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摘要

与炎症相关的胰岛细胞功能丧失是糖尿病的一个特征。暴露于炎症介质中的β细胞和胰岛可提高活性氧物种，促进局部因子的释放，并激活导致β细胞功能障碍的信号通路。在炎症环境中保护β细胞功能的新策略将是糖尿病治疗的关键。一个基于抗炎化合物Lisofylline (LSF)的小化合物库已经被研究，以确定新的分子，为暴露于炎症细胞因子的β细胞提供保护。化合物c42有效。葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少和β细胞凋亡增加是β细胞功能障碍的标志，在β细胞系和原代胰岛中添加c42后这些特征得以保留。在1型糖尿病的非肥胖糖尿病(NOD)小鼠模型中，c42延缓了高血糖的发生，并降低了50%的糖尿病发生频率。总的来说，这些数据支持c42 / c42样化合物在糖尿病中的治疗潜力。

关键字

细胞功能，糖尿病，炎症，细胞因子，小分子抑制

介绍

细胞功能的丧失是糖尿病的核心病因。炎症在1型糖尿病和2型糖尿病的病理生理学中都很重要[1,2]。β细胞功能障碍、β细胞凋亡和β细胞去分化是公认的由炎症和接触促炎细胞因子介导的病理结果[3-6]。炎症细胞因子介导物诱导氧化应激，并产生额外的局部介导物，导致功能性细胞的丧失[7-9]。在炎症环境中保持细胞功能将是糖尿病治疗的关键成就。

正在评估用于糖尿病患者护理的破坏炎症级联反应的新生物制剂，并且抗炎作用可能是现有糖尿病药物的一个组成部分，综述[10]。短暂降低HbA_{1 c}(一种持续高血糖的标记物)在人类2型糖尿病的临床试验后被报道了，该临床试验使用生物制剂扰乱白细胞介素-1 β，并支持通过破坏炎症作为一种保留β细胞功能的策略[11-13]。据报道，Lisofylline (LSF)是一种小分子，通过抑制STAT4和/或白介素-12 (IL-12)的激活来破坏炎症，它可以阻止1型糖尿病NOD小鼠[14]模型中自发糖尿病的进展。LSF通过IL-12受体信号阻断和抑制IL-12驱动的Th1分化和T细胞增殖[15]机制抑制Th1介导的疾病(例如过敏性实验性脑脊髓炎)。数据表明，LSF可阻断IL-12信号通路，因为LSF可抑制IL-12诱导的STAT4磷酸化，并阻止细胞因子介导的IFN-γ的产生[16,17]。STAT4对1型糖尿病发展的重要性已经通过在STAT4缺陷[18]的NOD小鼠中保护1型糖尿病得到证实。此外，STAT4位点的多态性与人类[19]中早发型1型糖尿病相关。LSF作为人类治疗药物的潜力受到其可忽略的低半衰期的高度限制。Cui等合成了LSF分子的类似物，建立了有限的化合物库[20]。这个小的，但集中的，类似lsf的化合物库的新分子，以保存炎症环境中的细胞功能，已确定化合物42 (c42);一种有效的小分子，能保护β细胞和胰岛免受炎症细胞因子的破坏作用。 Proof-of-concept study in the non-obese diabetic (NOD) mouse model identified compound c42 as a candidate new compound lead for the development of strategies based on small molecules that confer protection to beta cells in diabetes.

材料和方法

道德

协议和程序经过相关机构监管委员会的审查和批准，并符合ARRIVE准则。

细胞系和原代胰岛

INS-1(大鼠β细胞系)和TC3(小鼠β细胞系)按前述[21]培养。人类供体胰岛来自整合胰岛分布计划(https://iidp.coh.org)。每次实验至少使用三个独立的供体。供体未被确定为糖尿病患者，仅根据供体是否可用而选择;年龄、性别或BMI不匹配。采用胆总管插管和胶原酶消化[14]法分离小鼠胰岛。原发性胰岛在使用前是手工挑选的。

