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收稿日期:2017年11月9日
录用日期:2017年12月5日
发布日期:2017年12月8日
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©2017 Ahmed FE。这是一篇根据知识共享署名许可协议发布的开放获取文章,该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制,前提是要注明原作者和来源。
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Ahmed FE(2017)粪便或血液中早期结肠癌的mirna诊断筛查*。外科病例报告Rev 1: DOI: 10.15761/SCRR.1000103
生物技术研究所GEM Tox实验室,美国格林维尔南纪念大道2905号,北卡罗来纳州27834
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生物技术研究所GEM Tox实验室,美国格林维尔南纪念大道2905号,北卡罗来纳州27834
现地址:华中农业大学食品科学与技术学院国家蛋类加工研究与发展中心,湖北武汉
东卡罗莱纳大学联合健康科学学院生物统计学系,格林维尔,北卡罗来纳州27834,美国
DOI: 10.15761 / SCRR.1000103
至关重要的是,必须在恶性肿瘤的早期阶段进行结肠癌的诊断筛查,这是在没有恶性肿瘤症状的人群中寻找疾病的过程,以便减少这种可治愈的癌症的死亡率,如果它能够通过准确和具有成本效益的诊断措施在疾病的尽可能早的阶段发现的话。由于确定这种可治愈的恶性肿瘤的死亡率是可以通过早期有效的筛查范式来预防的。目前有几种CC筛查方法:已知免疫粪便潜血试验[FOBTi]缺乏敏感性,并且有严格的饮食要求,这降低了依从性。CC筛查的黄金标准是“结肠镜检查”,这是一种侵入性检查,而且费用昂贵,因此降低了依从性,在某些情况下可能导致死亡。因此,一种不需要饮食限制的无创敏感筛查是一种更方便的筛查策略,这是正确的设想。结肠镜筛查目前推荐用于结直肠癌[CRC]。虽然它是一种可靠的筛查方法,但它是一种侵入性的手术,通常伴有腹痛,有潜在的严重并发症,而且相对昂贵,这些因素都阻碍了它在全球的应用。
美国癌症协会;方差分析(ANOVA);APC,腺瘤性大肠息肉病基因;CA,癌胚抗原;CC,结肠癌;CP,比较交叉点;CRC,结直肠癌;dMMR,缺陷DNA错配修复;DNA甲基化酶;CRC,结直肠癌; DAVID, bioinformatics tool referring to Database for Annotation, Visualization and integrated discovery; E, efficiency of the polymerase chain reaction; EDTA, Ethylenediminetetraacetic acid; E-method, another name for the comparative cross point method for polymerase chain reaction quantification; FOBT, fecal occult blood test; GESS, gene expression statistical system; GMOs, genetically modified organisms; IBD, inflammatory bowel disease; IHC, immunohistological; LC, Light Cycler Instrument; LCM, laser capture microdissection; MIQUE, guidelines on reporting qPCR data known as minimum information for publication of quantitative real-time PCR expression; NCI-EORTC, National Cancer Institute and the European Organization for Research and Treatment of Cancer; NCSS, statistical software; NF1A, Nuclear factor 1A-type protein; pMMR, proficient in DNA mismatch repair; PRoBE, epidemiological experimental random design; QC, quality control; qPCR, quantitative polymerase chain reaction; 18s rRNA, ribosomal ribonucleic acid; RT, reverse transcription reaction; SYBR Green, an asymmetrical canine dye for nucleic acids staining; TNM staging, a cancer staging notation system; TPC, test performance characteristics; UC, ulcerative colitis; UTR, the 3’ untranslated region of target messenger RNA
因此,采用相对稳定且不可降解的微RNA分子进行筛选的方法将比转录组信使RNA、突变DNA、表观遗传学和/或基于蛋白质组学的检测更可靠,这种筛选方法是通过可用的商业试剂盒从非侵入性人体粪便或半侵入性血液样本中提取,然后进行操作。miRNA方法利用逆转录酶[RT],然后是改进的定量实时聚合酶链反应[qPCR]。为了补偿该检测未测量到的外泌体mirna,还需要对粪便或血浆的总rna进行平行检测,并对外泌体丢失进行校正,以获得准确的结果。最终,需要开发一种芯片来促进诊断,就像用于食品中转基因生物的量化一样。
与miRNA测试相比较的金标准应该是结肠镜检查。如果满足良好的实验室性能标准,那么基于诊断临床实验室目前采用的高通量自动化技术和定量表达测量的人类粪便或血液样本中的miRNA测试将最终推进到临床环境,对预防结肠癌产生全球显著影响。
生物信息学,诊断,组织病理学,微阵列,NGS, QC, RNA, RT-qPCR,统计学。
在我们和其他人看来,结肠癌[CC]不同于直肠癌[RC] [1]。我们在这篇综述文章中重点讨论了结肠癌筛查[2]。定期筛查可以在早期发现结肠癌,这是最有可能治愈的,因为如果观察到生长中的息肉,可以在它们有机会发展成全面的癌症之前将其切除。3.]。然而,应该强调的是,目前市场上使用的检测方法都不是最佳的,而且它们在某些人群中的检测率也都很低。
结肠癌筛查测试分为两类[4):一个)在活的有机体内检查息肉和癌症,并检查结肠的结构以发现任何异常。在摄入对比液后,在直肠内插入镜(软性乙状结肠镜、胶囊内窥镜、双重对比钡灌肠),或在其他使用特殊x射线成像技术的检查中进行x射线检查,如CT结肠镜检查(虚拟结肠镜检查)。虽然这些检查是侵入性的,但当观察到息肉时,它们可以切除息肉,因此在预防结肠癌方面有作用。在体外一般检查非侵入性排泄物[粪便]或半侵入性体液[血液]中的遗传物质[无论是DNA还是RNA]的测试,以便开发具有高灵敏度和特异性的测试,能够作为可接受的筛查这种可预防癌症的方法[例如,以愈创木和免疫为基础的FOBTs,以及粪便和血液中的分子DNA测试]。这些在体外与有创结肠镜检查相比,这些检查侵入性较小,也更容易进行,但许多检查对早期息肉的检测灵敏度较低,除非进一步发展和完善[1 - 15]。因此,在过去的20年里,人们花费了大量的精力和费用来开发可接受的非侵入性CC测试[为5 - 14)。当人们表现出结肠癌或其他消化系统疾病的症状时,可以使用这些检查来检查异常的进展。
在推荐的情况下,筛查通常从粪便隐血试验(FOBT)开始,这是粪便中肉眼看不到的微量血液[3日- 15日)。由于大息肉或癌症表面的血管脆弱,容易被粪便的通过破坏,从而释放少量血液进入粪便,因此许多crc会出血进入肠腔,而FOBT可以通过化学反应检测到粪便中不可见的血液的发生。该检查不能区分血液是来自结肠还是来自消化道的其他部位(如胃)。虽然息肉和癌症会导致便血,但已知的其他原因出血有:溃疡、痔疮、憩室病(在肠壁薄弱处形成的小袋)或IBDs(结肠炎)。11)。当血液通过肠道时,它会被降解,并且根据出血发生的部位,FOBT在粪便中检测到的血液可能会有所不同。因此,单独使用FOBT检测降低死亡率的能力有限,因为接受过FOBT的结肠癌患者中有67-85%死于该疾病,这表明它的发现不够早,无法最大程度地影响疾病的整体预后,因此FOBT不是一种可靠的筛查试验,因为它遗漏了腺瘤和许多早期癌症。此外,愈创木FOBT测试要求患者在测试前改变饮食,避免使用布洛芬[Advil],萘普生[Aleve]或阿司匹林[> 1片成人阿司匹林,325毫克/天]等非甾体抗炎药[NSAIDs],因为它们会导致出血,尽管泰诺®可根据需要服用,所有来源的维生素C每天超过250毫克,并在测试前食用红肉(牛肉、羊肉或肝脏)3天,因为肉类中的血液成分可能会产生假阳性结果[, 4 - 6, 15- 17]。该程序需要每年重复多次测试,可能会降低依从性[18)。此外,如果检查发现血液,需要进行结肠镜检查以寻找出血的来源[美国癌症协会,http://ww.cancer.org]。
与传统的愈创木相比,最近的一种测试是粪便免疫化学测试(FIT)或iFOBT,它对红细胞中发现的部分人类血红蛋白起反应。这种测试比愈创木FOBT更容易进行,因为它不需要药物或饮食限制,而且不太可能对上消化道部分出血(如胃)产生反应。4、16)。因为像愈创木创FOBT一样,FIT不会对不出血的肿瘤产生反应[17、18)在美国,需要多个粪便样本进行测试,如果结果呈阳性,则需要进行结肠镜检查。
与FOBTs相比,微创手术可以检测到肿瘤病变。由于> 60%的早期病变似乎发生在大肠的直肠乙状结肠区域,过去常规使用约60厘米长的刚性乙状结肠镜检查,只能看到一半的结肠[19)。然而,最近由结肠近端病变引起的病变数量有所增加[6,20-23],需要使用柔性光纤乙状结肠镜。虽然这些方法提供了一种切除肿瘤息肉的方法,但它们仍然留下了许多未被发现的病变,这些病变超出了范围[约25%和34%][19)。
双重对比钡灌肠[DCBE],也称为空气对比钡灌肠或空气对比钡灌肠,是一种x射线检查,使用白垩状液体[硫酸钡]和空气来勾画结肠和直肠内部的轮廓,以在x射线上寻找异常区域[1 - 5)。手术前一两天要进食透明的流质食物,手术前一晚要避免食用或饮用乳制品。测试大约需要45分钟才能完成,而且不需要镇静。结肠和直肠需要在检查前一晚通过服用泻药和/或在检查当天早晨使用灌肠来清洁。在测试部位,将一根小的柔性管插入直肠,将硫酸钡液体泵入其中以部分填充并打开结肠,然后通过同一根管将空气泵入结肠,这可能导致腹胀,痉挛和不适,此外还有排便的冲动。拍摄结肠内膜的x线照片。如果观察到息肉或其他可疑区域,还需要进行结肠镜检查。在手术后的几天里,钡可能会导致便秘,而且除了暴露在相对少量的辐射中之外,还有一个风险是,它会使结肠充气,可能会损伤或刺穿结肠。4)。
结肠镜检查基于与乙状结肠镜相同的原理,可以看到整个结肠。虽然这是美国7000万50岁以上人群CRC筛查的“金标准”,但它需要一个不愉快的肠道准备,测试不舒服,一些人在测试过程中可能会因为镇静而出现低血压或心律改变,尽管这些副作用通常不严重。如果在手术过程中切除息肉或进行活组织检查,手术后可以观察到血液,在极少数情况下,如果出血持续,可能需要治疗。23)。这项检查每年花费约100亿美元,超出了医生的能力,需要进行疏导准备,并对患者进行镇静或麻醉,而且由于胃肠道穿孔,它有更高的发病率或死亡率[6、23)。此外,研究发现,右侧结肠癌的结肠镜检查漏诊率范围为4.0%,6- 9mm的腺瘤性息肉为12-13%,直径≥1cm的息肉为0-6% [24)。显然,需要一种简单、廉价、无创、敏感和特异性的筛查试验来识别有发展为晚期腺瘤(例如,息肉1 cm伴高度不典型增生)或结直肠癌风险的人,这些人将从随后的结肠镜检查中受益。
虚拟结肠镜检查[CT结肠镜]是一种先进的结肠和直肠计算机断层扫描[CT或CAT]。它包括通过重建计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)来检查计算机生成的整个胃肠道的3D表现。该测试不需要镇静,但需要肠道准备,并在直肠中放置一根管子(如钡灌肠),使结肠充满空气,还需要在测试前饮用造影剂,以便标记结肠或直肠中残留的粪便。整个过程大约需要10分钟,对于那些不想进行更具侵入性的结肠镜检查的人来说,这尤其有用。这种方法根据病灶的部位而不是组织学来检测病变,因此无法区分良性腺瘤和浸润性癌。一项涉及6393例患者的33项研究的荟萃分析表明,该测试对息肉的敏感性较低[< 6mm的息肉为48%,6- 9mm的息肉为70%,> 9mm的息肉为85%]。此外,该测试价格昂贵,需要专家在场,这降低了患者的依从性[25)。CT仍然被认为是无症状、无风险个体的研究替代方案,它也使患者暴露于少量x射线照射下,并且它也错过了小病变的检测[26)。
为了找到更实用的早期无创结肠癌检测的生物标志物,研究人员已经开发了许多在体外诸如粪便DNA中基因和染色体位点的表观遗传甲基化标记变化等测试[27),大便启动子DNA甲基化[28],在肿瘤细胞中发现的突变DNA标记物随粪便排出[29 - 30日)或DNA复制试验所需的小染色体维持蛋白[mcm] [3],粪便或血液中基于蛋白质组学的方法[31日),以及基于转录组学mrna的粪便或血液检测方法[12),或基因和表观遗传测试的结合[32)。
分子研究表明存在K-突变拉从患者粪便中提取DNA对CC筛查敏感,但也有缺点,如其在大腺瘤和癌中的表达不足一半。此外,它在非肿瘤组织中的表达使其不是最佳的分子标记。此外,突变仅在肿瘤的一部分中发现,使得该测试对可靠的CC检测不太敏感[33)
大肠腺瘤性息肉病的突变[j]APC通过对APC基因模板进行PCR分析获得患者粪便中的导管DNA,并通过在体外PCR产物的转录和翻译已在疾病早期阶段得到证实。然而,数字蛋白截断试验并不是一种可靠的筛查工具,因为它缺乏特异性[即,28名对照中有5名FOBT阳性,另有6名显示直肠出血][34)。由于crc表现出遗传异质性,一种多靶点方法利用突变k -,APC和p53;微卫星不稳定标志Bat-26;“长”DNA代表从肿瘤脱落的癌细胞特征的非凋亡结肠炎细胞的DNA,而不是正常的凋亡结肠炎细胞的DNA,已经过临床试验[35)。然而,31例浸润性癌中仅有16例(51.6%)检测到DNA改变,71例浸润性癌合并高级别非典型增生腺瘤中有29例(40.8%)检测到DNA改变,418例晚期肿瘤(管状腺瘤直径≥1cm)、息肉伴高级别非典型增生或癌症患者中有76例(18.2%)检测到DNA改变。29)。此外,这些测试不具有成本效益,因为筛查多种突变通常非常繁琐和昂贵[36)。
初步研究表明,蛋白质组学策略可以区分正常状态和腺瘤。然而,这种方法尚未被评估为一种无创筛查工具,因此被认为是研究性的[37-38]。目前,晚期结直肠癌中最常升高的标志物是癌胚抗原[CEA] [39)碳水化合物抗原,也被称为癌症抗原[CA] 19-9 [40]但是在疾病的早期阶段,这两种标记都没有被发现是一种有用或可靠的结直肠癌诊断筛查。
如果能够获得准确、实用且具有成本效益的结直肠癌诊断生物标志物,将大大提高早期检测水平。然而,尽管有上述详细的进展,目前可用的检测方法既不能在所有病例中检测出结肠癌(即灵敏度低),也不是高度特异性的。此外,这些检测往往成本高昂,产生假阳性或假阴性结果,分子可能不稳定,容易破碎我n体外[mRNA分子]需要过度的护理和特殊的处理技术,有些方法会给患者带来不适/不便,或者在极少数情况下导致死亡[例如结肠镜检查][21);所有这些原因都使患者的热情和/或依从性降低。目前,男性和女性的CRC筛查参与率都不到30%,而乳腺癌和宫颈癌的筛查参与率分别为70%至80% [41)。因此,可以通过使用经过验证的分子实验室测试来促进参与,这种测试不那么不舒服、成本更低,并且提供更高的准确性[更高的灵敏度和特异性]。然而,需要更大规模的临床研究来证实最初的分子测试结果。
