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主编
山口正彦
埃默里大学医学院
文章类型
研究文章
出版的历史
收稿日期:2016年3月28日
录用日期:2016年4月5日
出版日期:2016年4月19日
版权
©2016黄敏这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可的条款下发布，该条款允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是要注明原作者和来源。
引用
黄敏，张轲，蔡欣(2016)氯胺酮增强前额叶皮层GluR1 Ser845磷酸化。Integr Mol Med 3: DOI: 10.15761/ im .1000214。
广州医科大学第二附属医院神经科学研究所，广州
广州医科大学第二附属医院神经科学研究所，广州
广州医科大学第二附属医院神经科学研究所，广州
内政部：10.15761/IMM.1000214。
氯胺酮快速抗抑郁作用的机制尚未完全确定。在本研究中，我们观察到单次亚麻醉剂量氯胺酮能显著缩短大鼠强迫游泳的静止时间。氯胺酮注射液显著增加了GluR1在前额叶皮层的表达和GluR1 Ser845磷酸化。侧脑室注射PKA抑制剂H89完全消除了用力游泳试验中氯胺酮的快速抗抑郁样反应。我们的结果表明PKA的激活和GluR1 Ser845的磷酸化是氯胺酮快速抗抑郁作用的关键。
氯胺酮，抗抑郁药，AMPA受体，GluR1，强迫游泳试验
重度抑郁症(MDD)是一种严重的公共健康问题，在美国终生患病率为17% [1］.尽管MDD的发病率和社会经济影响很高，但MDD的病因在很大程度上仍然未知。现有的治疗MDD的方法通常需要几周到几个月才能达到抗抑郁的效果，而且相当多的患者即使经过几个月的治疗也没有足够的改善。此外，在标准抗抑郁治疗的第一个月，自杀风险的增加是一个主要的公共健康问题。因此，迫切需要改进的治疗方法，在用药数小时或数天内发挥抗抑郁作用。
最近的临床试验表明，单次亚麻醉剂量(0.5-20 mg/kg)氯胺酮(一种非竞争性离子性谷氨酸NMDA受体拮抗剂)对MDD患者可产生快速的抗抑郁反应[2］.难以治疗的抑郁症患者报告称，单次静脉注射氯胺酮数小时内，重度抑郁症的核心症状得到缓解，效果持续长达2周[3.］.随后的研究报道了氯胺酮在减少难治性抑郁症患者自杀意念方面的显著疗效[4］.
氯胺酮的快速抗抑郁作用的发现令人兴奋。然而，氯胺酮的拟精神特性和滥用潜力，在推广这种化合物作为抑郁症的一般治疗时必须谨慎。了解氯胺酮与行为改善相关的潜在作用机制对开发新型、安全、快速的抗抑郁药物具有重要意义。
所有行为实验均选用雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠，体重200-350 g(购自广东省动物实验中心)。动物在温度和湿度控制的设施中进行12小时的光/暗循环，并自由获取食物和水。所有实验均符合美国国立卫生研究院的指导方针，并获得广州医科大学动物保护与使用委员会的批准。
在测试前阶段，将大鼠放入一个高65厘米、直径30厘米的有机玻璃圆柱体中，将其灌满45厘米高的水(22°C至24°C)，持续15分钟。受试者之间换水，大鼠游泳后用纸巾擦干。在注射氯胺酮或生理盐水不同时间后，24小时后进行测试。每个受试者的测试时间为15分钟，并由安装在圆柱体一侧的摄像机记录下来。然而，只有最后5分钟的测试会被一个不知道小组分配的观察者分析和评分。静止时间的减少提示抗抑郁药样反应。