分子的选择

从类lisofylline文库的分子被重新合成(Medchem Source, Federal Way, WA)。分子在DMSO中溶解10mM。分子相对于LSF进行迭代评估。初步筛选和选择的化合物分子进步是基于排序能力抑制γ干扰素诱导的基因表达,IL-12p35, IL-12p40, STAT4 INS-1细胞后4和24小时接触促炎细胞因子(图片:5 ng / ml il - 1β,10 ng / ml TNF -α,100 ng / ml干扰素-γ;R&D Systems，明尼阿波利斯，MN)。候选化合物的浓度范围为1 / 3 log，从1nM到30µM。化合物c42被确定为一种先导候选分子，其功效大于或等于LSF，随后在β细胞系和原代小鼠胰岛中评估了促炎细胞因子诱导的β细胞功能障碍。测定雄性sd大鼠静脉滴注后的复方药动学半衰期。该分析是根据Frontage Laboratories, Inc.的合同进行的。Exton, PA。

细胞因子治疗和RT PCR

用物种特异性促炎细胞因子（PIC:5 ng/ml IL-1β、10 ng/ml TNF-α、100 ng/ml IFN-γ；研发系统）处理胰岛或细胞系持续4和24小时。在细胞因子产生前20分钟，以规定浓度添加化合物c42。如前所述，使用Taqman引物分离IL-12p40、IL-12p35、IFNγ、STAT4的RNA和定量RT-PCR[7,8]。

STAT4磷酸化

根据CelLytic™nuclear™Extraction kit (NXTRACT, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)提供的协议制备NK 92细胞核提取物。蛋白提取物在Mini-PROTEAN®TGX™预制凝胶(Bio-Rad, Hercules, CA)上分离，并转移到Immobilon-FL PVDF转移膜(EMD Millipore, Billerica, MA)。用一抗检测印迹，然后用IRDye®800CW和IRDye®680RD二抗(LI-COR, Lincoln, NE)用LI-COR Odyssey Imaging System (LI-COR)检测蛋白带。小鼠抗磷酸化stat4 (pY693)单克隆抗体(612739;BD转导实验室，CA)在1:50 00使用。兔抗肌动蛋白(I-19)多克隆抗体(sc-1616-R;Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)在1:3000使用。

葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)

细胞因子处理的细胞或原代小鼠胰岛监测GSIS如前所述[22]。简单地说，处理过的培养细胞或胰岛在含3mM葡萄糖的Krebs Ringer Buffer (KRB)中洗涤和稳定1小时，然后保留在3mM葡萄糖中或用18mm葡萄糖刺激。每种条件下取10个胰岛，每次实验3个重复。按照制造商的说明，用ELISA (Mercodia, Winston Salem, NC)测定60分钟后培养基中释放的胰岛素。

细胞凋亡检测

caspase-3切割:根据制造商的说明书，使用检测前caspase-3切割的试剂盒(556485,BD Pharmigen, Franklin Lakes, NJ)检测凋亡。每项实验的条件为3个重复。荧光测量使用激发波长380 nm和发射波长440 nm (SpectraMax Molecular Devices, Sunnyvale, CA)。

荧光显微镜检查与之前报道的[22]相同。所有孵育均至少进行3个重复。简单地说，刺激后，用冷PBS冲洗细胞因子处理的细胞/胰岛，在0.1 mM YO-PRO-1 (Y3603, Life Technologies)中4ºC孵育30分钟。每口井分析五个随机视野。图像通过3个通道采集，放大100X。荧光值(RFU)归一化到背景，并与细胞占用面积成比例表达(相位反差)。定量分析时，除了确定该区域内绿色通道(YO-PRO)的总密度值(荧光信号强度)外，还确定了细胞所占据的面积(从相位对比度图像通道获得)。对于每张图像，得到的密度值除以细胞面积得到的值，这个数值作为细胞凋亡的衡量。在每次实验中，只使用细胞因子处理的细胞的凋亡值作为参考值。测定细胞凋亡指数(样本归一化RFU/细胞因子处理归一化RFU x 1)。细胞因子刺激获得的背景归一化信号的相对荧光表达定义为统一(最大凋亡)。 Values from other treatment conditions are expressed relative to cytokine. An Axiophot (Zeiss, Jena, Germany) was used to capture images. Axiovision (Zeiss) was used for image analysis.