另一方面,我们的数据和其他数据[[1,13,14,42 -54]研究表明,粪便或血液中与结肠癌相关的少数miRNA基因表达的定量变化允许开发比目前市场上可用的更敏感和特异性的结直肠癌分子标志物。与常用的FOBT粪便测试相比,无创分子和可靠的测试尤其方便,因为不需要饮食限制,也不需要仔细收集样本,因此筛查测试可以被更广泛的人群接受。因此,使用稳定的分子,如从粪便或血液中提取并随后进行操作时不易降解的miRNA,结肠癌的miRNA方法比转录组学mRNA-,突变DNA-,表观遗传学-或基于蛋白质组学的测试更可取[11日,42-56]特别是我们和其他人已经证明,这些稳定的、不可降解的miRNA分子可以很容易地从粪便或循环中提取出来在体外使用市售工具包。的优点和缺点vivo和在体外测试在表1。
表1。癌前病变检查方法的比较__&恶性结肠癌筛查
测试规范 |
FBOT__, 愈创木脂® |
Immunolo● |
甲基化基因■& |
启动子♦甲基化 |
突变◘ |
结肠镜检查 检查▲ |
蛋白质组学 方法► |
信使核糖核酸▌方法 |
microrna的▼方法 |
总会在₦ 方法 |
非侵入性 |
是的 |
是的 |
是的 |
是的 |
是的 |
没有 |
是的 |
是的 |
是的 |
是的 |
灵敏度 |
10.8%__ |
16.3%__ |
7.5%■ |
31%__ |
18.2% |
87% |
75% |
> 80% |
> 90%¶, |
> 95% |
特异性 |
95% |
94.5% |
82% |
95% |
94.4 |
100% |
> 95% |
> 95% |
> 95%¶ |
>99% |
自动化 |
没有 |
没有 |
没有 |
没有 |
没有 |
没有 |
是的 |
是的 |
是的 |
是的 |
成本 |
15美元♪ |
$25♪ |
400美元♪ |
250美元♪ |
649美元♪ |
900美元♪ |
650美元♪ |
350美元♪ |
200 - 400美元♪ |
1000美元 |
__,§,●FOBT:目前广泛使用,因为它方便,不昂贵,但它的灵敏度低,需要多次采样,降低了依从性。
■甲基化基因:只适用于晚期癌症的检测,但是不腺瘤,基于vimentin基因,DY位点5p21和OC91199,因此不适合人群筛查。
♦启动子甲基化:仅基于一个基因,基本上是研究目的的专门程序,因此不适合人群筛查。
◘突变DNA标记:一种DNA测试,被称为Cologuard®由威斯康星州麦迪逊市的精确科学公司分发,包括KRAS突变的定性分析,缩写NDRG4和BMP3甲基化,Badm,加上血红蛋白测定,用于人类粪便中隐藏血红蛋白的存在;Colvera由新泽西州Bridgewater的临床基因组学病理学公司(Clinical Genomics Pathology, Inc .)上市,是一种通过与结直肠癌肿瘤生长相关的DNA中两个改变基因BCT1和IKZF1的存在来检测结直肠癌复发的定性检测。通过使用Clovera和CEA,可以在症状变得明显,导致转移之前识别CRC复发,通过将生物标志物DNA检测与FIT结合,可以显著提高对晚期腺瘤的敏感性;然而,它的特异性较低,因此需要更多的结肠镜检查,更繁琐,而且费用昂贵。
▲结肠镜检查:目前它被认为是检测结肠癌的金标准,尽管它是侵入性的,对某些人可能会导致一定的风险。
►蛋白质组学方法。蛋白质组的TM技术采用LC-MS/MS定量靶向蛋白质组学;然而,它需要专门的研究设备/试剂,因此被认为是研究性的。
▌mRNA途径:脆性信使RNA的靶标变化;因此,在粪便制备、RNA提取和储存方面需要特别小心。
▼miRNA方法:由于小miRNA分子的稳定性,它比mRNA方法更可取,并且在粪便或血液中有几种miRNA具有良好的群体筛选潜力。根据我们的数据,息肉直径≥1cm,呈绒毛状或管状,或存在高度不典型增生和癌。
₦NGS筛选:它有潜力,但在商业化之前需要进一步发展。
♪筛选测试的费用取决于测试的mirna数量;评估是基于引用,与测试开发人员的联系,以及我们在临床分析需求和开发方面的经验。
与其他结肠癌筛查媒介相比,粪便检测有几个优点,因为它确实是非侵入性的,不需要令人不快的疏导准备,不需要正式的医疗保健访问,也不需要离开工作或日常活动[3 - 6]。与乙状结肠镜检查不同的是,它反映的是结肠的全长,可以同时显示结肠的左侧和右侧。也有人认为,结肠细胞不断地大量释放到粪便流中[7、8),与血液中的情况相反——它间歇性地释放——如FOBT [9],转化后的结肠结肠比正常结肠结肠产生更多的RNA [10 - 14);因此,这种自然富集现象部分地避免了使用实验室技术富集致瘤性结肠炎细胞的需要。此外,由于可以对邮寄标本进行检测,因此在地理位置上进行粪便筛查是不受阻碍的[2、16、32)。美国癌症协会[http://ww.cancer.org]已经认识到,采用基于分子的粪便测试将增强CRC的诊断筛选。
应该强调的是,尽管并非所有粪便中的脱落细胞都来自肿瘤,但我们和其他人发表的数据[[1,13,14,44 -56]研究表明,诊断性miRNA基因表达谱与足够数量的脱落癌细胞和足够的转化RNA在粪便中释放有关,也与血液(细胞或细胞外)中可测量的循环miRNA基因的可用性有关,尽管存在细菌DNA、非转化RNA和其他干扰物质,但可通过PCR等敏感技术定量测定。这种量化是可行的,因为在这种方法中使用的PCR引物的高特异性,克服了所有这些障碍;因此,粪便中异常脱落的结肠细胞数量或血浆或血清中出现的总RNA数量变得无限[11 - 14号]。
使用粪便或血液中的miRNA的测试也可以产生强大的筛选,因为miRNA分子的持久性[[1,13,14]。此外,一种方法利用microrna的基因比基于脆弱的信使RNA的测试更全面,更包罗万象。12)例如,因为它是基于更高层次的控制机制。我们相信最终的粪便或血液无创测试将包括几种测试microrna的基因表达的增加和减少,最终将生产一种包含这些稳定分子组合的芯片,以简化测试,就像为测试食品中的转基因生物而开发的那样[57)。
血液是一种体液,可以通过实验室测试中常用的半侵入性方法(皮肤穿刺)获得,这使得它在常规基础上使用是合乎逻辑的,因此它对进行实验室测试的技术人员很有吸引力。然而,在血液中进行miRNA分析在纯化和分子表征方面存在各种挑战。例如,由于血液中存在高水平的核酸酶和其他抑制成分,裸miRNA分子会在静脉穿刺后几秒钟内降解,这些成分会干扰下游的酶促反应,例如常见的抗凝血剂肝素会与RNA共同扩增。此外,在血液中发现的高质量RNA制剂含有污染物,如果在RT制备中使用过多的样品,则会抑制RT- qpcr反应[58]。因此,建议使用EDTA或柠檬酸抗凝血代替肝素。然而,在一些研究中,由于循环mirna与特定蛋白质之间形成复合物,循环mirna表现出了稳定性[59 - 61),或者mirna被包含在保护性循环外泌体或大囊泡中[62]。在定量血液中的mirna时,血浆比血清更好,因为血浆的使用可以最大限度地减少由于缺乏凝血因子而引起的差异[63]。
对于成熟的mirna测试,目前有可用的商业制剂,可以节省时间,并提供制造商建立的验证和QC标准的优势。例如,Qiagen buffer [miScript HiSpec buffer]®], Qiagen, Inc, Frederick, MD, USA,该研究抑制了mirna大小的模板以外的模板上尾反转录[RT]反应的活性,提供了一种异常特异性的cDNA合成反应,消除了来自较长RNA物种的背景。然而,为了测量pre-miRNA,必须使用另一种缓冲液[miScript HiFlex buffer]®],因为非偏倚反应导致与总RNA制备序列交叉反应的背景信号增加,这可以通过在进行PCR分析时进行熔融曲线分析来区分[64]。
在不同细胞类型中表现出微小变化的小非编码rna(如snoRNAs和snrna)与小miRNAs一样被聚腺苷化并被逆转录[RT],因此可以作为样品装载变异性和实时RT- pcr效率的对照。然而,它们不适合在miRNA分析实验中进行数据归一化,因为它们在血清和血浆样本中没有很好地表达。因此,通过一个平板均值(即均值C)进行归一化T值],或者使用普遍表达的miRNA靶标[即,仅使用所有样品中表达的靶标来计算平均值],都需要适当地归一化扩增反应[65]。
然而,血液中mirna的提取方案可能具有挑战性。在设置提取步骤时,有两种选择:要么从细胞血液成分中提取miRNA分子,因为全血中充满了细胞,可以通过差速离心分离这些细胞,要么从含有循环miRNA的血浆中提取。然而,应该注意肝素,因为这种抗凝血剂已知是PCR反应中聚合酶的强抑制剂。有几种收集管含有柠檬酸盐作为抗凝剂,而不是肝素,因为Qiagen或Tempus生产的收集管可以用于全血收集。如果目的是从血浆中分离mirna, EDTA管可以用来收集分离的血液和血浆,然后在-80℃下储存oC直到准备好提取mirna,因为这些分子在标准化的实验室提取方法下非常稳定。可采用Life Technologies公司的改良Trizol法或Qiagen公司的miRNeasy试剂进行提取。在提取柱可以堵塞和RNA可能丢失和/或降解;因此,总RNA的完整性需要在标准琼脂糖或丙烯酰胺凝胶上进行检查,或者使用电泳仪,如安捷伦生物分析仪。为了验证RT-PCR方法是否有效,应该使用其他RNA来源,例如培养的细胞。然而,基于RT- qPCR的筛选,如基于杂交的分析,确实需要验证。Life Technologies基于Taqman和SYBR的探针(如由Exiqon, Woburn, MA制造的LNA Universal miRCURY RT microRNA PCR检测)对短mirna具有很高的特异性,并且两种方法都显示出相似的效率,无需设计和验证自制引物。然而,两种方法的MiRNA定量显示影响MiRNA测量的变异性差异,因此定量受到测定方法选择的影响。因此,在解释PCR结果分析时必须考虑用于定量的方法[66 - 69年)。
我们的研究团队[[1,13,14]其他的[[28, 42- 65, 70-85]认为microrna的方法在组织细胞系,粪便或等离子体,可以满足测试可接受性的标准实验室工作人员进行这些测试,因为它是一个非——或者最小的方法,方法报答最多1 g的凳子上,或< 2毫升的血液(其中60%是等离子体),不需要取样连续日期,可以在寒冷的包发送的邮件,能够区分正常人和结肠腺瘤/癌,对于检测晚期息肉具有很高的灵敏度和特异性,并且可以自动化,这使得它相对便宜,并且与突变DNA标记等测试相比,更适合于早期检测,特别是因为血浆中不存在存在于血清中的干扰凝血产物,mirna在粪便和血浆中是稳定的[11 - 14号],只需要500µl血浆和1克粪便,就可以使用市售试剂盒进行检测[13、14]。全球miRNA表征的强大方法如微阵列的可用性[86]和简单、普遍适用的定量miRNA表达的方法,如qPCR [87]以及用于数据分析和解释的统计/生物信息学方法[88 - 90],表明经常遇到瓶颈的验证管道[15在这个实验中会更有效。迫切需要在粪便和/或血液等非或微创介质中加速使用敏感和稳定的分子标记,如miRNA分子,以提高CRC的检测[qh]91],特别是在早期肿瘤淋巴结转移[TNM]疾病阶段[0-1][92年,93年在癌症还可以治愈的时候。
发现了小的非编码蛋白序列,17-27个核苷酸长的rna, miRNAs,它们通过不完全结合靶mRNA的3 '非翻译区(UTR)来调节约30%的哺乳动物基因的细胞过程,从而通过转录抑制或诱导mRNA降解来防止蛋白质积累。94 - 95],为许多癌症的非侵入性早期诊断提供了新的机会[53 66 70-81]。最新的miRBase发布[v20, 2013年6月][http://ww.mirbase.org]包含来自206个物种的24,521个21,264个miRNA位点,产生30,424个成熟miRNA产物[96]。每个miRNA通常靶向数百个保守的mrna和数百个非保守的靶标,这些靶标在一个复杂的调控网络中运作,据预测,miRNA共同调控数千个人类基因[49、54、56]。miRNA被转录为长一级前体分子[pri-miRNA],随后被核酶Drosha和其他药物加工成前体中间miRNA [pre-miRNA],后者又在细胞质中被Dicer蛋白加工,生成成熟的单链miRNA [ss]。97]。MiRNA功能已被证明可以调节发育[98]和细胞凋亡[99],而特异性mirna在肿瘤发生中起着至关重要的作用[51],有效地对固体进行分类[70 - 76]及液体肿瘤[42岁,77 - 81],并作为致癌基因或抑制基因[One hundred.]。MiRNA基因通常位于脆弱位点,以及杂合性缺失的最小区域,或常见断点区域的扩增,表明它们参与致癌[101]。mirna有望作为癌症诊断、预后和/或治疗反应的生物标志物[50,52,102]。miRNA的表达谱在正常组织和肿瘤类型之间存在差异,有证据表明,miRNA的表达谱比编码蛋白质的mRNA基因的表达谱更准确地将相似的肿瘤类型聚集在一起[10,12,14,103]。
微阵列技术和RT-qPCR技术在细胞培养系、结直肠癌组织、粪便和血液中发现了一些与结肠癌肿瘤发生有关的mirna [1、13、42、45-48、52、55、56、67、76、94]及溃疡性结肠炎[11]。一项研究表明,结合mRNA和miRNA表达特征为改善CRC的生物分子分类提供了更广泛的途径[103]。另一项使用微阵列和qPCR的研究原位杂交试验评估炎症性肠病[IBD]中的差异表达,发现炎症组织和HT-29结肠腺癌细胞中有11个miRNA表达异常[3个显着降低,8个显着升高][84]。我们的工作支持这样一种观点,即粪便和血浆中与结肠癌进展相关的一些无细胞循环成熟miRNA分子表达的定量变化将提供比目前市场上可用的那些测试更敏感和特异性的生物标志物方法[1,13,20,91]。
由于本综述中提出的基于微阵列和qpcr的方法在粪便结肠细胞或血浆中鉴定出结肠癌特异性miRNA,因此在相关途径中验证新的miRNA/mRNA靶对可能导致发现由差异表达的miRNA共同靶向的细胞功能[103]。例如,结肠癌影响的前12条途径与CRC中过表达的mirna靶向的全球途径的比较表明,共表达的mirna通过靶向癌症中受影响的广泛信号通路,共同为癌细胞的异常表型变化提供了系统性代偿反应[88]。
几种算法,如:TargetScan [http://www.targetscan.org], DIANA-micro [http://www.diana.pcbi.upenn/edu米兰达[1]http://www.microrna.org], PicTar [http://pictar.bio.nyu.edu], embl [http://russell.embl-heidelberg.dr];;]http://www.mirz.unibas.ch]、mirWIP [http://146.189.76.171/guery]及PITA Top [http://genic.weizmann.ac.il/ pubs/mir07/mir07 _data.html[1]已被用于将成熟mirna的互补2-8核苷酸种子序列与3 ' UTR末端的靶mRNA序列相关联,以便在非常复杂的调控系统中识别关键的控制元件[85 87 - 90可能导致结直肠癌功能失调[104 - 107]。这些程序对miRNA和目标mRNA基因碱基配对的要求不同,并且在应用跨物种保护时实施相似但不相同的标准。因此,这些不同的程序必然会为可能所有的mirna产生不同的靶基因集[91]。
