症的组织学诊断可通过子宫内膜腺体(黑色箭头)和间质(绿色箭头)伴或不伴含有血红素的巨噬细胞来确认

RNA提取和互补脱氧核糖核酸的合成:分析了4个正常人子宫内膜组织、8个正常腹膜组织和16个子宫内膜异位症病变中的Dkk1-和β-catenin基因水平。最大数量的15-20 mg冷冻组织被分配和均匀化在300 μ l的RNeasy裂解缓冲液(Qiagen, Valencia, CA, USA)中，使用TissueLyser LT适配器和Qiagen的不锈钢珠。按照制造商的说明，使用RNeasy MiniKit (Qiagen, Valencia, CA, USA)进行RNA提取。此后，Ambion®TURBO DNA-免费的™DNase试剂盒(Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany)用于从RNA制剂中去除污染的DNA，随后从样品中去除DNase和二价阳离子。用Thermo Scientific™NanoDrop 2000测定提取的RNA的浓度和纯度。此外，进一步检测RNA完整性使用Agilent RNA 6000纳米试剂第一部分(安捷伦科技公司技术公司，Waldbronn, Germany)和安捷伦技术公司的生物分析仪Agilent 2100。随后，用制造商(美国福斯特市应用生物系统公司)描述的高容量cDNA逆转录试剂盒合成逆转录互补DNA (cDNA)。

实时RT-PCR:检测了PCR效率，以确认结果不会受到RNA样品中污染DNA扩增的影响，发现检测的Dkk1-和β-catenin基因的PCR效率在90%到100%之间。甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)被用作管家基因。用TaqMan对稀释10 ng cDNA的3个副本进行实时荧光定量PCR^®生命科技的基因表达测定(表2)应用生物系统公司的7500快速实时PCR系统。所有具有周期阈值的样本(C_t)变异系数值>5%重新检验。此外，在每次运行中都包含无模板控件(NTC)C_t值被归一化为GAPDH信使rna表达。RT-PCR数据使用7500 Software v.2.0.5 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany)进行分析。

表2。TaqMan^®用于定量RT-PCR的基因表达测定

基因	Taqman分析ID
dkk1	Hs00183740_m1
CTNNB1（ß连环蛋白）	Hs00355045_m1
GAPDH一个	Hs03929097_m1

^一个内源性基因

统计分析:所有统计检验均以5%的双侧比较显著性水平进行。对连续变量进行描述性分析，使用均值、标准差、中位数和观测值的极差。使用绝对频率和相对频率对分类变量进行描述性分析。零假设采用双尾学生t检验和曼-惠特尼检验U对参数和非参数连续数据分别进行kruskal - wallis检验。本研究获得的所有数据均采用SPSS 21版本(IBM, Armonk, NY, USA)进行分析。

结果

子宫内膜异位症患者血清中Dkk1水平升高

测定了97例子宫内膜异位症患者[年龄:平均(范围):34(16-52)岁]和75例年龄匹配的健康妇女[30(19-52)岁]的血清Dkk1水平。我们的研究结果显示，子宫内膜异位症患者的血清Dkk1水平明显高于健康女性[平均值(范围):2999 pg/ml(947-5104)]。vs2216 pg/ml (1008-4109);p<0.0001](图3)。

图3。健康妇女和子宫内膜异位症患者血清Dkk1水平(pg/ml)患者血清dkk1水平[2999 pg/ml(947-5104)]明显高于对照组[2216 pg/ml (1008-4109)] (p< 0.0001)]

然后，我们根据疾病发生情况和疾病分类比较了不同亚组之间的血清Dkk1水平，未见明显差异(表3)。

表3。不同亚组患者血清Dkk1水平(pg/ml)

特征	子群1	子群2	子群3	子群4	p
疾病发生	首次诊断的患者 3031年(1408 - 4579)	复发一次的患者 2889年(1008 - 5104)	患者有一次以上复发 3034年(974 - 4214)	-	NS
疾病分类	深层渗透 2811年(1678 - 3820)	最小的 3279年(1408 - 5104)	温和的 2848年(1953 - 3647)	温和的 3145年(947 - 4597)	NS