点头鼠标模型

在C57BL6/J小鼠中首次评价了复合耐受性和赋形剂选择。NOD/ShiLtJ (NOD)雌性小鼠购自杰克逊实验室(Bar Harbor, ME) 4周龄。小鼠被随机分配到治疗组，从6周龄到12周龄给药。每个队列包含20只小鼠，每天早上7点到11点在交替的下腹象限进行腹腔注射。载体为10:40:50 cremophor:PEG200:生理盐水。在10周时开始使用预校准的血糖仪进行每周两次的血糖监测。糖尿病定义为连续两次每日血糖读数≥250mg/dl。在研究终点采集包括胰腺在内的组织，进行固定和石蜡包埋。研究在第23周终止。

胰腺组织学

取7µm厚度的切片(50ºC过夜)，在乙醇浓度下降的情况下进行脱蜡和再水化处理。切片在柠檬酸缓冲液中进行热抗原提取(Vector Laboratories, Burlingame, CA)。切片与1:1000的豚鼠抗胰岛素多克隆(ab7842, Abcam, Cambridge, UK)在4ºC孵育过夜，然后在室温下与1:20 00的Cy5结合的山羊(ab102372, Abcam)孵育90分钟。用0.1µg/ml DAPI (D9542, 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚，Sigma, St Louis, MO)对细胞核进行计数10分钟。用载体实验室(Vectashield)安装切片。所有孵育均在含DAKO阻断液的PBS中，所有孵育之间的洗涤均在PBS中。

对于每个胰腺，每只小鼠分析三个切片。整个胰腺切片被观察，在10倍物镜下(Axiophot, Zeiss)用合成图像捕获。使用Axiovision软件(Zeiss)对图像进行分析。胰岛素炎区域定义为dapi显示的大于十个核的单个结构。胰岛炎的评估采用形态测定法(胰腺面积百分比;胰腺切片胰岛炎面积之和/总胰腺切片面积× 100)。

统计分析

在体外和体外实验至少进行三次。使用Student t检验或单因素方差分析（Prism 5.0；Graph Pad软件，加利福尼亚州拉霍拉市）确定统计显著性（95%可信区间和95%可信区间）p< 0.05)。

结果与讨论

β细胞系及其生物学特性的研究体外对原代胰岛的分析表明，促炎细胞因子对β细胞功能和胰岛存活具有破坏作用[23,24]。急性暴露于高度研究的TNFα、IL-1β、IFNγ三种细胞因子的混合物中，会导致葡萄糖敏感胰岛素分泌(β细胞功能的标志)丧失，氧化应激增强，基因诱导和凋亡升高[25-50]。这些观察证实了炎症和炎症介质对糖尿病病因学的重要贡献，并确定了需要新的策略来保护暴露于炎症环境的胰岛中的β细胞功能。

为了鉴定新的有效的小分子，可以分离促炎细胞因子对β细胞的破坏作用，我们研究了以前开发的lsf类似物分子库中的化合物。这个项目已经从这个集中的文库中鉴定出化合物c42作为一种生物活性分子，能够保护β细胞的保存功能和存活。

化合物c42的筛选与鉴定

1-(5R)-羟基己基芳基类似物的小聚焦文库已经生成，是lisofylline (LSF;(1) - 5 r-hydroxyhexyl 7-dimethylxanthine)[20]。LSF是一种STAT4磷酸化抑制剂，在几种炎症性疾病中显示出有益作用[51-53]。Lisofylline可防止NOD小鼠[14]自发性糖尿病的进展。对人类胰岛的研究体外， LSF[54]可逆转代谢活性和胰岛素分泌的中断。LSF的临床潜力一直受到其在人类[20]中不到一分钟的极短半衰期的限制。lsf类似物的重点文库的基本原理是探索之前研究过的黄嘌呤框架之外的化学结构-活性-关系，以确定是否可以识别具有不同结构支架的新的有效分子[20]。在INS-1大鼠β细胞系中初步评估化合物抑制促炎细胞因子(PIC)刺激产生的基因诱导的能力。随后，评估了有效化合物在暴露于促炎细胞因子的β细胞和胰岛中保存β细胞存活和功能的能力。本报告描述了化合物42 (c42)，一种对暴露于促炎细胞因子的β细胞具有保护作用的分子。重要的是，c42(图1)没有黄嘌呤核，这为化学开发提供了新的可能性，潜在地克服黄嘌呤基LSF的物理化学限制。