一项研究检测了315例正常结肠粘膜、管状绒毛腺瘤、DNA错配修复熟练的腺癌[pMMR]和DNA错配修复缺陷的腺癌[dMMR]中735种miRNAs的全球表达,代表了散发和遗传性CRC I-IV期[108]。结果显示:a] 6个在正常和息肉中差异表达的mirna [miR-, miR-9, miR-3, miR-99a, miR-135b和miR-137]在正常中也有相似幅度的差异表达与在pMMR和dMMR肿瘤中,b]除一个miRNA [miR-99a]外,其余miRNA在正常情况下均表现出类似的表达差异与这表明从正常结肠癌到癌症的逐步进展,并且早期肿瘤变化在pMMR和dmmr衍生的癌症中都很重要,[c]这些mirna中有几个与结肠癌的途径相关,包括APC / WNT信令和cMYC,和d]四个miRNAs [miR-3, miR-224, miR-552和miR-592]在pMMR和dMMR肿瘤中表达差异显著[≥2倍变化]。上述数据表明,尽管pMMR和dMMR肿瘤之间存在许多分子差异,包括miRNA水平的差异,但它们之间存在共同的生物学途径[108]。
与筛选大量mRNA基因不同,少量mirna用于区分癌症和正常,并且与mRNA不同,粪便和血液中的mirna在检测时基本保持完整和稳定[11 -14, 91]。因此,mirna是开发可靠的无创结肠癌诊断筛查的更好分子,因为我们发现:a]存在大肠杆菌这并不妨碍qPCR等敏感技术对miRNA的检测,因为所选用的引物是用来扩增人类而非细菌miRNA基因的,而且b]在原发肿瘤或病变组织(如粪便和血液样本)中,miRNA的表达模式是相同的。比较miRNA测试的金标准应该是结肠镜检查,这是从患者的医疗记录中获得的,以及目前用于年度检查的更便宜的免疫组织学[IHC] FOBT筛查,用于与miRNA结果进行比较[18]。虽然外泌体RNA会被遗漏[109]当从血液或粪便中限制性提取总RNA时,也可对从非侵入性粪便或半侵入性血液样本中获得的少量总RNA进行平行测试,然后在测试完成后对外泌体损失进行适当修正。提出了一种miRNA定量工作流程图1所示。比较使用或考虑的测试为CC筛查提出了表1。
图1所示。miRNA分子定量的实验工作流程。
我们已经证明,我们已经能够常规和系统地从少量激光捕获的组织微解剖(LCM)细胞中提取含有mirna的高质量总RNA [110],从人粪便中分离的结肠细胞[1,13,91]或循环血液[14]使用市售试剂盒[RNeasy隔离试剂盒]®],然后是Qiagen公司的另一套试剂盒“The”Sensiscript RT kit。
1977年Sanger的链终止法,俗称Sanger的二脱氧测序法[111已经部分被其他更具成本效益的下一代测序技术所取代,这些技术提供了更高的通量,但以牺牲读取长度为代价。Sanger方法是基于DNA聚合酶依赖的互补DNA链的合成,在2'-脱氧核苷酸[dNTPs]和2',3'-二脱氧核苷酸[ddNTPs]存在的情况下,当ddNTPs被添加到生长的寡核苷酸链中时,作为不可逆的合成终止物,导致不同长度的截断产物,随后可以在聚丙烯酰胺凝胶电泳上按大小分离。荧光检测技术的进步使得使用不同颜色的荧光染料将四种终止体组合成一个反应成为可能,每种染料代表四种ddNTP。此外,原有的平板凝胶电泳被毛细管凝胶电泳所取代,分离效果更好。此外,毛细管电泳被毛细管阵列所取代,允许许多在活的有机体内将扩增的片段样本克隆到细菌宿主中进行平行分析。此外,线性聚丙烯酰胺和聚二甲基丙烯酰胺的发展允许在多次电泳运行中重复使用毛细管,从而提高测序效率。这些和其他测序技术的进步使得现代桑格测序仪具有相对较低的错误率、较长的读取长度和较强的稳健性。例如,应用生物系统公司(Applied Biosystems)的高通量自动化Sanger测序仪[ABI 37730xl]具有96毛细管阵列格式,每次读取产生≥900 PHRED 20 bp[测序产生的核碱基鉴定质量的衡量指标],运行3小时可达96 kb [112]。
454Roche仪器是第一代发布到市场上的测序仪,通过使用绕过了冗长,劳动密集型和易出错的技术在体外DNA扩增称为乳状聚合酶链式反应(emulsion PCR),其中携带链霉亲和素片段的单个DNA片段通过剪切DNA并使用适配器将片段连接到珠上获得,这些珠被捕获到单独的乳状液滴中,作为单个扩增反应器,产生~ 107每颗珠有一个独特DNA模板的克隆拷贝。然后将每个含模板的头转移到皮效板的孔中,这允许数十万个克隆相关的焦磷酸测序反应模板并行进行,从而增加测序输出[114]。DNA模板的序列由焦磷酸图确定,由于信号强度与焦磷酸释放量成正比,因此与化学发光结合核苷酸的正确顺序相对应。焦磷酸测序方法容易由于不正确地估计同聚序列延伸[或索引]的长度而导致错误。罗氏454平台被认为是应用最广泛的下一代测序技术,能够在4小时内产生80-120 Mb的序列,读取200-300 bp[112]。
Illumina/Solexa方法通过将ssDNA片段连接到固体表面(称为单分子阵列或自由细胞)来实现无克隆DNA扩增,并对单分子DNA模板进行固相桥式扩增,其中单个DNA分子的一端通过适配器连接到固体表面;分子随后弯曲并杂交成互补适配器,形成一个桥,作为互补链合成的模板。扩增后,产生一个包含超过4000万个簇的流式细胞,每个簇由单个模板分子的~ 1000个克隆拷贝组成。模板使用DNA合成测序方法进行大量平行测序,该方法采用具有可移动荧光片段的可逆终止子和能够将这些终止子整合到生长的寡核苷酸链中的DNA聚合酶。末端用四种不同颜色的荧光标记,以区分给定序列位置的不同碱基,并通过读取每个连续核苷酸添加步骤的颜色来推断每个簇的模板序列。虽然Illumina技术似乎比焦磷酸测序更有效地测序均聚物延伸,但它产生的序列芦苇更短,因此不能解决短序列重复。此外,由于使用了修饰的DNA聚合酶和可逆终止子,在该平台中发现了取代错误。1G Illumina基因组分析仪在2-3天内每次运行产生35 bp的读数[115]。
应用生物系统公司(Applied Biosystem)的寡核苷酸连接和检测系统SOLiD支持的杂交-连接大规模平行测序[MPS]是基于多核苷酸测序技术[116]。文库从乳液PCR单分子扩增步骤开始,然后将产物转移到玻璃表面,在玻璃表面上通过连续的杂交和用四种不同的荧光染料标记的16种二核苷酸组合的连接进行测序。每个位置被探测两次,核苷酸的身份是通过分析两个连续的结扎反应产生的颜色来确定的。双碱基编码方案允许区分测序错误和多态性(错误只在一个反应中检测到,而多态性在两个反应中都可以检测到)。1-3Gb SoLiD每8天运行产生35 bp读取[114]。表2说明了可用的DNA测序技术。
表2。NGS和qPCR miRNA分析的QC和处理平台的比较
总会在 |
qPCR |
一般 提供了一种无假设的方法。 能够检测异构体和新的mirna 与qPCR相比,灵敏度较低 需要比qPCR更高的样本量。 |
设计用于检测预先选择的mirna。 针对特定的miRNA序列设计 (通常列在miRBase中)。 与NGS相比,灵敏度更高。 比NGS需要更少的样本。 |
优化了NGS和qPCR的miRNA分析方法 RNA尖刺蛋白是在RNA过程中添加的 隔离步骤,以监控再现性 和反应分离的线性关系 |
RNA溢出也包括用于RNA QC qPCR分离反应。 |
基于qpcr的QC监测RNA分离 效率、抑制和异常值检测。 |
基于qpcr的QC监测RNA分离 效率、抑制和异常值检测。 |
溶血指标,峰值控制& |
溶血指标,峰值控制& 内源性miRNA控制。对于RNA QC。 |
文库编写利用方法优化d 对于起始物料的低粘度,尺寸的选择 最大限度地提高miRNA的读取量,并通过 生物分析仪和qPCR。 |
选择合适的RT方法和 qPCR化验。 |
使用测序平台。 |
使用合适的qPCR仪器。 |
NGS和qPCR分析管道 原始测序数据(FASTQ文件)数据QC和过滤 基础和读取质量。数据质量评估。适配器修剪。 |
qPCR原始数据(Cq值)数据QC T米并进行熔化曲线分析。 聚合酶链反应效率。 与阴性对照比较。 RNA刺入和板间校准器。 |
映射和计数 miRBase 20 参考基因组 其他参考来源(如Rfam, Small RNA) 丰富的序列(映射)。 |
过滤 标记并删除无法满足要求的应用程序 |
装配和新数据 预测新型mirna(如miRPara) 异构体的鉴定。 |
PCR效率无抑制(s)。 |
应用阈值 TPM阈值。 在一组x%的样本中检测到。 |
应用阈值 Cq值阈值。 在一组x%的样本中检测到。 |
归一化 M值的修剪平均值(EdgeR)包 |
归一化 所有mirna的全球平均表达量 过滤后在所有样品中表达 (n= 127次试验)。 |
差异表达分析 负二项精确检验(EdgeR包) |
差异表达分析 参数或非参数统计 (例如,t检验、方差分析、Wilcoxon检验等)。 |
微阵列技术
对于微阵列研究,我们使用Affymetrix基因芯片微3.0阵列[Affymetrix, Inc, Santa Clara, CA, USA],它提供100%的miRBase v17覆盖率[http://ww.mirbase.org[]用一种颜色的方法。该芯片包含代表发夹前体的16,772个条目,表达153个物种的19,724个成熟miRNA产物,提供>3 log动态范围,在1.0 amol下,总RNA输入为100 ng,具有95%的重现性和85%的转录本检测。
全球微阵列表达研究表明,粪便、血浆和组织之间的表达相似[117]。对来自15个个体的粪便样本进行微阵列研究[3个对照组,3个TNM期0、2、3和4期结肠癌患者]显示,202个优先表达的miRNA基因表达增加[141个miRNA],或减少[61个miRNA]。13]。
低剂量微阵列数据与对照组的散点图见图2显示了健康正常对照组和四个TNM结肠癌组[0期至IV期]中miRNA-193a-3p与内部标准18S rRNA的多组比较图。
图2。miRNA-199a-3p与归一化标准的多组比较图18岁在健康对照组和四个被研究的结肠癌组中,TNM阶段0到4。
为了能够使用拟议的PCR技术以序列特异性的方式筛选几种miRNA基因,其中cDNA制备可以检测特定的miRNA,我们在工作中采用了[1,13,14,91一种序列特异性的茎环RT引物,设计用于退火到成熟miRNA的3 '端,与传统的线性引物相比,具有更好的特异性和敏感性[118]。这一步之后是SYBR Green®我们的实验室使用标准的TaqMan,使用miRNA 5 '端特异性的正引物、茎环RT引物序列特异性的通用反向引物和5 ' -核酸酶水解探针-TaqManminor grove binding [MGB]探针,匹配miRNA序列和部分RT引物序列应用生物系统公司在罗氏LightCycler上的PCR试剂盒[LC]480仪器,采用e -法[119]计算miRNA基因在修饰RT-qPCR研究中的相对表达量。需要强调的是,罗氏LC-480 PCR仪[120]采用非用户影响的方法进行高通量测量,使用二阶导数计算和双重校正[121]。一种校正利用实验中某一管家基因的表达水平作为内部标准,从而减少了由于样品制备和处理而导致的误差;第二种校正使用同一管家基因的参考表达水平来分析结肠炎细胞或血浆中的表达,从而避免了由于每个样品中管家基因的可变性而导致的结果变化,特别是在采用不同处理的实验中[122]。
我们还进行了茎环RT-TaqMan®次要凹槽结合(MGB)探针,随后对粪便中选择的20个成熟mirna进行了改良的qPCR表达试验[13]和血液中15种成熟mirna [14,包括扩增感兴趣的基因[目标]和第二个控制序列[参考],也称为外部标准,在同一毛细管中以与目标基因相同的效果扩增,这一过程被称为“多重PCR”。通过比较产物的强度对目标物进行定量。一个合适的内参基因是不含管家假基因的18岁核糖体[r]由于假基因的缺失和表达的微弱变异而被用作标准化标准的RNA基因[123]。这种选择避免了使用归一化策略的需要,例如板均值[a均值C]T板上所有miRNA靶标的值],一组不变miRNA [44],或共同表达的miRNA靶点[64]。一款查找规范化器的软件,如NormFinder [www.mld.dk publicationnormfinder.htm],它在微软Excel中作为模板运行®也可以用。为了更有针对性地对选定数量的miRNA基因进行PCR,我们使用了miRNA茎环RT引物[118]用于特定的待测miRNA物种,以复制ss-DNA [1、13、14]进行实时PCR表达测定。
我们的RT-MGB PCR结果从60健康对照和不同阶段的结肠癌患者的粪便表表3用散点图表示图4。火山地块图3在组内显示最小的差异。此外,中提供的数据表4对于粪便样本也表现出最小的组内差异,导致低p-使用2计算的值(dcp)[0.015275或0.025166的SD是最小的,或者三个重复的原始CT值仅为~ 0.03]。第4组的95% CT介于134.39和135.63之间,表明组间有轻微差异。然而,由于原始CT的变化很低,即使是最轻微的变化也会导致显著的变化p值;例如,miR-193a-5p在不同组中的诱导量为2 ~ 134倍。粪便数据显示,12种mirna [miR-7、miR-17、miR-20a、miR-2、miR-92a、miR-96、miR-106a、miR-134、miR-183、miR-196a、miR-199a-3p和miR214]在结肠癌患者的粪便中表达增加,并且TNM晚期的表达高于腺瘤。另一方面,结肠癌患者粪便中8种mirna [miR-9、miR-29b、miR-127-5p、miR-138、miR-143、miR-146a、miR-222和miR-938]的表达降低,且在TNM早期至晚期[I期至IV期]更加明显[13]。通过茎环定量成熟miRNA的火山图,TaqMan®MGB探针qPCR miRNA表达分析人类粪便TNM组I使用Qiagen公司程序结肠癌TNM 0-I期图4。
表3:干环RT,塔克曼OMGB检测正常人及结肠癌患者粪便中qPCR miRNA的表达
凳子 样本 |
18岁 核糖体rna stnd |
米尔 199年a-3p CP |
米尔 196年,一个 CP一个 |
米尔 183 CP一个 |
米尔 96 CP一个 |
米尔 7 CP一个 |
米尔 214 CP一个 |
米尔 21 CP一个 |
米尔 20 CP一个 |
米尔 92年,一个 CP一个 |
米尔 134 - CP一个 |
米尔 17 CP一个 |
米尔 106年,一个 CP一个 |
米尔 143 CP一个 |
米尔 146年,一个 CP一个 |
米尔 9 CP一个 |
米尔 222 CP一个 |
米尔 138 CP一个 |
米尔 127 - 5 - p CP一个 |
米尔 29个b CP一个 |
米尔 938 CP一个 |
||
负的Ctb |
25.87 |
25.68 |
26.26 |
26.04 |
26.04 |
26.14 |
25.88 |
26.44 |
25.90 |
25.78 |
26.04 |
25.82 |
26.12 |
25.66 |
26.08 |
25.92 |
26.42 |
25.98 |
26.10 |
25.78 |
26.04 |
||
N 1 |
25.98 |
26.04 |
25.56 |
26.91 |
26.06 |
26.27 |
26.32 |
25.66 |
26.52 |
26.14 |
25.90 |
26.15 |
25.77 |
25.68 |
25.65 |
25.80 |
25.78 |
26.02 |
25.98 |
26.06 |
25.36 |
||
N 2 |
26.34 |
25.90 |
25.46 |
25.74 |
25.82 |
25.64 |
26.46 |
26.10 |
26.32 |
25.92 |
25.68 |
26.16 |
25.98 |
26.64 |
25.88 |
26.12 |
25.68 |
25.98 |
25.78 |
26.04 |
25.66 |
||
N 3 |
26.46 |
26.04 |
25.84 |
26.22 |
26.34 |
26.18 |
26.44 |
26.52 |
26.22 |
26.16 |
25.98 |
25.88 |
26.10 |
26.14 |
25.88 |
25.98 |
26.12 |
26.06 |
26.08 |
25.68 |
26.04 |
||
N 4 |
25.88 |
25.64 |
25.68 |
25.11 |
25.96 |
25.98 |
25.62 |
25.84 |
25.92 |
25.96 |
26.08 |
26.16 |
25.96 |
26.02 |
26.16 |
25.80 |
25.86 |
25.96 |
25.78 |
25.56 |
