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摘要

Western Blotting (WB)对免疫沉淀的初步分析表明，colin和TLP沉淀在相同的水平(约50 KDa)，并被相同的抗体识别。与此同时，免疫沉淀试验通过使用来自肺癌细胞A549和NCI-H23的细胞提取物来改进，目的是获得只含有TLP的沉淀。事实上TLP的部分氨基酸序列与人类科林的序列具有高度的同源性(只有一种氨基酸不同)，并以不同的亚型存在于肺癌中。众所周知,人类corin主要表达在细胞和蛋白质从细胞中提取来自细胞外介质和转染质粒,其过表达corin,展示了几个乐队的sds - page分析相当于乐队(约50 - 100 KDa)由anti-TLP观察在世行分析。

关键字

TLP, NSCLC，科林，免疫治疗，疫苗

介绍

虽然手术、放疗和化疗能够治愈许多癌症，但需要新的方法来改善根治性治疗。一种可能的途径是利用在癌症[1]免疫学和遗传学方面的最新研究成果。肿瘤免疫治疗[2]，或自然发生的溶瘤免疫反应的操作，是基于观察到肿瘤细胞抗原刺激动物和人体内的特异性体液和细胞抗体[3]的发生。已经遇到的某些困难反映出缺乏纯化良好的抗原和/或它们在癌症患者中消除细胞免疫障碍的能力。

已知有两种方法可以增强宿主的免疫力:特异性激活(卡介苗)和特异性激活(刺激溶瘤细胞循环和细胞抗体)。此外，一些研究人员已经对通过各种纯化程序获得的自体和同源人类癌细胞的抗原进行了治疗试验[4,5]。

Tarro的第一次观察等．[6]证明当TLP从肿瘤中提取，在实验室中纯化，并重新引入患者体内时，它增强了免疫系统的癌症反应能力[7]。由于肺癌是西方世界中死亡人数最多的癌症，TLP可能有极大提高治愈率的潜力，或作为肺癌疫苗(表1)[8]。

表1。肺癌肿瘤释放蛋白及其免疫治疗前景。

TLP作为肿瘤相关抗原

50kd蛋白在肺中过表达 肿瘤和其他上皮细胞 腺癌

人类免疫原性的证据是 血清抗体

科林是一种激活利钠肽的心脏丝氨酸蛋白酶。它由n端细胞质尾、跨膜结构域和c端胰蛋白酶样蛋白酶结构域的胞外区域组成。跨膜结构域锚定在心肌细胞表面。到目前为止，蛋白胞质尾的功能仍不清楚。Corin与TLP具有高度同源性，在肺[10]中以多种亚型存在。如果用凝血酶切割的片段是相同的，数据将支持TLP和corin是同一种蛋白质的假设。同时，我们使用质粒转染和过表达人科林，目的是通过Western blotting(使用抗tlp和抗科林抗体)来评估这两个蛋白实际上是相同的蛋白还是不同的。

材料和方法

抗原合成及抗体生产

tlp衍生的肽RTNKEASI[23]和两种不同的兔多克隆抗RTNKEASI免疫血清在Rockland Immunochemicals Inc. (Gilbertsville, PA, USA)和Biogenes GmbH (Berlin, Germany)进行合成。Rockland公司生产的抗tlp血清经层析纯化得到抗RTNKEASI肽。

细胞培养

人细胞系A549、CA46、HL60、MCF7、MRC-5、Hela和PC3取自美国型培养物(ATCC;美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。A549, MRC-5 HL60、海拉和MCF-7细胞系培养在Glutamax杜尔贝科修改鹰的介质(Gibco,生活技术),CA46细胞系在Glutamax RPMI 1640 (Gibco,生活技术),和曲泽细胞系Glutamax火腿的F-12 (Gibco,生活技术),补充10%胎牛血清(Biochrom GmbH,柏林,(德国)在5% CO的潮湿环境中，温度为37°C₂根据空中交通管制委员会的建议。

免疫印迹

从A549、CA46、HL60、MCF7、MRC-5、Hela和PC3细胞株制备细胞微球，并如前所述进行裂解。

5X10细胞培养上清⁶A549细胞孵化了冰冷的10%三氯乙酸(TCA)在冰上30分钟然后离心机在4°C 14000 rpm 30分钟。颗粒与冰冷的孵化90%丙酮为20分钟在-20°C。离心后,小球是干30分钟的65°C。

蛋白(30µg)重悬在4X Laemmli样品缓冲液(100 mM Tris-HCl, pH 6.8, 4%十二烷基硫酸钠(SDS)， 20%甘油，200 mM二硫苏糖醇(DTT)和0.01%溴酚蓝)中，煮沸5分钟，并用8%丙烯酰胺(Applichem GmbH, Darmstadt, Germany) SDS- page凝胶溶解。将蛋白印迹在活化的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Millipore, Bedford, Mass)，在阻断缓冲液(脱脂奶粉8% + PBS + 0.1%吐温-20)中培养，然后在4°C下用抗rtnkeasi血清1:1000 (Biogenes, Berlin, Germany;Rockland Immunochemicals, PA, USA)或ß-actin 1:2000 (Biolegend, San Diego, CA)。将相应的辣根过氧化物酶结合的二抗在PBS + 0.1% Tween-20 + BSA 5%中稀释1 h后，用增强化学发光(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)检测免疫反应条带。