这些方法在我们以前的出版物中有详细描述[5，6］.采用异氟醚镇静后断头处死大鼠。分离前额叶皮质，用冷冻ACSF切片(mM: 124 NaCl, 3 KCl, 1.25 NaH)，切成400 μm厚的薄片2人事军官41.5 MgCl2，2.5 CaCl226 NaHCO3.，和10葡萄糖，用95%O2/5%CO鼓泡2)使用徕卡VT 1200S振动刀（美国伊利诺伊州班诺克伯恩市徕卡微系统公司）。将切片在界面保持室中，在95%O2/5%CO饱和的湿空气中，在室温下保持1小时以上2．然后将切片转移到含有10ml ASCF的浸没型瓶中，并用95%的O2/5%的CO起泡2．
大鼠用异氟醚深度麻醉，头部安装在立体定向仪中。将双套管（26号；美国弗吉尼亚州罗阿诺克市塑料一号）双侧插入左右侧脑室（相对于bregma的坐标：−前/后0.9毫米（AP），±1.5毫米（ML），−距硬脑膜3.3毫米的背侧/腹侧（DV）。术后护理包括给予卡普洛芬（5 mg/kg）和外用三联抗生素3天。在7天的恢复期后，在注射氯胺酮（i.p.）前1小时，将50 nM H89（10µl ACSF）或等量的二甲基亚砜（10µl ACSF）以0.25µl/min的速率注入大鼠侧脑室，注射套管（26GA）伸出导向套管外0.5 mm。输液后，注射套管在引导套管内停留5分钟。
药物治疗后，使用含有50 mM Tris-Cl、150 mM NaCl和0.02%NaN的缓冲液溶解前额叶匀浆3.1% Nonidet P-40, 0.1% SDS, 0.5%去氧胆酸钠，5 μg/ml白细胞介素和1 μg/ml抑肽酶。蛋白通过SDS-PAGE分离并转移到硝化纤维素膜上。在含130mm NaCl, 2.5 mM KCl, 10mm Na的溶液中，在室温(22°C至24°C)下封闭膜1小时2HPO4， 1.5 mM KH2人事军官4， 0.1%吐温20和5% BSA (pH 7.4)。用抗ser845磷酸化的GluR1的一抗(1:1000;微孔AB5849)。在TBS-Tween中冲洗后，在室温下用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG (1:1000, Cell Signaling Technology #7074)孵育1小时。免疫印迹采用增强化学发光法(Amersham)。然后用抗GluR1的抗体(0.5 μg/ml;Thermo Scientific PA1-37776)或β-actin (1:2000;Cell Signaling Technology #4967)。磷酸化水平用磷酸化强度除以总蛋白强度的比值表示，并用ImageJ进行计算，用于统计分析。为了显示目的，使用Photoshop裁剪了墨迹，并全局调整了亮度和对比度。
数据以平均值±SE表示。两组间差异的显著性采用Student的无配对双尾t检验或单因素方差分析检验。p值小于0.05被认为具有统计学意义。
我们检测了氯胺酮的抗抑郁作用，并在Sprague–Dawley大鼠中检测了氯胺酮的急性效应，以在强迫游泳试验（一种抗抑郁剂（AD）预测任务）中获得显著的行为反应。与生理盐水注射组相比，氯胺酮注射1小时、3小时和6小时（10 mg/kg，i.p.）在强迫游泳试验期间，显著缩短了动物的静止时间（图1）。
图1所示。氯胺酮降低了强迫游泳试验的静止时间。与生理盐水组相比，注射氯胺酮（10mg/kg，i.p.）1h、3h和6h后，在不同时间注射氯胺酮后，Sprague-Dawley大鼠在强迫游泳试验中的不动时间显著缩短（生理盐水与氯胺酮（秒）：50.3±5.2（n=6只大鼠）vs。20.3±3.4 (n=7只大鼠);64.8±4.2(6只大鼠)vs。3 h时20.2±3.8 (n=7只大鼠)，72.7±4.5 (n=x只大鼠)vs。23.7±3.6 (n=7只大鼠))。**，与生理盐水组比较p<0.01。