25.86 |
||
N 5 |
26.78 |
25.69 |
26.24 |
25.78 |
25.94 |
25.86 |
25.48 |
25.86 |
25.94 |
26.22 |
25.88 |
25.92 |
26.12 |
25.98 |
26.12 |
25.88 |
26.16 |
25.78 |
26.12 |
25 - 98 |
26.04 |
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N 6 |
25.68 |
25.88 |
25.98 |
26.02 |
26.18 |
26.10 |
25.88 |
25.78 |
25.86 |
26.78 |
26.04 |
26.08 |
25.68 |
26.06 |
25.98 |
26.02 |
25.88 |
26.16 |
25.86 |
26.12 |
25.68 |
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N 7 |
25.66 |
26.02 |
26.10 |
25.98 |
25.84 |
25.88 |
26.14 |
25.68 |
26.06 |
25.68 |
25.98 |
25.78 |
26.10 |
25.66 |
26.08 |
25.76 |
26.06 |
25.68 |
25.98 |
25.86 |
25.76 |
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N 8 |
26.04 |
25.78 |
25.88 |
25.76 |
26.08 |
26.18 |
25.68 |
26.14 |
25.84 |
26.06 |
26.12 |
25.94 |
25.68 |
26.10 |
25.84 |
26.02 |
25.78 |
26.08 |
25.76 |
26.06 |
26.14 |
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N 9 |
25.68 |
26.04 |
26.08 |
25.88 |
25.92 |
25.86 |
26.06 |
25.76 |
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25.66 |
25.82 |
26.06 |
26.02 |
25.82 |
26.08 |
25.78 |
26.14 |
25.86 |
26.02 |
25.98 |
25.80 |
||
10 |
26.12 |
25.80 |
25.92 |
26.06 |
25.74 |
26.08 |
25.90 |
25.84 |
25.94 |
26.08 |
26.04 |
25.90 |
25.80 |
26.06 |
25.72 |
26.06 |
25.96 |
25.88 |
25.90 |
26.12 |
26.06 |
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11 |
25.78 |
26.10 |
26.04 |
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12 |
26.02 |
25.96 |
25.78 |
26.08 |
25.96 |
26.12 |
25.78 |
25.88 |
26.06 |
26.08 |
26.12 |
25.76 |
25.96 |
26.08 |
25.90 |
26.08 |
25.76 |
25.88 |
25.96 |
26.04 |
26.12 |
||
13 |
25.68 |
26.02 |
26.10 |
25.82 |
26.06 |
25.76 |
26.10 |
26.06 |
25.90 |
25.76 |
25.96 |
26.06 |
26.10 |
25.84 |
26.16 |
25.76 |
26.14 |
26.08 |
26.08 |
25.96 |
25.88 |
||
14 |
26.02 |
25.96 |
25.76 |
26.00 |
25.96 |
26.08 |
25.80 |
25.96 |
26.06 |
25.80 |
26.08 |
25.76 |
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25.88 |
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25.92 |
25.88 |
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26.06 |
26.16 |
||
15 |
25.86 |
26.08 |
26.14 |
25.98 |
26.02 |
25.80 |
26.12 |
25.98 |
25.86 |
26.02 |
25.90 |
26.08 |
26.12 |
25.88 |
26.04 |
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26.06 |
26.10 |
25.86 |
25.90 |
25.84 |
||
16 |
26.00 |
25.92 |
25.86 |
26.08 |
25.96 |
26.08 |
25.90 |
26.16 |
26.08 |
25.78 |
26.06 |
25.78 |
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26.06 |
25.96 |
25.80 |
26.02 |
26.12 |
26.02 |
||
17 |
25.70 |
26.04 |
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25.96 |
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25.78 |
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25.90 |
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26.10 |
26.06 |
25.94 |
26.16 |
25.86 |
26.06 |
26.02 |
25.92 |
25.76 |
25.92 |
||
18 |
26.06 |
25.76 |
25.94 |
26.06 |
25.82 |
26.14 |
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26.06 |
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25.78 |
25.84 |
26.06 |
25.96 |
25.86 |
26.10 |
26.04 |
26.00 |
||
19 |
25.86 |
26.06 |
26.16 |
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26.08 |
26.12 |
25.98 |
26.10 |
25.80 |
26.06 |
26.14 |
25.76 |
25.86 |
25.94 |
||
20. |
26.04 |
25.96 |
25.84 |
26.06 |
25.86 |
26.08 |
25.86 |
26.04 |
25.92 |
25.88 |
26.08 |
25.86 |
25.96 |
26.12 |
25.78 |
26.04 |
25.76 |
25.86 |
26.02 |
26.10 |
25.84 |
||
年代0 - 11 |
26.04 |
12.08 |
13.066 |
14.04 |
15.12 |
16.06 |
17.02 |
18.04 |
19.08 |
20.16 |
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22.28 |
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32.22 |
31.16 |
30.12 |
29.10 |
28.08 |
||
年代0 - 12 |
25.90 |
12.10 |
13.04 |
14.08 |
15.24 |
16.18 |
17.14 |
18.10 |
19.16 |
20.18 |
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22.24 |
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31.20 |
30.18 |
29.16 |
28.12 |
||
年代0 - 13. |
26.06 |
12.12 |
13.12 |
14.20 |
15.16 |
16.12 |
17.12 |
18.16 |
19.08 |
20.14 |
21.16 |
22.18 |
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34.40 |
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30.22 |
29.18 |
28.22 |
||
年代0 - 14 |
25.96 |
12.14 |
13.16 |
14.26 |
15.26 |
16.16 |
17.10 |
18.20 |
19.22 |
20.16 |
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22.22 |
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29.20 |
28.26 |
||
年代0 - 15 |
26.08 |
12.16 |
13.10 |
14.30 |
15.24 |
16.26 |
17.06 |
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19.21 |
20.18 |
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32.24 |
31.22 |
30.24 |
29.14 |
28.10 |
||
年代0 - 16 |
25.90 |
12.12 |
13.08 |
14.16 |
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17.16 |
18.14 |
19.24 |
20.22 |
21.24 |
22.14 |
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35.58 |
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33.52 |
32.30 32. |
31.26 |
30.28 |
29.16 |
28.14 |
||
年代0 - 17 |
25.86 |
12.16 |
13.02 |
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16.14 |
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19.16 |
20.24 |
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31.28 |
30.14 |
29.22 |
28.18 |
||
年代0 - 18 |
25.92 |
12.18 |
13.16 |
14.24 |
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16.18 |
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20.20 |
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30.16 |
29.12 |
28.16 |
||
年代0 - 19 |
25.86 |
12.06 |
13.14 |
14.28 |
15.22 |
16.20 |
17.22 |
18.20 |
19.28 |
20.22 |
21.30 |
22.32 |
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32.34 |
31.34 |
30.20 |
29.24 |
28.20 |
||
年代0 - 110 |
26.02 |
12.22 |
13.18 |
14.20 |
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18.22 |
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20.28 |
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32.30 |
31.32 |
30.28 |
29.26 |
28.24 |
||
年代0 - 111 |
25.94 |
12.16 |
13.08 |
14.18 |
15.24 |
16.38 |
17.24 |
18.10 |
19.24 |
20.26 |
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34.52 |
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31.36 |
30.32 |
29.30 |
28.28 |
||
年代0 - 112 |
25.88 |
12.20 |
13.10 |
14.32 |
15.30 |
16.34 |
17.18 |
18.16 |
19.28 |
20.18 |
21.24 |
22.38 |
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30.36 |
29.28 |
28.22 |
||
年代0 - 113 |
26.08 |
12.04 |
13.14 |
14.30 |
15.38 |
16.44 |
17.22 |
18.12 |
19.26 |
20.20 |
21.28 |
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30.34 |
29.34 |
28.30 |
||
年代0 - 114 |
25.78 |
12.14 |
13.20 |
14.28 |
15.30 |
16.38 |
17.26 |
18.14 |
19.16 |
20.22 |
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22.30 |
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30.30 |
29.36 |
28.36 |
||
年代0 - 115 |
25.92 |
12.12 |
13.18 |
14.36 |
15.18 |
16.26 |
17.22 |
18.18 |
19.24 |
20.18 |
21.32 |
22.32 |
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30.38 |
29.38 |
28.44 |
||
年代0 - 116 |
26.04 |
12.08 |
13.12 |
14.40 |