图1所示。化合物的选择。来自lisofylline样聚焦化合物库的分子被评估了通过促炎细胞因子诱导IL-12 (p40, p35)、INFγ和STAT4基因表达的能力，相关分子在功能检测中进展(流程图)。最初的化合物选择是基于LSF在促炎细胞因子破坏IL-12 / ifn - γ基因激活方面的更大或同等效力。随后评估候选化合物在保护β细胞系、小鼠胰岛和人胰岛免受促炎细胞因子诱导的凋亡方面的功效。化合物42 (c42)经鉴定为有效化合物。给出了c42和LSF的分子结构。

暴露于PICs的β细胞系中β细胞功能的保存

大鼠β细胞系INS-1的促炎细胞因子(PIC)暴露导致葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少，IL-12基因(p40和p35)表达升高并诱导细胞凋亡。IL-12/ ifn - γ刺激轴在胰岛中被诱导作为对促炎细胞因子刺激的反应，并与β细胞功能障碍有关[7,16]。PIC刺激INS-1细胞后，IL-12p40、IL-12p35、ifn - γ和STAT4基因表达显著高于对照和对照(分别为3.75±0.9、2.53±0.8、7.67±2.4和7.32±2.0倍)。在c42存在时，IL-12p40 (p<0.01)、IL-12p35 (p<0.01)、IFN(p<0.05)和STAT4 (p<0.05)的pic诱导的基因表达分别被抑制了66%±8、57%±10、52%±15和43%±4 (p<0.05)(图2A)。暴露于葡萄糖浓度升高的β细胞在培养中释放胰岛素。葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)与暴露在PICs中是分离的，PICs是细胞功能障碍的敏感标记。c42和PICs的加入保护了GSIS的反应，显示了β细胞功能的保存(图2B，p< 0.05)。β细胞和胰岛暴露于PICs也会增加细胞死亡。Caspase 3的激活或荧光染料YO-PRO-1的掺入是细胞凋亡的标志，在使用促炎细胞因子治疗后，β细胞中的Caspase 3水平升高。添加20µM c42可抑制PICs诱导的细胞凋亡(图2C-D，p< 0.01和p< 0.0001)。相对于20µM LSF, c42对β细胞的保护作用显示出来(图2B-D)。

图2。化合物c42可抑制大鼠胰腺INS-1细胞诱导的β细胞功能障碍。抑制pic诱导的基因诱导(一个)，保护pic诱导的GSIS解耦(B)或阻断PIC诱导的细胞凋亡(C， caspase3)和(D20µM c42或LSF (罪犯)或c42 (一个)在INS-1细胞中显示。PICs显示20µM c42(黑色条)缺失或存在(灰色条)的折叠表达。一个)．GSIS (B比较3mM葡萄糖(灰色条)和18mM葡萄糖(黑色条)诱导的胰岛素分泌。图(C, D)分别显示caspase活化RFU(相对荧光单位)和荧光凋亡指数(YO-PRO-1)。化合物c42本身无显著(NS)效应(B, C, D)．****， ***， **， *;p分别<0.0001、<0.001、<0.01、<0.05;####, ##, #;p<0.0001， <0.01， <0.05;每个实验中的数据来自三个重复的实验，所显示的结果是来自三个或更多独立实验的数据的组合。

化合物c42在保护β细胞功能和存活方面表现出与LSF相似的功效。化合物c42与LSF等效。LSF极短的药代动力学半衰期是其临床应用的主要限制。在Sprague-Dawley大鼠静脉给药后，c42的初步药动学分析确定其计算半衰期为45分钟。相反，据报道LSF的半衰期为7分钟[55]。进一步的药物化学提纯可以提高c42的半衰期。然而,在活的有机体内全身给药c42证实了疗效。