肽竞争分析

将抗RTNKEASI血清用PBS + 0,1% Tween-20 + BSA 5%缓冲液1:1000稀释，然后用500倍摩尔量的肽RTNKEASI或对照肽KDSGNEQTFLPP在室温下孵育1小时，然后在37℃温和摇晃1小时。通过离心将预培养的抗体样品从免疫复合物中清除，然后与转移到PVDF膜上的A549裂解物杂交2小时。用0.1%的PBS + Tween-20洗涤去除非结合抗体后，按常规western blot方法处理膜。

二维聚丙烯酰胺凝胶电泳

如前所述，从A549和MCF7细胞株中提取蛋白。通过使用pH 4-7梯度线性的7cm固定pH梯度(IPG)干条进行第一维等电聚焦(GE Healthcare)。取50µg可溶性蛋白，加入1%溴苯酚蓝1 μl复水缓冲液(8M尿素、2M硫脲、2% 3-[(3-胆胺丙基)二甲基氨酰]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、50 mM DTT和0.5% IPG缓冲液)，置于室温下孵育过夜。蛋白质分离由能源论坛千变万化的合作系统(Bio-Rad)使用编程电压梯度在20°C电流限制在黑暗中每条50µ在下列条件:4 h在250 V, 8000 V线性梯度15000 Vh,快速8000 V 75000 Vh,总共90套。用缓冲液A (0.05M Tris-HCl, 6 M尿素，20%甘油，2% SDS和130 mM DTT)和缓冲液B(含4.5%碘乙酰胺代替DTT)平衡第一维条带10分钟。在第2个方面，将平衡条应用于8%丙烯酰胺(Applichem GmbH, Darmstadt, Germany) SDS-PAGE凝胶的顶部，并用1%琼脂糖(SDS-Tris-glycine buffer)与微量BPB作为跟踪染料制备)密封，以监测电泳。根据western blot程序，通过银染色或转移到PVDF膜(Millipore, Bedford, Mass)上，并与抗rtnkeasi血清孵育。

结果

Western blotting显示，colin和TLP似乎在相同的水平(约50 KDa)沉淀，并被相同的抗体识别。同时从俄亥俄州克利夫兰的Qingyu教授那里获得了转染HEK-293细胞并过表达人科林蛋白的质粒，目的是通过Western blotting(使用anti-TLP和anti- colin)来评估这两个蛋白是否真的是相同的蛋白。与此同时，免疫沉淀试验通过使用来自肺癌细胞A549和NCI-H23的细胞提取物来改进，目的是获得只含有TLP的沉淀。这一结果将使TLP的氨基末端片段得到更好的序列，并进一步使TLP与科林之间的同源性得到更详细的研究。

从参考文献的仔细分析有关人类corin张力腿平台和分析质谱(准备)和从我们的数据,张力腿平台存在于细胞内的更多数量和在非小细胞肺癌特异性比在小细胞肺癌corin。

事实上TLP的部分氨基酸序列与人类科林的序列具有高度的同源性(只有一种氨基酸不同)，并以不同的亚型存在于肺癌中。从文献中得知，人的科林主要在细胞外表达，从细胞外培养基和转染了质粒的细胞中提取的蛋白，过度表达科林，在SDS-PAGE上显示了与anti-TLP分析的Western blot中观察到的条带(约50-100 KDa)相当的一些条带。

因此，通过质谱鉴定为TLP的蛋白带揭示了之前描述的TLP复合物中至少一个组分的分子性质。

结论

TLP是从肿瘤中提取的一种新蛋白体内转化细胞体外(图1)[8]．

图1所示。在体外和在体内张力腿平台功能。

TLP可在血液和癌症组织中检测到[11,12]。

TLP是50kd单体的肿瘤相关抗原[13,14]。

TLP在肺肿瘤[13,14]和其他上皮性腺癌中过表达[15,16]。

血清抗体[17]证明TLP在人体内具有免疫原性。

肺组织芯片的初步信息见表2。

表2。TLP对抗体的敏感性和特异性。

组织芯片谱图(a)
		非小细胞肺癌阶段我 组织	积极性 (%）		消极 (%）
		400	56.3 (225/400)		43.7 (175/400)
		正常的肺 组织	积极性 (%）		消极 (%）
		400	0 (0/400)		One hundred. (400/400)
	(a)由加州大学旧金山分校癌症中心实验室细胞分析的William C. Hyun博士进行。

目前正在进行研究，通过蛋白质组学方法获得TLP的完整序列，以获得足够的抗原制备，可能用于早期诊断，并可能产生特异性抗癌疫苗[18]。

TLP的观点如下:

• 由于其序列在人类和动物模型中刺激细胞毒性免疫反应，因此有可能基于TLP表位和人源化抗体设计潜在的非小细胞肺癌(NSCLC)和结直肠癌(CRC)的主动和被动免疫疗法[19,20]。
• TLP的片段可以用来刺激免疫反应来攻击现有的肿瘤[9,21]。
• 高危人群可接种TLP片段，以刺激免疫应答未检测或新发展的肿瘤[22,23]。
• 因此，免疫系统识别TLP的能力是该领域研究的主要诊断和治疗靶点。

利益冲突陈述书

作者声明没有利益冲突。

参考文献

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