15.32 |
16.24 |
17.26 |
18.24 |
19.28 |
20.14 |
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30.42 |
29.40 |
28.32 |
||
年代0 - 117 |
25.96 |
12.10 |
13.14 |
14.22 |
15.26 |
16.36 |
17.32 |
18.26 |
19.22 |
20.26 |
21.36 |
22.38 |
23.24 |
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34.52 |
33.44 |
32.50 |
31.36 |
30.40 |
29.32 |
28.42 |
||
年代0 - 118 |
26.04 |
12.14 |
13.08 |
14.34 |
15.14 |
16.24 |
17.38 |
18.16 |
19.14 |
20.28 |
21.30 |
22.40 |
23.28 |
35.50 |
34.60 |
33.46 |
32.56 |
31.38 |
30.36 |
29.44 |
28.40 |
||
年代0 - 119 |
25.88 |
12.06 |
13.10 |
14.38 |
15.18 |
16.12 |
17.30 |
18.24 |
19.26 |
20.24 |
21.38 |
22.36 |
23.42 |
35.56 |
34.38 |
33.32 |
32.52 |
31.44 |
30.34 |
29.42 |
28.38 |
||
年代0 - 120. |
26-06 |
12.10 |
13.06 |
14.44 |
15.28 |
16.10 |
17.26 |
18.22 |
19.24 |
20.12 |
21.20 |
22.24 |
23.50 |
35.64 |
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33.36 |
32.54 |
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30.44 |
29.46 |
28.36 |
年代21 |
26.12 |
11.22 |
12.20 |
13.34 |
14.24 |
15.66 |
16.62 |
17.40 |
18.08 |
19.14 |
20.16 |
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32.18 |
31.22 |
30.18 |
29.16 |
||
年代22 |
25.94 |
11.34 |
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13.44 |
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20.22 |
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32.26 |
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30.24 |
29.22 |
||
年代23. |
25.88 |
11.28 |
12.08 |
13.22 |
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19.24 |
20.18 |
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32.28 |
31.28 |
30.22 |
29.26 |
||
年代24 |
25.96 |
11.30 |
12.24 |
13.28 |
14.38 |
15.42 |
16.56 |
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19.26 |
20.24 |
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32.34 |
31.24 |
30.20 |
29.18 |
||
年代25 |
26.08 |
11.16 |
12.26 |
13.34 |
14.28 |
15.34 |
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20.26 |
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32.20 |
31.20 |
30.30 |
29.20 |
||
年代26 |
25.90 |
11.32 |
12.22 |
13.42 |
14.34 |
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16.46 |
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19.22 |
20.12 |
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33.30 |
32.22 |
31.30 |
30.22 |
29.24 |
||
年代27 |
25.88 |
11.42 |
12.26 |
13.46 |
14.32 |
15.28 |
16.36 |
17.28 |
18.36 |
19.28 |
20.20 |
21.20 |
22.42 |
36.36 |
35.20 |
34.42 |
33.36 |
32.30 |
31.26 |
30.26 |
29.28 |
||
年代28 |
25.86 |
11.36 |
12.40 |
13.44 |
14.36 |
15.32 |
16.24 |
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20.30 |
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35.24 |
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33.32 |
32.40 |
31.30 |
30.24 |
29.30 |
||
年代29 |
26.04 |
11.38 |
12.28 |
13.38 |
14.28 |
15.38 |
16.36 |
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18.40 |
19.22 |
20.32 |
21.22 |
22.42 |
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35.30 |
34.46 |
33.34 |
32.24 |
31.34 |
30.28 |
29.34 |
||
年代210 |
25.98 |
11.28 |
12.34 |
13.32 |
14.30 |
15.30 |
16.42 |
17.34 |
18.26 |
19.28 |
20.16 |
21.24 |
22.32 |
36.32 |
35.32 |
34.40 |
33.38 |
32.36 |
31.36 |
30.32 |
29.32 |
||
年代3.1 |
25.78 |
10.80 |
11.20 |
12.44 |
13.36 |
14.28 |
15.32 |
16.24 |
17.30 |
18.24 |
19.18 |
20.22 |
21.36 |
37.40 |
36.38 |
35.28 |
34.20 |
33.18 |
32.22 |
31.26 |
30.18 |
||
年代3.2 |
26.02 |
10.84 |
11.36 |
12.36 |
13.44 |
14.34 |
15.42 |
16.30 |
17.36 |
18.30 |
19.26 |
20.26 |
21.38 |
37.46 |
36.42 |
35.34 |
34.26 |
33.24 |
32.26 |
31.28 |
30.22 |
||
年代3.3. |
25.96 |
10.72 |
11.42 |
12.30 |
13.40 |
14.36 |
15.36 |
16.32 |
17.32 |
18.26 |
19.20 |
20.28 |
21.34 |
37.48 |
36.48 |
35.30 |
34.28 |
33.26 |
32.24 |
31.30 |
30.20 |
||
年代3.4 |
25.88 |
10.78 |
11.28 |
12.34 |
13.48 |
14.42 |
15.38 |
16.28 |
17.38 |
18.28 |
19.22 |
20.32 |
21.30 |
37.42 |
36.44 |
35.32 |
34.24 |
33.28 |
32.20 |
31.24 |
30.24 |
||
年代3.5 |
26.06 |
10.66 |
11.34 |
12.40 |
13.52 |
14.44 |
15.44 |
16.36 |
17.40 |
18.30 |
19.24 |
20.20 |
21.40 |
37.44 |
36.40 |
35.36 |
34.22 |
33.32 |
32.28 |
31.26 |
30.26 |
||
年代41 |
26.08 |
10.02 |
10.60 |
11.38 |
12.42 |
13.50 |
14.56 |
15.48 |
16.56 |
17.44 |
18.38 |
19.14 |
20.22 |
38.28 |
37.32 |
36.28 |
35.32 |
34.28 |
33.28 |
32.32 |
31.30 |
||
年代42 |
25.94 |
10.08 |
10.42 |
11.32 |
12.36 |
13.42 |
14.48 |
15.56 |
16.62 |
17.48 |
18.32 |
19.24 |
20.26 |
38.34 |
37.34 |
36.30 |
35.26 |
34.24 |
33.26 |
32.36 |
31.26 |
||
年代43. |
25.84 |
10.10 |
10.56 |
11.28 |
12.30 |
13.38 |
14.40 |
15.50 |
16.48 |
17.52 |
18.40 |
19.22 |
20.28 |
38.36 |
37.36 |
36.36 |
35.36 |
34.22 |
33.34 |
32.34 |
31.24 |
||
年代44 |
25.90 |
10.04 |
10.60 |
11.12 |
12.22 |
13.30 |
14.34 |
15.52 |
16.54 |
17.46 |
18.42 |
19.26 |
20.20 |
38.30 |
37.42 |
36.42 |
35.34 |
34.26 |
33.30 |
32.38 |
31.28 |
||
年代45 |
26.02 |
10.06 |
10.52 |
11.18 |
12.32 |
13.42 |
14.48 |
15.44 |
16.50 |
17.42 |
18.30 |
19.28 |
20.24 |
38.32 |
37.46 |
36.38 |
35.28 |
34.30 |
33.32 |
32.30 |
31.22 |
比较交叉点或(e值):测试miRNA值等于归一化标准表示表达相似,低于标准表示表达增加。
b无DNA加入反应(阴性对照)。所有反应进行三次,然后取平均值。18S rRNA是
规范化标准。
该表显示了保存在稳定RNA中的60个人的粪便中获得的表达值晚些时候(Invitrogen, Carlsbad, CA): 20个非癌对照
(n1至n20);10例大便伴腺瘤性息肉≥1cm (TNM分期0-1);2期TNM患者粪便10例213.10)结肠癌;5例患者大便伴TNM期3结肠
癌症的3.13.5);5例TNM期结肠癌患者的粪便(S4155).
图3。粪便样本的火山图显示组内方差最小,导致低p-使用2计算的值(dct)使用Qiagen公司的项目,治疗0- 1期结肠癌。
图4。用TaqMan茎环定量成熟miRNA的散点图®MGB探针qPCR人miRNA表达分析60例健康和结肠癌患者粪便样本中miRNA的表达。癌症的阶段由图中最下面一行表示。正常健康人20例,结肠癌患者40例(TNM期0 ~ 4期)。高表达的例子出现在右边,低表达的例子出现在左边。在Roche LightCycler®480 PCR仪上采用CP或E-method检测茎环RT-minor grove结合qPCR的表达。选择刻度,使最小值在面板左上角标记的“最小”标记上对齐。最大值也是如此,它在面板右上方标有“Max”的标记下排列。
此外,通过qPCR在血浆中表现出可量化的优先表达的15个mirna中[图5],它们也被证明与结肠癌的发生有关,其中9个[miR-7、miR-17-3p、miR-20a、miR-2、miR-92a、miR-96、miR-183、miR196a和miR-214]在结直肠癌患者的血浆[和组织]中表达增加,TNM癌晚期的表达比腺瘤更高。另一方面,所选的6种mirna [miR-124、miR-127-3p、miR-138、miR-143、miR-146a和miR-222]在结肠癌患者的血浆[和组织]中表达减少,并且在TNM癌早期到晚期的进展过程中表达减少更为明显。14]。
图5。用TaqMan茎环定量成熟miRNA的散点图®MGB探针qPCR人血浆miRNA表达分析,用于TNM 0 ~ 3期。
需要强调的是,没有必要使用受试者工作特征(ROC)曲线,因为健康个体与结肠癌患者之间以及癌症分期之间的miRNA表达差异很大且信息丰富。例如,可以将所呈现的数据与从一组学生中获得的数据进行比较,其中一半是1圣年级学生和另一半是高中生(尽管我们考虑了更多的群体,但这个想法仍然可以只用两个群体来举例说明)。为了区分这些群体,我们会用身高作为衡量标准(在我们的实验工作中,我们使用了基因表达)。事实证明,最矮的高中生比最高的要高得多圣格拉德和以上所有人都是高中生。特异性、敏感性和曲线下面积均为100%。当我们使用weight(在我们的工作中,一个不同的表达)时,我们得到同样的结果:最轻的高中生比最重的学生要重得多圣年级的学生。我们可以使用其他方法,如鞋码或阅读水平,同样得到相同的结果。
因此,我们的结果与文献报道的这些miRNAs在结肠癌患者的组织、粪便和血液以及培养细胞中的表达大致一致[42-46、48、50、52、54、55、56、67、76、103]。这表明选择精心挑选的一组mirna可以区分非结肠癌和结肠癌,甚至可以区分不同的TNM分期。A miRNA表达指数[见表5]类似于mRNA [124]或复杂的多元统计分析[125因此,为了从这些集体数据中得出结论,在使用mirna时没有必要。
表5所示。miRNA标记物作为总RNA功能的数值基础。
病人# |
诊断 |
总RNA (µg/g粪便) |
CP * |
|
样本 |
集团 |
|||
2 |
健康的控制 |
0.28 |
25.99 |
|
5 |
健康的控制 |
0.30 |
27.21 |
|
8 |
健康的控制 |
0.29 |
25.96 |
26.05 |
14 |
健康的控制 |
0.31 |
25.09 |
|
17 |
健康的控制 |
0.32 |
26.01 |
|
56 |
IV期癌 |
0.31 |
20.18 |
|
57 |
IV期癌 |
0.32 |
22.03 |
|
58 |
IV期癌 |
0.31 |
22.43 |
21.90 |
59 |
IV期癌 |
0.30 |
||
60 |
IV期癌 |
0.31 |
*CP:在Roche LC 480聚合酶链式反应仪中通过算法计算的交叉点值。
表6所示。预测MicroRNA指数(PMI)
癌症病例 |
真阳性(TP) |
假阴性(FN) |