化合物驱动保护小鼠β细胞和原代胰岛免受pic诱导的凋亡

研究人员评估了c42保护小鼠β细胞系和原代分离的胰岛细胞免于因暴露于促炎细胞因子(TNFα， IL-1β， IFNγ)而诱导凋亡的能力。研究了小鼠β细胞系βTC3、原代分离小鼠胰岛和原代人类供体胰岛(图3)。通过两种定量方法测定细胞凋亡，即细胞荧光染料YO-PRO-1的掺入和Caspase-3底物的转化，如[22]所述。β细胞和胰岛暴露于PICs导致相对于载体控制的凋亡显著增加(p< 0.01)。在c42存在的情况下，可以在小鼠β细胞、小鼠胰岛和人类供体胰岛中看到显著抑制pic诱导的凋亡(图3A和3C，p< 0.001)。为了进一步证明c42能保护β细胞和胰岛免受pic诱导的凋亡，我们在小鼠细胞中检测了caspase-3的诱导作用。小鼠β细胞系和原代分离小鼠胰岛暴露于PICs后，caspase活性均显著增加(图3D和3E，p< 0.05)。c42的加入抑制了caspase活性的诱导(p< 0.01)。这些数据表明，c42使暴露于促炎细胞因子的β细胞和胰岛具有生存优势，并提高了保护β细胞免受炎症和炎症介质(糖尿病发展中存在的炎症介质)的功效。

图3。化合物c42可抑制胰岛β细胞和β细胞凋亡。细胞凋亡，由YO-PRO-1测定(得了)和caspase-3 (D、 E)，在TC-3 beta cells (,维)、初级小鼠胰岛(B, E)和人类主要供体胰岛(C)在不存在或存在50µM c42的情况下用PICs处理。图表显示荧光凋亡指数（YO-PRO-1）(一个- c)和caspase活化RFU(相对荧光单位，D、 E)．****, **, *;p<0.0001、<0.01、<0.05，分别为对照;####, ###, ##p<0.0001、<0.001、<0.01，分别给予PIC处理。每个实验中的数据来自三个重复的实验，所显示的结果是来自三个或更多独立实验的数据的组合。

c42对NOD小鼠1型糖尿病发展的破坏

为了证明糖尿病模型的概念有效性，我们使用非肥胖糖尿病(NOD)小鼠模型进行了评估。雌性NOD小鼠是一种近亲繁殖的品系，可自发发生胰岛炎症(胰岛素)、β细胞破坏和高血糖[56]。在NOD小鼠出现胰岛素之前给其注射c42提供了一个概念验证模型，以评估c42在该小鼠模型中延迟发病或降低1型糖尿病发病率的有效性。

对一系列赋形剂的评估确定，载具cremoophel:PEG 200:Saline(10:40:50)能有效溶解c42，小鼠每天重复腹腔注射该载具并无不良反应。在初步研究中评价c42在活的有机体内疗效，NOD小鼠从6周龄开始腹腔注射，连续注射6周。两组分别为单独注射和含28mg/Kg c42的注射组。每组有20只老鼠。从第10周开始，每周对小鼠进行两次血糖监测。高血糖(转化为糖尿病)定义为连续两次每日血糖读数在250 mg/dl或以上。这些数据与我们机构中未治疗NOD小鼠的糖尿病转换率进行了比较。NOD小鼠的糖尿病转化率，即使来自同一供应商的菌落，也因环境的不同而不同。重要的是要与既定的机构转化率/时间框架进行比较。用c42治疗的小鼠有糖尿病发病的延迟(c42给药15周)vs与溶媒对照组或非治疗组相比，服用c42的小鼠在第10/12周（溶媒对照组）和第23周转化为糖尿病的几率较低（图4A，31%vs分别为54或52%)。糖尿病转化的斜率有显著差异(p<0.001)，在c42组(图4B)中，c42处理、车辆对照和未处理的坡度分别为3.33±0.40、4.86±0.33和4.62±0.28。每组的代表性小鼠在12周时进行评估，其余小鼠进展到研究终点。胰腺恢复，并通过组织学分析胰岛炎症(胰岛周围存在炎症细胞)(图5)。与对照相比，c42处理的小鼠在12周时观察到显著的胰岛素抑制(p<0.0001年龄12周)。如图5B所示为具有代表性的胰岛图像。在12周龄时，小鼠已经在6周之前服用了化合物或对照剂。胰腺切片进行胰岛素联合染色以识别β细胞。在被炎症细胞包围的载体对照组中，胰岛主要表现为胰岛素阳性细胞减少(图5B a-c)。相比之下，c42处理小鼠的胰岛保存了胰岛素阳性细胞。(图5 b d-f)。这些在第12周的胰岛素和胰岛素的观察，虽然不是他们自己的结论，但确证了c42治疗组小鼠高血糖的抑制发展。研究终点NOD小鼠胰腺分析显示，c42处理组的胰岛素阳性细胞面积明显高于对照组(p < 0.05,图5 c)．