以往的研究表明，AMPA受体的激活是氯胺酮类抗抑郁作用所必需的[7，8]然而，AMPA受体的磷酸化对受体的激活至关重要。在AMPA受体的多个磷酸化位点中，GluR1 Ser845位点的磷酸化对于AMPA受体从胞质溶胶转移到突触后膜非常重要。因此，我们研究了氯胺酮对GluR1 Ser845磷酸化的影响在前额叶皮层，一个与抑郁症病因密切相关的大脑区域。注射氯胺酮后，按照方法中所述制备前额叶皮层脑片。使用急性制备的前额叶皮层脑片，western blot实验检测到氯胺酮应用时间依赖性地增加GluR1 Ser845磷酸化和总GluR1表达（图2 A-C）。
图2。氯胺酮增加了GluR1 Ser845磷酸化和GluR1在前额皮质的表达．A.在急性制备的前额皮质切片上，代表性的western blot结果显示，1 h、3 h和6 h氯胺酮注射增强了GluR1 ser845磷酸化和GluR1表达。B、C，氯胺酮对GluR1 ser845磷酸化和GluR1表达影响的5个独立western blot实验数据总结。*， p<0.05， **， p<0.01，经单因素方差分析，n= 5只对照组动物及各时间点注射氯胺酮后。
GluR1 Ser845被PKA磷酸化。为了测试GluR1 Ser845磷酸化是否对氯胺酮的抗抑郁作用是必要的，在氯胺酮注射（i.p.）前1小时，侧脑室注射PKA抑制剂H89（50 nM，2µl ACSF）.H89单独给药增加了动物在强迫游泳试验中的不动时间。然而，H89完全阻断了氯胺酮诱导的不动时间减少（图3）。
图3。H89在强迫游泳试验中阻断氯胺酮类抗抑郁反应。侧脑室注射PKA抑制剂H89 (50 nM)可显著延长SD大鼠强迫游泳静止时间(vehicle (DMSO) +生理盐水组:35.4±3.1 s, n=7只;H89 +生理盐水组:54.6±3.1 s, n= 7只)。H89完全阻断氯胺酮诱导的动物静止性降低(vehicle +氯胺酮组::17.1±2.6 s, n=7只大鼠;H89 +氯胺酮组:35.4±3.7 s, n= 7只大鼠)，提示氯胺酮在强迫游泳实验中，PKA活化和GluR1 Ser845磷酸化是必要的。*， p<0.05， **， p<0.01;##，单因素方差分析p < 0.01，与对照剂+氯胺酮组比较。
以往的研究表明，AMPA受体激活和突触蛋白合成是氯胺酮诱导的抗抑郁类反应所必需的[7，8］.据推测，氯胺酮诱导的突触发生是由于抑制强直性gaba能中间神经元和激活电压门控钙通道[7，9］.然而，通过氨基丁酸氨基丁酸毒素阻断氨基丁酸能传递一个受体拮抗剂，不影响抑郁行为[8]，表明阻断GABA能传导诱导的主要神经元去抑制不足以产生氯胺酮的快速抗抑郁反应。孟氏et al。［10，11]证明氯胺酮使真核细胞延伸因子2（eEF2）激酶（也称为CaMKIII）失活，导致eEF2磷酸化减少和BDNF翻译的去抑制，以及AMPA受体的表面表达增加。然而，其他研究人员观察到，相对于CaMKII，CaMKIII对钙调素的亲和力大约高出两个数量级，并且对钙浓度降低5倍以上敏感。他们还证明，只有在突触传递被TTX阻断的情况下，NMDA拮抗剂才能抑制CaMKIII活性和eEF2磷酸化[12］.此外，最近的一项临床研究发现，使用氯胺酮治疗的抑郁症患者血浆中eEF2 (p-eEF2)的表达增加[13］.这些结果表明，抑制eEF2磷酸化可能不是氯胺酮诱导的BDNF释放和AMPA受体表达增加的上游信号在活的有机体内没有TTX的。