正常的课程 |
假阳性(FP) |
真阴性(TN) |
%灵敏度=TPx 100,%特异性=TNx 100
Tp + fn + fp + tn
如果数据在更大的流行病学随机验证研究中得到证实,则可以通过验证研究将所使用的miRNA基因的初始数量[10、15或20]细化到更低的数量[甚至单个miRNA分子][126在粪便或血液样本中,采用前瞻性标本收集回顾性盲法评估[PRoBE]设计,从同意的队列人群中随机选择对照受试者和病例患者,以避免偏倚,并确保生物标志物选择和结果评估不会相互影响,从而对数据结果具有统计置信度。然后可以将经过验证的miRNA生物标记物放置在芯片上以方便筛选,就像测试食品中的转基因生物一样[57]以方便和自动化研究miRNA表达。
有必要清楚地了解人体的正常、健康的功能及其值范围[例如,与年龄、性别、环境有关],以便通过研究健康献血者和患者的人体组织/血液/粪便,更彻底地发现什么是异常的。这类研究需要来自大量受试者的高质量样本——数百至数千人——通过适当的流行病学方法设计,该方法采用随机无偏探针设计,从同意的队列人群中选取数百至数千名对照受试者和病例患者[127]。
比较交叉点[CP]值[或e -法][119使用PCR LightCycler [LC] Quantification Software™,Version v4.0 [120]为罗氏LC PCR仪器[曼海姆,德国],用于半定量PCR分析。该方法采用标准曲线,其中相对目标浓度是交叉点差的函数[或循环数],由二阶导数最大值[121],其中Cycler的软件算法确定了显示荧光的图形的第一个转折点与自动计算miRNA基因的表达量,无需用户输入,具有较高的灵敏度和特异性。CP值对应于每口井具有相同动力学性质的循环数。CP方法对应于2——ΔΔCT法[128]被其他PCR仪器所使用,尽管后一种方法产生可靠的定量结果只有如果PCR检测靶基因和内参基因的效率[E=10-1/斜率]相同且等于2[即每个扩增周期中的分子加倍];例如,如果A1井的CP值为15,A2井的CP值为16,我们推断A1井中有两倍的目标基因。约3.3 CP值的差异显示了10倍的差异。不可能在不同的引物对之间比较这些值。CP方法补偿了实验内或实验间靶基因和参比基因扩增效率的差异。
将数据规范化为“参考“内参基因(如内源性内参基因RNU6基因RNU6A和RNU6B, SNORD基因SNORD43、SNORD44、SNORD48、SNORA74A)或miRNA归一化器(如miRNA 16、miRNA-191),或在某些情况下针对几种标准,因为在进行相对定量时,不同样品的总输入量可能不同。”为了确保miRNA的定量不受不同分析步骤可能引入的技术变异性的影响,合成的非人类尖峰miRNA已被用于监测RNA纯化和RT效率。的秀丽隐杆线虫使用了cell - mir -39、cell - mir -54、合成miRNAs Quanto ECI和Quanto EC2以及猿猴病毒基因SV40;这些外源性miRNA通常在RT步骤之前加入样品中,以避免模板质量的差异,或影响RT反应的效率,并可以消除结果的偏差,使结果可靠,但不能纠正组织、体液或细胞外囊泡样品的采样偏差或质量。有人提出,最好的规范化策略是采用外源性和内源性对照miRNA的组合,因为这弥补了样品之间miRNA恢复和cDNA合成的差异[128]。一些研究使用绝对数据规范化和microrna的表达使用标准曲线计算由合成microrna每毫微克和融化曲线归一化总输入RNA的microrna在40对CRC - 221和miRNA-18a组织和595份粪便样本,技术检测2份microrna的极限——221年导致Cq 42岁的价值和技术检测极限的5份miRNA-18a导致Cq 47的价值,都分配一个值为0,类似样品,没有miRNA-221或miRNA-18a扩增[129]。但需要注意的是,Cq > 40的值是不可靠的[128]。因此,绝对归一化方法仅对RNA质量好的样品是可靠的[130]。
为了报告“折叠变化”结果,LC软件结合了所有这些因素。CP方法可以归一化运行之间的差异,因为这些差异是由试剂化学变化引起的。为了实现这种标准化,必须指定一个相关标准为校准器“目标基因和参考基因,参考基因可以是我们的任何健康对照粪便样本。这些校准器可以在随后的运行中重复使用,以保证有一个共同的参考点,允许对系列内的所有实验进行比较。必要时,将2——ΔΔC如果样品正确标记,可以通过仪器软件计算T;2——ΔΔCT计算也可以手动设置。为了确定目标基因CP值为10的特定未知癌症粪便或血液样本的折叠变化,需要三个附加值:a]同一未知粪便样本/癌症粪便样本的参比基因CP值,b]校准样本/正常粪便的靶基因CP值,以及c]校准样本/正常粪便或血液的参比基因CP [131]。
在所有的PCR反应中,必须严格注意质量控制[QC]程序,随着该领域的成熟,我们也实施了关于报告qPCR数据的指南,即定量实时PCR表达[MIQUE]的最小信息发布[132],以确保PCR反应的均匀性、再现性、可靠性和数据的完整性。我们的粪便和血浆数据表明,没有必要使用绝对PCR定量的mirna,使用数字PCR。
在基因组学工作中,了解统计学和生物信息学对于理解和理解生成的数据是很重要的[133]。首先,功率分析可用于估计研究的样本量[134]。此外,可以进行功率分析以及一级和二级验证研究,以了解数据的分离程度和可重复性[135]。
如果发现健康患者和癌症患者之间以及分期之间的miRNA基因表达差异很大,并且对多个miRNA基因具有丰富的信息,这表明分类程序可以基于超过阈值的值,那么就不需要复杂的分类来区分研究数据。但是,如果在大样本上发现不一致的差异,则可以采用预测分类方法[13]。Qiagen公司提供的程序可以免费用于分析、归一化和绘制分子数据[http://pcrdataanalysis.sabiosciences/com]。
预测分类的目标是根据从案例中收集的信息将案例分配给预定义的类。在最简单的设置中,分类(即肿瘤)被标记为癌性和非癌性。对收集到的信息进行预测分类的统计分析[即miRNA基因的微阵列和qPCR]试图近似一个最佳分类器。分类可以是线性的、非线性的或非参数的[133 - 135]。如果数据分布是随机的,可以先用参数统计方法分析miRNA表达数据,如Student t检验或方差分析[ANOVA],如果分布不是随机的,可以用非参数Kruskall-Wallis、Mann-Whitney和Fisher精确检验[133 - 136]。如果需要,复杂的模型,如多变量分析和逻辑判别[137 - 138也可以被雇用。
假阳性发现率[预期分配中不正确分配的预期比例]也可以通过统计方法进行评估[139 - 141],因为它可以反映出检测的有效性,因为需要对假阳性进行后续检测。需要通过统计方法确定最佳miRNA基因的数量(无论是20个还是更少),以实现预测粪便致癌性的最佳基因面板。
对于修正后的指数,交叉验证可用于:防止过拟合,解决使用数据来拟合和评估模型拟合的困难,并确定癌症研究所需的样本数量,其中两个独立随机选择的样本中共同基因表达的预期比例估计在20%至50%之间[142]。Efron和Tibshirani [143建议将数据分成10等份,用其中一部分来评估其他9部分产生的模型;这对10个部分中的每一部分都重复。交叉验证提供了一个更现实的误分类率估计。ROC曲线下的面积[其中灵敏度绘制为[1 -特异性]的函数],通常用于描述灵敏度和特异性之间的权衡[144]。
主成分分析]方法(145],这是一种多变量降维技术,也可以用来简化那些表现出异常表达的基因与那些没有表现出表达的基因的分组,或者是表达大大减少的基因。如果几个基因本身在粪便样本中的对照或癌症病例之间提供明显和明确的区分,则可能不需要PMI。
如果发现miRNA基因面板[或衍生PMI]比现有的筛选方法更好,那么产生的所有数据都可以用于评估模型,因此过度拟合就不存在问题。基因表达水平可以用平行坐标图在数据库中显示[146 - 147由R中的lattice包生成[version 2.9.0, the R Foundation for Statistical Computing]http://cran.r-project.org]和S-plus软件[洞察力公司,西雅图,华盛顿州]。NCSS发布的GESS[基因表达统计系统]等其他软件包[http://www.ncss.com也可根据需要雇用
使用基本TargetScan算法对上调和下调的mrna基因进行生物信息学分析。该程序产生了21个编码不同细胞调控功能的mRNA基因。这些mrna中的前12个是通过DAVID程序发现的[148在细胞核中活跃,并与基因调控的转录控制有关。对于下调的mirna, DAVID算法发现前四种mrna聚集在细胞周期调控类别中[12]。
为了给结肠癌增加另一个层次的复杂性,结肠癌肿瘤已经显示出mirna的差异表达,这取决于它们的错配修复状态。MiRNA在结肠肿瘤中的表达表现出一种表观遗传成分,错配修复导致的表达改变可能反映了未分化增殖发育状态的调节程序特征的逆转[149]。
mirna也经历表观遗传失活[150], CRC中miRNA的表达与MSI亚组相关[151 - 152]。mirna可能通过调节关键组蛋白修饰来调节染色质结构;例如,软骨特异性miR-140靶向小鼠组蛋白去乙酰化酶4 [153], mirna可能参与小鼠非突触染色质的减数分裂沉默[154]。此外,DNA甲基化酶DNMT、3a和3b被预测为潜在的miRNA靶点[155]。此外,一组特定的miRNAs [epi-miRNAs], miR-107, -124a, -127,直接靶向表观遗传机制的效应物,如dnmt,组蛋白去乙酰化酶和多梳抑制复合体基因,并间接影响抑制基因的表达[156-158]。
除了负调控靶mRNA外,mirna还受到其他因素的调控。例如,c-myc激活miR-17-92簇的转录,在血管生成中起作用[159], TFs NFI-A和C/EBPα竞争结合miR-223启动子,分别降低和增加miR-223的表达[160]。MiR-223也参与自身的反馈,并通过抑制NFI-A的翻译促进C/EBPα的结合。许多位于蛋白质编码基因内含子中的mirna与其宿主基因共同调控[161]。现在的挑战是确定那些被认为对肿瘤起始、进展或转移过程至关重要的驱动甲基化变化,并将这些变化与甲基化变化区分开来,甲基化变化仅仅是伴随转化过程的乘客事件,但没有影响本身在致癌作用。
用吉姆萨染色法对纯化的结肠细胞进行细胞学分析[162],显示出在涂片中检测肿瘤细胞的敏感性为80%,略好于先前报道[即。约78%][163 - 164]。
对从粪便中分离的结肠细胞进行了mirna作为总RNA功能的数值支持[165]在5个健康对照样本和5个TNM IV期结肠癌样本中添加防腐剂之前,从它们中提取总RNA并确定每个粪便样本中总RNA的实际数量,并从平均CP值中确定,考虑到一些外泌体RNA不会从纯化的结肠细胞释放到粪便中,并对这种影响进行任意校正[166]。从数据中可以看出表4IV期结肠癌的平均CP值为21.90,而健康对照组的CP值为26.05。
表4。粪便样本中一些miRNAs CP值的标准差(SDs)按其递减的顺序排列
mir - 96 |
mir - 143 |
mir - 146 a |
mir - 214 |
miR-21 |
miR-9 |
miR-7 |
mir - 92 a |
miR-20a |
mir - 134 |
mir - 938 |
7.898177 |
7.295028 |
6.593613 |
6.550193 |
6.356752 |
6.042022 |
5.793815 |
5.623533 |
5.450223 |
5.288764 |
5.204872 |
mir - 222 |
mir - 138 |
mir - 127 - 5 - p |
miR-29b |
mir - 17 |
mir - 183 |
mir - 196 a |
18 srrna |
mir - 199 - a - 3 - p |
MiR - 106 |
- |
5.193460 |
4.789436 |
4.139903 |
3.804948 |
3.796239 |
0.612726 |
0.5513392 |
0.379780 |
0.144222 |
将正常健康个体和结肠癌患者粪便结肠细胞样本中计算的miRNA基因CP值所获得的miRNA方法的测试性能特征[TPC]与常用的FOBT测试以及从患者病历中获得的结肠镜检查结果进行比较。60例受试者[20例对照组和40例不同TNM分期的结肠癌患者]。数据显示,从患者病历中获得的结肠镜检查结果与对照组和结肠癌患者的研究结果高度相关。
采用miRNA方法进行结肠癌筛查的创新之处在于,在非侵入性粪便或半侵入性血液样本中,探索性地使用价格合理的、定量的miRNA表达谱分析这些分子,其提取的脆弱总RNA可以在粪便收集或用市买试剂盒抽血后不久在实验室中稳定下来,因此它不会破碎,随后是全局miRNA表达。然后对较少的选择基因进行定量标准化分析实时qPCR测试,既不需要劳动密集型,也不需要大量的样品制备,以便开发一组较少的新型miRNA基因,更经济地用于早期左、右散发性结肠癌的诊断筛查,并且具有比目前市场上任何其他结肠癌筛查测试更高的敏感性和特异性。
RT-qPCR一直备受争议。虽然这项技术被认为是量化细胞、组织或体液/排泄物中基因表达的黄金标准,但涉及的变量太多了,不同的实验室可能会进行相同的实验,最终得到不同的结果。此外,尽管一项研究可能会产生统计上显著的结果,但很难知道该结果是否真正有效,或者数据是否因技术错误而被扭曲。因此,在2009年,一组研究人员发表了指导方针,以帮助科学家发表既准确又可重复的数据。这些指南被称为“定量实时PCR实验发表的最低信息[MIQE]”。他们解决了qPCR的几个关键方面,包括样品质量控制,分析设计,PCR效率和标准化。一篇论文试图为几种不同的人类癌细胞系确定一组合适的、可靠的内参基因,并确定是否遵循了MIQE指南,报告说,在许多研究中,重要的数据缺失,因为许多出版物没有报告其内参基因的效率或其qPCR数据,并且只有30 - 40%的调查内参基因的已发表研究实际上遵循了MIQE指南[132]。此外,由于PCR的最新化身,数字PCR或dPCR,现在被越来越多的实验室用于提供更广泛的定量,最近出版了一套新的MIQE指南,针对这一全新版本的PCR的具体问题[167]。
值得注意的是,自1993年发现miRNA以来,从事癌症研究的研究者开始关注这些调控分子,并试图开发出诊断该疾病的微创标记物。虽然在粪便和血液样本中使用聚合酶链反应的方法目前是开发可靠筛选标记的定量方法的前沿,但可以生产一种包含这些基因组合的芯片来简化测试,就像在食品中的转基因生物测试中所完成的那样[57]。
MiRNAs是一种有趣的生物标志物,稳定、可扩增、功能重要,具有丰富的信息含量,在基因调控中发挥重要作用,miRBase release 20,2013年6月注释的MiRNAs表达谱为24,5211个位点,在206个物种中使用小RNA深度测序800个经过验证的分子,可以区分恶性和非恶性组织,以及区分不同的肿瘤实体[96]。大多数循环mirna与Argonaute2相关,Argonaute2是RISC沉默复合体的一部分。但是,这些循环的mirna是来自正常组织还是肿瘤组织,以及它们是如何通过细胞死亡或其他过程释放到体液中的,这些问题大多没有答案。在健康组织中,有证据表明细胞在囊泡和蛋白质复合物中释放mirna,这些mirna随后可以作为细胞间信号分子。当被受体细胞吸收时,mirna可以调节它们的基因表达。在肿瘤组织细胞中,它们促进有助于肿瘤存活的微环境,使肿瘤具有选择性优势。然而,目前尚不清楚各种方式的被动释放和细胞内编程释放(例如免疫细胞)之间的平衡是什么。许多与实体肿瘤相关的循环mirna也在血细胞中表达。mirna的来源并不重要,只要它们被验证为标记。随着技术的不断发展和改进,建立提取和定量循环mirna的标准化方案一直是一个挑战; however, it is expected that in 5 to 10 years, we'll have worked out the best way to quantitate miRNAs in stool, blood and other body fluids.