图4。化合物c42对NOD小鼠向糖尿病转化的抑制作用。NOD小鼠糖尿病(血糖≥250mg/dl)的发展一个对于两组：28mg/Kg化合物c42（c42，三角形），未经治疗的对照组（NT，圆圈）和单独使用载体（V，正方形）。箭头（双头）表示c42延迟糖尿病发作(p<0.01)，并在23周时降低c42转化为糖尿病(p< 0.001)。每组的线性回归线(B)显示c42治疗组相对于对照组的斜率存在显著差异（V、NT、颜色编码）(p< 0.01)。

图5。减少NOD小鼠用化合物c42治疗后的胰岛炎症。在12周时，对照组和c42组小鼠的胰腺胰岛素评分(一个，p< 0.0001)。有代表性的胰岛图像(B)和车辆处理(a-c)和化合物c42处理(d-f）12周龄的NOD小鼠。胰腺切片用DAPI（蓝色）标记细胞核，胰岛素（红色）标记β细胞。胰岛炎表现为胰岛周区密集的DAPI阳性细胞浸润。单色图像勾勒出胰岛（黄色虚线）和胰岛炎（橙色线）。溶媒对照组小鼠的胰岛主要被炎性浸润包围，胰岛素染色减少或可忽略（血管中自荧光的红细胞被视为小红点）。胰岛素染色保存在c42治疗小鼠的胰岛中。溶媒组和C42治疗组小鼠在研究终点的胰腺胰岛素阳性区域用图表（C）表示。*，****P<分别为0.05、0.0001。

总的来说，数据显示c42在NOD模型中对糖尿病转化有保护作用。胰腺炎症细胞的显著减少和表达胰岛素的β细胞的保存，进一步支持了c42的疗效。这些概念验证数据发展体外/体外c42治疗为暴露于炎性细胞因子的β细胞和胰岛提供的保护。c42对胰岛的保护作用令人鼓舞，特别是考虑到研究小鼠对该分子的接触有限。6周的工作日单剂量复方给药可能不是最佳方案。更持续的化合物暴露的后续调查是合理的。值得注意的是，给予c42 6周的小鼠没有出现不良事件。

c42的作用机制尚未完全确定，需要进一步研究。基于对IFNγ和IL-12基因表达的类似抑制，预测c42与母体化合物LSF具有类似的作用机制。然而，虽然c42明显干扰IL-12的激活，但仍有可能是抑制的靶点c42的抑制作用可能不同于LSF。在IL-12刺激下，人自然杀伤细胞系（NK92）细胞核中磷酸化STAT4的存在，而LSF对其有显著抑制作用，这一点未被c42修饰（补充图）。需要对c42的分子抑制谱和抑制机制进行进一步研究，以确保其在保护/保存β细胞方面具有明显的生物学功效。

总之，本研究发现了一种有前景的新分子，有助于开发新的糖尿病治疗方法，并促进其他有效化合物的发现，以减少促炎细胞因子对细胞功能/生存的负面影响。c42或未来类似c42的化合物的潜力在NOD小鼠模型中得到了证实。

致谢

该研究得到了美国国防部(PR093521)和联邦研究商业化基金(MF13-029-LS)对DATF的资助。丽贝卡·拉布(Rebekah Raab)和肯德尔·利昂(Kendall Leone)对小鼠研究的宝贵贡献得到了认可。安德鲁·皮尔森帮助准备数字。

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