结果显示为[中位数(范围)]。P值用Kruskal-Wallis-Test进行检验。NS:不显著。

Dkk1和β-正常的catenin正常的子宫内膜组织腹膜组织和子宫内膜异位症组织

为此，我们收集了4名女性(年龄分别为26岁、44岁、44岁和46岁)的子宫内膜组织，她们因子宫内膜异位症以外的良性适应症而接受腹腔镜手术。此外，我们收集了22例患者的正常腹膜组织和子宫内膜异位症组织。最终有效用于实时PCR检测的组织包括16个子宫内膜异位症组织和8个正常腹膜组织，其中2个匹配的正常腹膜和子宫内膜异位症组织。其余样本因提取的RNA纯度和完整性较低而被排除在研究之外。进行基因表达检测的患者特征如表4所示。

表4。Dkk1-和ß-catenin基因表达检测患者的特征

	患者人数	％
所有的病人 年龄:中位数(范围)年	22 35 (24-46)	100％
疾病发生 首次诊断的患者 复发一次的患者 患者有一次以上复发	9 7 6	40.9 31.8 27.3
疾病分类__ 浸润不深 深层渗透	16‡ 6	72.7 27.3

病例根据修订后的美国生殖医学会(rASRM)进行分类。‡包括轻度子宫内膜异位症7例，轻度子宫内膜异位症3例，中度子宫内膜异位症6例。

我们的RT-PCR结果显示dkk13个测试组织组内的表达水平(图4A)。然而，在子宫内膜异位症组织组中，我们发现dkk15个深浸润性子宫内膜异位症组织表达水平显著高于11个非深浸润性子宫内膜异位症组织表达水平[均值(范围)∆C_t分别为3.4±2.8 vs 8.32±4.16;p=0.032](图4B)。表达水平dkk1无因疾病发生状态而异。

图4。Dkk1在不同组织样本中的基因表达水平。答:正常子宫内膜、正常腹膜和子宫内膜异位症组织样本中Dkk1基因表达水平差异不显著。B:深浸润的子宫内膜异位症组织样本中Dkk1基因表达水平明显低于非深浸润的子宫内膜异位症组织样本

另一方面，我们发现β连环蛋白与正常子宫内膜组织相比，子宫内膜异位症组织中的表达水平下调(图5)β连环蛋白在其他组织组之间报告表达水平。此外,β连环蛋白子宫内膜异位症组织中的表达水平没有根据患者的任何规格(包括疾病发生状态和疾病严重程度)发生显著变化(数据未显示)。

图5。β-连环蛋白在不同组织样品中的基因表达水平。子宫内膜异位症组织样本中Dkk1基因表达水平明显低于正常子宫内膜组织样本

讨论

子宫内膜异位症被认为是一种受免疫、激素和环境因素影响的多因素疾病。然而，Sampson’s retrograde hypothesis仍然是最被广泛接受的理论，其主要部分暗示上皮向间充质转化(EMT)是致病机制[16,17]。Wnt/β-catenin信号通路被认为是EMT激活和调节[18]的关键。如前所述，异常的Wnt/β-catenin信号通路通过多种机制与子宫内膜异位症的发病有关[3-5]。在本研究中，我们发现子宫内膜异位症患者血清中Dkk1蛋白的丰度明显高于健康人群。然而，我们发现在我们的研究队列中，Dkk1血清水平不受疾病严重程度或疾病发生的影响。血清Dkk1被认为是一种有利的生物标志物，因为它具有简单的非侵入性检测方案和廉价的量化。然而，其水平的巨大可变性和非正态分布影响了确定一个明确的临界值或与组间临床特征相关的显著差异的机会。因此，绝对需要进一步的大规模和多中心研究来证实我们的发现，将血清Dkk1水平作为子宫内膜异位症的诊断生物标志物。