由于许多肿瘤标志物的结果没有得到充分的报道,这种异常现象导致解释研究数据的困难和无法比较来自不同来源的已发表的工作,美国国家癌症研究所和欧洲癌症研究和治疗组织[NCI-EORTC]联合发布了以透明的方式开展肿瘤标志物研究和充分报告研究结果的指南[168这样研究人员就可以对结果有信心,并可以使用已发表的方法重复这些数据。
设想最终将生产出一种设计简单、性能耐用、易于使用的可植入生物传感器平台的微流控装置,个人可以在家中采集非侵入性粪便或半侵入性血液样本,并将其插入其中,用于结肠癌疾病标志物的检测。识别早期疾病生物标志物,结合现实的自我意识和持续的健康自律,将使个人能够迅速采取预防措施,这将有助于防止这种癌症的扩散。
以下建议被认为是重要的,并代表了我们如何设想mirna影响结肠癌的发生和进展的总结:
我们向dr。保罗·沃斯和克拉克·杰弗里斯在生物统计学和生物信息学方面的见解。本研究由美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究所卫生与人类服务部NIH资助1R43-CA144823-A1-01;北卡罗莱纳州SBIR/STTR配对基金计划,美国北卡罗来纳州罗利市科学技术办公室拨款号G30433001211SBIR;以及来自美国北卡罗来纳州格林维尔生物技术研究所GEM Tox实验室的额外运营资金。
研究文章
收稿日期:2017年11月9日
录用日期:2017年12月5日
发布日期:2017年12月8日
©2017 Ahmed FE。这是一篇根据知识共享署名许可协议发布的开放获取文章,该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制,前提是要注明原作者和来源。
Ahmed FE(2017)粪便或血液中早期结肠癌的mirna诊断筛查*。外科病例报告Rev 1: DOI: 10.15761/SCRR.1000103
GEM Tox实验室,生物技术研究所2905 South Memorial Drive, Greenville, NC 27834, USA
表1。癌前病变检查方法的比较__&恶性结肠癌筛查
测试规范 |
FBOT__, 愈创木脂® |
Immunolo● |
甲基化基因■& |
启动子♦甲基化 |
突变◘ |
结肠镜检查 检查▲ |
蛋白质组学 方法► |
信使核糖核酸▌方法 |
microrna的▼方法 |
总会在₦ 方法 |
非侵入性 |
是的 |
是的 |
是的 |
是的 |
是的 |
没有 |
是的 |
是的 |
是的 |
是的 |
灵敏度 |
10.8%__ |
16.3%__ |
7.5%■ |
31%__ |
18.2% |
87% |
75% |
> 80% |
> 90%¶, |
> 95% |
特异性 |
95% |
94.5% |
82% |
95% |
94.4 |
100% |
> 95% |
> 95% |
> 95%¶ |
>99% |
自动化 |
没有 |
没有 |
没有 |
没有 |
没有 |
没有 |
是的 |
是的 |
是的 |
是的 |
成本 |
15美元♪ |
$25♪ |
400美元♪ |
250美元♪ |
649美元♪ |
900美元♪ |
650美元♪ |
350美元♪ |
200 - 400美元♪ |
1000美元 |
__,§,●FOBT:目前广泛使用,因为它方便,不昂贵,但它的灵敏度低,需要多次采样,降低了依从性。
■甲基化基因:只适用于晚期癌症的检测,但是不腺瘤,基于vimentin基因,DY位点5p21和OC91199,因此不适合人群筛查。
♦启动子甲基化:仅基于一个基因,基本上是研究目的的专门程序,因此不适合人群筛查。
◘突变DNA标记:一种DNA测试,被称为Cologuard®由威斯康星州麦迪逊市的精确科学公司分发,包括KRAS突变的定性分析,缩写NDRG4和BMP3甲基化,Badm,加上血红蛋白测定,用于人类粪便中隐藏血红蛋白的存在;Colvera由新泽西州Bridgewater的临床基因组学病理学公司(Clinical Genomics Pathology, Inc .)上市,是一种通过与结直肠癌肿瘤生长相关的DNA中两个改变基因BCT1和IKZF1的存在来检测结直肠癌复发的定性检测。通过使用Clovera和CEA,可以在症状变得明显,导致转移之前识别CRC复发,通过将生物标志物DNA检测与FIT结合,可以显著提高对晚期腺瘤的敏感性;然而,它的特异性较低,因此需要更多的结肠镜检查,更繁琐,而且费用昂贵。
▲结肠镜检查:目前它被认为是检测结肠癌的金标准,尽管它是侵入性的,对某些人可能会导致一定的风险。
►蛋白质组学方法。蛋白质组的TM技术采用LC-MS/MS定量靶向蛋白质组学;然而,它需要专门的研究设备/试剂,因此被认为是研究性的。
▌mRNA途径:脆性信使RNA的靶标变化;因此,在粪便制备、RNA提取和储存方面需要特别小心。
▼miRNA方法:由于小miRNA分子的稳定性,它比mRNA方法更可取,并且在粪便或血液中有几种miRNA具有良好的群体筛选潜力。根据我们的数据,息肉直径≥1cm,呈绒毛状或管状,或存在高度不典型增生和癌。
₦NGS筛选:它有潜力,但在商业化之前需要进一步发展。
♪筛选测试的费用取决于测试的mirna数量;评估是基于引用,与测试开发人员的联系,以及我们在临床分析需求和开发方面的经验。
表2。NGS和qPCR miRNA分析的QC和处理平台的比较
总会在 |
qPCR |
一般 提供了一种无假设的方法。 能够检测异构体和新的mirna 与qPCR相比,灵敏度较低 需要比qPCR更高的样本量。 |
设计用于检测预先选择的mirna。 针对特定的miRNA序列设计 (通常列在miRBase中)。 与NGS相比,灵敏度更高。 比NGS需要更少的样本。 |
优化了NGS和qPCR的miRNA分析方法 RNA尖刺蛋白是在RNA过程中添加的 隔离步骤,以监控再现性 和反应分离的线性关系 |
RNA溢出也包括用于RNA QC qPCR分离反应。 |
基于qpcr的QC监测RNA分离 效率、抑制和异常值检测。 |
基于qpcr的QC监测RNA分离 效率、抑制和异常值检测。 |
溶血指标,峰值控制& |
溶血指标,峰值控制& 内源性miRNA控制。对于RNA QC。 |
文库编写利用方法优化d 对于起始物料的低粘度,尺寸的选择 最大限度地提高miRNA的读取量,并通过 生物分析仪和qPCR。 |
选择合适的RT方法和 qPCR化验。 |
使用测序平台。 |
使用合适的qPCR仪器。 |
NGS和qPCR分析管道 原始测序数据(FASTQ文件)数据QC和过滤 基础和读取质量。数据质量评估。适配器修剪。 |
qPCR原始数据(Cq值)数据QC T米并进行熔化曲线分析。 聚合酶链反应效率。 与阴性对照比较。 RNA刺入和板间校准器。 |
映射和计数 miRBase 20 参考基因组 其他参考来源(如Rfam, Small RNA) 丰富的序列(映射)。 |
过滤 标记并删除无法满足要求的应用程序 |
装配和新数据 预测新型mirna(如miRPara) 异构体的鉴定。 |
PCR效率无抑制(s)。 |
应用阈值 TPM阈值。 在一组x%的样本中检测到。 |
应用阈值 Cq值阈值。 在一组x%的样本中检测到。 |
归一化 M值的修剪平均值(EdgeR)包 |
归一化 所有mirna的全球平均表达量 过滤后在所有样品中表达 (n= 127次试验)。 |
差异表达分析 负二项精确检验(EdgeR包) |
差异表达分析 参数或非参数统计 (例如,t检验、方差分析、Wilcoxon检验等)。 |
表3:干环RT,塔克曼OMGB检测正常人及结肠癌患者粪便中qPCR miRNA的表达
凳子 样本 |
18岁 核糖体rna stnd |
米尔 199年a-3p CP |
米尔 196年,一个 CP一个 |
米尔 183 CP一个 |
米尔 96 CP一个 |
米尔 7 CP一个 |
米尔 214 CP一个 |
米尔 21 CP一个 |
米尔 20 CP一个 |
米尔 92年,一个 CP一个 |
米尔 134 - CP一个 |
米尔 17 CP一个 |
米尔 106年,一个 CP一个 |
米尔 143 CP一个 |
米尔 146年,一个 CP一个 |
米尔 9 CP一个 |
米尔 222 CP一个 |
米尔 138 CP一个 |
米尔 127 - 5 - p CP一个 |
米尔 29个b CP一个 |
米尔 938 CP一个 |
||
负的Ctb |
25.87 |
25.68 |
26.26 |
26.04 |
26.04 |
26.14 |
25.88 |
26.44 |
25.90 |
25.78 |
26.04 |
25.82 |
26.12 |
25.66 |
26.08 |
25.92 |
26.42 |
25.98 |
26.10 |
25.78 |
26.04 |
||
N 1 |
25.98 |
26.04 |
25.56 |
26.91 |
26.06 |
26.27 |
26.32 |
25.66 |
26.52 |
26.14 |
25.90 |
26.15 |
25.77 |
25.68 |
25.65 |
25.80 |
25.78 |
26.02 |
25.98 |
26.06 |
25.36 |
||
N 2 |
26.34 |
25.90 |
25.46 |
25.74 |
25.82 |
25.64 |
26.46 |
26.10 |
26.32 |
25.92 |
25.68 |
26.16 |
25.98 |
26.64 |
25.88 |
26.12 |
25.68 |
25.98 |
25.78 |
26.04 |
25.66 |
||
N 3 |
26.46 |
26.04 |
25.84 |
26.22 |
26.34 |
26.18 |
26.44 |
26.52 |
26.22 |
26.16 |
25.98 |
25.88 |
26.10 |
26.14 |
25.88 |
25.98 |
26.12 |
26.06 |
26.08 |
25.68 |
26.04 |
||
N 4 |
25.88 |
25.64 |
25.68 |
25.11 |
25.96 |
25.98 |
25.62 |
25.84 |
25.92 |
25.96 |
26.08 |
26.16 |
25.96 |
26.02 |
26.16 |
25.80 |
25.86 |
25.96 |
25.78 |
25.56 |
25.86 |
||
N 5 |
26.78 |
25.69 |
26.24 |
25.78 |
25.94 |
25.86 |
25.48 |
25.86 |
25.94 |
26.22 |
25.88 |
25.92 |
26.12 |
25.98 |
26.12 |
25.88 |
26.16 |
25.78 |
26.12 |
25 - 98 |
26.04 |
||
N 6 |
25.68 |
25.88 |
25.98 |
26.02 |
26.18 |
26.10 |
25.88 |
25.78 |
25.86 |
26.78 |
26.04 |
26.08 |
25.68 |
26.06 |
25.98 |
26.02 |
25.88 |
26.16 |
25.86 |
26.12 |
25.68 |
||
N 7 |
25.66 |
26.02 |
26.10 |
25.98 |
25.84 |
25.88 |
26.14 |
25.68 |
26.06 |
25.68 |
25.98 |
25.78 |
26.10 |
25.66 |
26.08 |
25.76 |
26.06 |
25.68 |
25.98 |
25.86 |
25.76 |
||
N 8 |
26.04 |
25.78 |
25.88 |
25.76 |
26.08 |
26.18 |
25.68 |
26.14 |
25.84 |
26.06 |
26.12 |
25.94 |
25.68 |
26.10 |
25.84 |
26.02 |
25.78 |
26.08 |
25.76 |
26.06 |
26.14 |
||
N 9 |
25.68 |
26.04 |
26.08 |
25.88 |
25.92 |
25.86 |
26.06 |
25.76 |
26.10 |
25.66 |
25.82 |
26.06 |
26.02 |
25.82 |
26.08 |
25.78 |
26.14 |
25.86 |
26.02 |
25.98 |
25.80 |
||
10 |
26.12 |
25.80 |
25.92 |
26.06 |
25.74 |
26.08 |
25.90 |
25.84 |
25.94 |
26.08 |
26.04 |
25.90 |
25.80 |
26.06 |
25.72 |
26.06 |
25.96 |
25.88 |
25.90 |
26.12 |
26.06 |
||
11 |
25.78 |
26.10 |
26.04 |
25.88 |
26.08 |
25.84 |
26.02 |
26.06 |
25.72 |
25.90 |
25.68 |
26.08 |
26.14 |
25.94 |
26.06 |
25.88 |
26.16 |
26.06 |
26.10 |
25.90 |
25.80 |
||
12 |
26.02 |
25.96 |
25.78 |
26.08 |
25.96 |
26.12 |
25.78 |
25.88 |
26.06 |
26.08 |
26.12 |
25.76 |
25.96 |
26.08 |
25.90 |
26.08 |
25.76 |
25.88 |
25.96 |
26.04 |
26.12 |
||
13 |
25.68 |
26.02 |
26.10 |
25.82 |
26.06 |
25.76 |
26.10 |
26.06 |
25.90 |
25.76 |
25.96 |
26.06 |
26.10 |
25.84 |
26.16 |
25.76 |
26.14 |
26.08 |
26.08 |
25.96 |
25.88 |
||
14 |
26.02 |
25.96 |
25.76 |
26.00 |
25.96 |
26.08 |
25.80 |
25.96 |
26.06 |
25.80 |
26.08 |
25.76 |
25.74 |
26.06 |
25.88 |
26.16 |
25.92 |
25.88 |
25.90 |
26.06 |
26.16 |
||
15 |
25.86 |
26.08 |
26.14 |
25.98 |
26.02 |
25.80 |
26.12 |
25.98 |
25.86 |
26.02 |
25.90 |
26.08 |
26.12 |
25.88 |
26.04 |
25.78 |
26.06 |
26.10 |
25.86 |
25.90 |
25.84 |
||
16 |
26.00 |
25.92 |
25.86 |
26.08 |
25.96 |
26.08 |
25.90 |
26.16 |
26.08 |
25.78 |
26.06 |
25.78 |
25.66 |
26.12 |
25.70 |
26.06 |
25.96 |
25.80 |
26.02 |
26.12 |
26.02 |
||
17 |
25.70 |
26.04 |
26.08 |
25.96 |
26.14 |
25.78 |
26.10 |
25.84 |
25.90 |
26.04 |
25.96 |
26.10 |
26.06 |
25.94 |
26.16 |
25.86 |
26.06 |
26.02 |
25.92 |
25.76 |
25.92 |
||
18 |
26.06 |
25.76 |
25.94 |
26.06 |
25.82 |
26.14 |
25.88 |
26.06 |
26.02 |
25.86 |
26.12 |
25.86 |
25.96 |
25.78 |
25.84 |
26.06 |
25.96 |
25.86 |
26.10 |
26.04 |
26.00 |
||
19 |
25.86 |
26.06 |
26.16 |
25.86 |
26.08 |
25.94 |
26.02 |
25.82 |
25.78 |
26.08 |
25.90 |
26.08 |
26.12 |
25.98 |
26.10 |
25.80 |
26.06 |
26.14 |
25.76 |
25.86 |
25.94 |
||
20. |
26.04 |
25.96 |
25.84 |
26.06 |
25.86 |
26.08 |
25.86 |
26.04 |
25.92 |
25.88 |
26.08 |
25.86 |
25.96 |
26.12 |
25.78 |
26.04 |
25.76 |
25.86 |
26.02 |
26.10 |
25.84 |
||
年代0 - 11 |