AMPA受体的磷酸化在兴奋性突触的突触可塑性表达中起着重要作用。在AMPA受体GluR1-GluR4亚基的c端结构域上至少发现了10个磷酸化位点[14 - 16］.在这些磷酸化位点中，GluR1 Ser845被PKA磷酸化[17日至19日]GluR1 Ser845的磷酸化增加了AMPA受体的开放通道概率，因此增强了AMPA受体的功能[19，20.］.此外，GluR1 Ser845磷酸化被认为对GluR1含亚基受体的快速突触插入非常重要[21］.我们的结果表明，氯胺酮强烈增强了GluR1 Ser845的磷酸化，提示氯胺酮可能通过对AMPA受体的磷酸化来增强其功能，这可能是氯胺酮快速抗抑郁作用的基础。确实，H89在强迫游泳实验中完全抑制了氯胺酮的抗抑郁样作用，表明PKA激活和GluR1 Ser845磷酸化是氯胺酮快速抗抑郁作用的必要条件。
作者声明没有相互竞争的利益
山口正彦
埃默里大学医学院
研究文章
收稿日期:2016年3月28日
录用日期:2016年4月5日
出版日期:2016年4月19日
©2016黄敏这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可的条款下发布，该条款允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是要注明原作者和来源。
黄敏，张轲，蔡欣(2016)氯胺酮增强前额叶皮层GluR1 Ser845磷酸化。Integr Mol Med 3: DOI: 10.15761/ im .1000214。
广州医科大学第二附属医院神经科学研究所，美国南伊利诺伊大学医学院生理学系。
本研究得到了广东省中国国家自然科学基金（81271488）、NIMH R01（NIHMH0868 28）、SIU医学院启动基金、中国中国科学技术计划（2014Y2-0096）的资助。中国广东高等教育人才培养基地（310109－012）、广州高校科研项目（12A00 2S）。
图1所示。氯胺酮降低了强迫游泳试验的静止时间。与生理盐水组相比，注射氯胺酮（10mg/kg，i.p.）1h、3h和6h后，在不同时间注射氯胺酮后，Sprague-Dawley大鼠在强迫游泳试验中的不动时间显著缩短（生理盐水与氯胺酮（秒）：50.3±5.2（n=6只大鼠）vs。20.3±3.4 (n=7只大鼠);64.8±4.2(6只大鼠)vs。3 h时20.2±3.8 (n=7只大鼠)，72.7±4.5 (n=x只大鼠)vs。23.7±3.6 (n=7只大鼠))。**，与生理盐水组比较p<0.01。
图2。氯胺酮增加了GluR1 Ser845磷酸化和GluR1在前额皮质的表达．A.在急性制备的前额皮质切片上，代表性的western blot结果显示，1 h、3 h和6 h氯胺酮注射增强了GluR1 ser845磷酸化和GluR1表达。B、C，氯胺酮对GluR1 ser845磷酸化和GluR1表达影响的5个独立western blot实验数据总结。*， p<0.05， **， p<0.01，经单因素方差分析，n= 5只对照组动物及各时间点注射氯胺酮后。
图3。H89在强迫游泳试验中阻断氯胺酮类抗抑郁反应。侧脑室注射PKA抑制剂H89 (50 nM)可显著延长SD大鼠强迫游泳静止时间(vehicle (DMSO) +生理盐水组:35.4±3.1 s, n=7只;H89 +生理盐水组:54.6±3.1 s, n= 7只)。H89完全阻断氯胺酮诱导的动物静止性降低(vehicle +氯胺酮组::17.1±2.6 s, n=7只大鼠;H89 +氯胺酮组:35.4±3.7 s, n= 7只大鼠)，提示氯胺酮在强迫游泳实验中，PKA活化和GluR1 Ser845磷酸化是必要的。*， p<0.05， **， p<0.01;##，单因素方差分析p < 0.01，与对照剂+氯胺酮组比较。