我们进一步在mRNA水平上检测了Dkk1的表达是否也存在异常。我们测定了子宫内膜异位症患者组织中dkk1的表达水平，并将其与非子宫内膜异位症患者的正常子宫内膜组织或子宫内膜异位症患者的正常腹膜组织中的表达水平进行了比较。此外，我们检测了β-catenin的表达水平，以研究dkk1是否通过其作为Wnt/β-catenin信号通路抑制剂的功能直接参与子宫内膜异位症的致癌性。我们的结果显示，在测试的组织组中，dkk1表达水平没有显著变化。然而，与血清中Dkk1蛋白浓度不同的是，与病情轻的患者相比，深浸润性子宫内膜异位症患者子宫内膜异位症组织中Dkk1表达水平升高。此外，血清中Dkk1水平与同一患者子宫内膜异位症组织中Dkk1表达水平无显著相关性。这些发现表明，转录水平本身不足以预测这种情况下的蛋白质水平，从而解释基因型-表型的关系。此外，作为一种分泌性糖蛋白，其或其配体的二次修饰的差异可能会影响其生物学特性和功能。

Wnt/β-catenin信号元件在子宫内膜异位症中的表达谱，特别是Dkk1，已经在一些小规模的人体研究中进行了研究，并证实了相互矛盾的结果。Pazhohan和同事的研究结果显示，虽然Dkk1基因-和蛋白在子宫内膜异位症患者的子宫内膜异位症病变和异位子宫内膜中的表达水平明显低于健康受试者的子宫内膜，但非磷酸化β-catenin (β-catenin的活性形式)在蛋白水平上表达较多，只有[19]。对8例子宫内膜异位症患者的子宫内膜活检和7例非子宫内膜异位症妇女的子宫内膜活检进行芯片分析，发现91个基因显著上调，115个基因显著下调，包括Dkk1基因[20]。Brueggmann和他的同事发现，与[21]子宫内膜异位症患者的匹配子宫内膜样本相比，卵巢子宫内膜异位症组织中dkk1和E-cadherin的基因表达水平下调。来自这些研究的数据证明，与患有或未患有子宫内膜异位症的受试者的非子宫内膜异位症组织相比，子宫内膜异位症组织中dkk1表达下调。另一方面，有研究表明，与子宫内膜异位症和非子宫内膜异位症妇女的异位子宫内膜相比，子宫内膜异位症组织中的β-catenin mRNA表达水平没有明显的周期性差异[19,22]。然而，最近两项研究报道了β-连环蛋白表达的矛盾观察结果。在腹膜子宫内膜异位症大鼠模型中，20只雌性大鼠的子宫内膜异位症样品及其匹配的子宫内膜样品中β-catenin mRNA和β-catenin蛋白水平无差异。

在我们的研究中，虽然在子宫内膜异位症患者的子宫内膜异位症组织中dkk1表达水平与正常腹膜组织中几乎相同，而在无子宫内膜异位症受试者的正常子宫内膜中dkk1表达水平较低，但这些观察结果在统计学上不显著。然而，与正常子宫内膜组织相比，β-catenin mRNA水平在子宫内膜异位症组织中下调，而在正常腹膜样本中没有。我们的研究与其他研究的这些不一致的观察结果可能与队列特征的差异有关，如检测病例的数量、周期阶段、子宫内膜异位症病变的位置和疾病分期。

总之，本研究证实子宫内膜异位症患者中Wnt/β-catenin信号通路的某些成分表达异常，表现为β-catenin mRNA表达水平下降，Dkk1蛋白表达水平升高，提示该转导通路参与了子宫内膜异位症的致癌性。据我们所知，这是第一个调查子宫内膜异位症患者血清中Dkk1水平的研究。因此，Dkk1可能是诊断子宫内膜异位症的有用指标。然而，这一假设还需要通过大规模、多中心的研究来进一步探索，以证明Dkk1作为子宫内膜异位症潜在的诊断蛋白生物标志物的作用。

确认

作者要感谢萨尔大学医学院病理科的Adriana Nistor女士，感谢她的助手对本研究纳入的所有H&E切片进行组织学评估。

利益冲突

我们声明我们之间没有利益冲突。

资金

这项研究没有从任何公共、商业或非营利部门的资助机构获得任何具体的资助。

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