26.04 |
12.08 |
13.066 |
14.04 |
15.12 |
16.06 |
17.02 |
18.04 |
19.08 |
20.16 |
21.20 |
22.28 |
23.62 |
35.50 |
34.44 |
33.40 |
32.22 |
31.16 |
30.12 |
29.10 |
28.08 |
||
年代0 - 12 |
25.90 |
12.10 |
13.04 |
14.08 |
15.24 |
16.18 |
17.14 |
18.10 |
19.16 |
20.18 |
21.18 |
22.24 |
23.50 |
35.56 |
34.36 |
33.46 |
32.28 |
31.20 |
30.18 |
29.16 |
28.12 |
||
年代0 - 13. |
26.06 |
12.12 |
13.12 |
14.20 |
15.16 |
16.12 |
17.12 |
18.16 |
19.08 |
20.14 |
21.16 |
22.18 |
23.54 |
35.60 |
34.40 |
33.48 |
32.26 |
31.24 |
30.22 |
29.18 |
28.22 |
||
年代0 - 14 |
25.96 |
12.14 |
13.16 |
14.26 |
15.26 |
16.16 |
17.10 |
18.20 |
19.22 |
20.16 |
21.22 |
22.22 |
23.60 |
35.54 |
34.38 |
33.44 |
32.20 |
31.18 |
30.26 |
29.20 |
28.26 |
||
年代0 - 15 |
26.08 |
12.16 |
13.10 |
14.30 |
15.24 |
16.26 |
17.06 |
18.18 |
19.21 |
20.18 |
21.20 |
22.20 |
23.58 |
35.58 |
34.42 |
33.42 |
32.24 |
31.22 |
30.24 |
29.14 |
28.10 |
||
年代0 - 16 |
25.90 |
12.12 |
13.08 |
14.16 |
15.14 |
16.24 |
17.16 |
18.14 |
19.24 |
20.22 |
21.24 |
22.14 |
23.52 |
35.58 |
34.40 |
33.52 |
32.30 32. |
31.26 |
30.28 |
29.16 |
28.14 |
||
年代0 - 17 |
25.86 |
12.16 |
13.02 |
14.20 |
15.28 |
16.14 |
17.08 |
18.12 |
19.16 |
20.24 |
21.26 |
22.16 |
23.44 |
35.62 |
34.50 |
33.54 |
32.36 |
31.28 |
30.14 |
29.22 |
28.18 |
||
年代0 - 18 |
25.92 |
12.18 |
13.16 |
14.24 |
15.32 |
16.18 |
17.18 |
18.16 |
19.18 |
20.20 |
21.28 |
22.26 |
23.38 |
35.66 |
34.46 |
33.46 |
32.38 |
31.30 |
30.16 |
29.12 |
28.16 |
||
年代0 - 19 |
25.86 |
12.06 |
13.14 |
14.28 |
15.22 |
16.20 |
17.22 |
18.20 |
19.28 |
20.22 |
21.30 |
22.32 |
23.36 |
35.34 |
34.48 |
33.48 |
32.34 |
31.34 |
30.20 |
29.24 |
28.20 |
||
年代0 - 110 |
26.02 |
12.22 |
13.18 |
14.20 |
15.36 |
16.42 |
17.20 |
18.22 |
19.30 |
20.28 |
21.36 |
22.36 |
23.46 |
35.36 |
34.44 |
33.50 |
32.30 |
31.32 |
30.28 |
29.26 |
28.24 |
||
年代0 - 111 |
25.94 |
12.16 |
13.08 |
14.18 |
15.24 |
16.38 |
17.24 |
18.10 |
19.24 |
20.26 |
21.34 |
22.34 |
23.48 |
35.42 |
34.52 |
33.38 |
32.32 |
31.36 |
30.32 |
29.30 |
28.28 |
||
年代0 - 112 |
25.88 |
12.20 |
13.10 |
14.32 |
15.30 |
16.34 |
17.18 |
18.16 |
19.28 |
20.18 |
21.24 |
22.38 |
23.50 |
35.46 |
34.56 |
33.34 |
32.42 |
31.44 |
30.36 |
29.28 |
28.22 |
||
年代0 - 113 |
26.08 |
12.04 |
13.14 |
14.30 |
15.38 |
16.44 |
17.22 |
18.12 |
19.26 |
20.20 |
21.28 |
22.26 |
23.54 |
35.48 |
34.54 |
33.32 |
32.48 |
31.40 |
30.34 |
29.34 |
28.30 |
||
年代0 - 114 |
25.78 |
12.14 |
13.20 |
14.28 |
15.30 |
16.38 |
17.26 |
18.14 |
19.16 |
20.22 |
21.26 |
22.30 |
23.46 |
35.52 |
34.46 |
33.36 |
32.46 |
31.42 |
30.30 |
29.36 |
28.36 |
||
年代0 - 115 |
25.92 |
12.12 |
13.18 |
14.36 |
15.18 |
16.26 |
17.22 |
18.18 |
19.24 |
20.18 |
21.32 |
22.32 |
23.38 |
35.58 |
34.36 |
33.40 |
32.44 |
31.48 |
30.38 |
29.38 |
28.44 |
||
年代0 - 116 |
26.04 |
12.08 |
13.12 |
14.40 |
15.32 |
16.24 |
17.26 |
18.24 |
19.28 |
20.14 |
21.34 |
22.40 |
23.40 |
35.60 |
34.50 |
33.42 |
32.40 |
31.50 |
30.42 |
29.40 |
28.32 |
||
年代0 - 117 |
25.96 |
12.10 |
13.14 |
14.22 |
15.26 |
16.36 |
17.32 |
18.26 |
19.22 |
20.26 |
21.36 |
22.38 |
23.24 |
35.44 |
34.52 |
33.44 |
32.50 |
31.36 |
30.40 |
29.32 |
28.42 |
||
年代0 - 118 |
26.04 |
12.14 |
13.08 |
14.34 |
15.14 |
16.24 |
17.38 |
18.16 |
19.14 |
20.28 |
21.30 |
22.40 |
23.28 |
35.50 |
34.60 |
33.46 |
32.56 |
31.38 |
30.36 |
29.44 |
28.40 |
||
年代0 - 119 |
25.88 |
12.06 |
13.10 |
14.38 |
15.18 |
16.12 |
17.30 |
18.24 |
19.26 |
20.24 |
21.38 |
22.36 |
23.42 |
35.56 |
34.38 |
33.32 |
32.52 |
31.44 |
30.34 |
29.42 |
28.38 |
||
年代0 - 120. |
26-06 |
12.10 |
13.06 |
14.44 |
15.28 |
16.10 |
17.26 |
18.22 |
19.24 |
20.12 |
21.20 |
22.24 |
23.50 |
35.64 |
34.32 |
33.36 |
32.54 |
31.46 |
30.44 |
29.46 |
28.36 |
年代21 |
26.12 |
11.22 |
12.20 |
13.34 |
14.24 |
15.66 |
16.62 |
17.40 |
18.08 |
19.14 |
20.16 |
21.26 |
22.56 |
36.12 |
35.12 |
34.16 |
33.20 |
32.18 |
31.22 |
30.18 |
29.16 |
||
年代22 |
25.94 |
11.34 |
12.16 |
13.44 |
14.30 |
15.54 |
16.44 |
17.32 |
18.24 |
19.18 |
20.22 |
21.28 |
22.50 |
36.16 |
35.18 |
34.20 |
33.26 |
32.26 |
31.26 |
30.24 |
29.22 |
||
年代23. |
25.88 |
11.28 |
12.08 |
13.22 |
14.26 |
15.36 |
16.52 |
17.38 |
18.36 |
19.24 |
20.18 |
21.34 |
22.54 |
36.20 |
35.26 |
34.28 |
33.28 |
32.28 |
31.28 |
30.22 |
29.26 |
||
年代24 |
25.96 |
11.30 |
12.24 |
13.28 |
14.38 |
15.42 |
16.56 |
17.40 |
18.34 |
19.26 |
20.24 |
21.36 |
22.48 |
36.26 |
35.28 |
34.36 |
33.24 |
32.34 |
31.24 |
30.20 |
29.18 |
||
年代25 |
26.08 |
11.16 |
12.26 |
13.34 |
14.28 |
15.34 |
16.38 |
17.36 |
18.38 |
19.20 |
20.26 |
21.32 |
22.44 |
36.24 |
35.30 |
34.38 |
33.22 |
32.20 |
31.20 |
30.30 |
29.20 |
||
年代26 |
25.90 |
11.32 |
12.22 |
13.42 |
14.34 |
15.20 |
16.46 |
17.34 |
18.40 |
19.22 |
20.12 |
21.30 |
22.32 |
36.30 |
35.16 |
34.44 |
33.30 |
32.22 |
31.30 |
30.22 |
29.24 |
||
年代27 |
25.88 |
11.42 |
12.26 |
13.46 |
14.32 |
15.28 |
16.36 |
17.28 |
18.36 |
19.28 |
20.20 |
21.20 |
22.42 |
36.36 |
35.20 |
34.42 |
33.36 |
32.30 |
31.26 |
30.26 |
29.28 |
||
年代28 |
25.86 |
11.36 |
12.40 |
13.44 |
14.36 |
15.32 |
16.24 |
17.32 |
18.38 |
19.30 |
20.30 |
21.18 |
22.38 |
36.38 |
35.24 |
34.48 |
33.32 |
32.40 |
31.30 |
30.24 |
29.30 |
||
年代29 |
26.04 |
11.38 |
12.28 |
13.38 |
14.28 |
15.38 |
16.36 |
17.28 |
18.40 |
19.22 |
20.32 |
21.22 |
22.42 |
36.28 |
35.30 |
34.46 |
33.34 |
32.24 |
31.34 |
30.28 |
29.34 |
||
年代210 |
25.98 |
11.28 |
12.34 |
13.32 |
14.30 |
15.30 |
16.42 |
17.34 |
18.26 |
19.28 |
20.16 |
21.24 |
22.32 |
36.32 |
35.32 |
34.40 |
33.38 |
32.36 |
31.36 |
30.32 |
29.32 |
||
年代3.1 |
25.78 |
10.80 |
11.20 |
12.44 |
13.36 |
14.28 |
15.32 |
16.24 |
17.30 |
18.24 |
19.18 |
20.22 |
21.36 |
37.40 |
36.38 |
35.28 |
34.20 |
33.18 |
32.22 |
31.26 |
30.18 |
||
年代3.2 |
26.02 |
10.84 |
11.36 |
12.36 |
13.44 |
14.34 |
15.42 |
16.30 |
17.36 |
18.30 |
19.26 |
20.26 |
21.38 |
37.46 |
36.42 |
35.34 |
34.26 |
33.24 |
32.26 |
31.28 |
30.22 |
||
年代3.3. |
25.96 |
10.72 |
11.42 |
12.30 |
13.40 |
14.36 |
15.36 |
16.32 |
17.32 |
18.26 |
19.20 |
20.28 |
21.34 |
37.48 |
36.48 |
35.30 |
34.28 |
33.26 |
32.24 |
31.30 |
30.20 |
||
年代3.4 |
25.88 |
10.78 |
11.28 |
12.34 |
13.48 |
14.42 |
15.38 |
16.28 |
17.38 |
18.28 |
19.22 |
20.32 |
21.30 |
37.42 |
36.44 |
35.32 |
34.24 |
33.28 |
32.20 |
31.24 |
30.24 |
||
年代3.5 |
26.06 |
10.66 |
11.34 |
12.40 |
13.52 |
14.44 |
15.44 |
16.36 |
17.40 |
18.30 |
19.24 |
20.20 |
21.40 |
37.44 |
36.40 |
35.36 |
34.22 |
33.32 |
32.28 |
31.26 |
30.26 |
||
年代41 |
26.08 |
10.02 |
10.60 |
11.38 |
12.42 |
13.50 |
14.56 |
15.48 |
16.56 |
17.44 |
18.38 |
19.14 |
20.22 |
38.28 |
37.32 |
36.28 |
35.32 |
34.28 |
33.28 |
32.32 |
31.30 |
||
年代42 |
25.94 |
10.08 |
10.42 |
11.32 |
12.36 |
13.42 |
14.48 |
15.56 |
16.62 |
17.48 |
18.32 |
19.24 |
20.26 |
38.34 |
37.34 |
36.30 |
35.26 |
34.24 |
33.26 |
32.36 |
31.26 |
||
年代43. |
25.84 |
10.10 |
10.56 |
11.28 |
12.30 |
13.38 |
14.40 |
15.50 |
16.48 |
17.52 |
18.40 |
19.22 |
20.28 |
38.36 |
37.36 |
36.36 |
35.36 |
34.22 |
33.34 |
32.34 |
31.24 |
||
年代44 |
25.90 |
10.04 |
10.60 |
11.12 |
12.22 |
13.30 |
14.34 |
15.52 |
16.54 |
17.46 |
18.42 |
19.26 |
20.20 |
38.30 |
37.42 |
36.42 |
35.34 |
34.26 |
33.30 |
32.38 |
31.28 |
||
年代45 |
26.02 |
10.06 |
10.52 |
11.18 |
12.32 |
13.42 |
14.48 |
15.44 |
16.50 |
17.42 |
18.30 |
19.28 |
20.24 |
38.32 |
37.46 |
36.38 |
35.28 |
34.30 |
33.32 |
32.30 |
31.22 |
比较交叉点或(e值):测试miRNA值等于归一化标准表示表达相似,低于标准表示表达增加。
b无DNA加入反应(阴性对照)。所有反应进行三次,然后取平均值。18S rRNA是
规范化标准。
该表显示了保存在稳定RNA中的60个人的粪便中获得的表达值晚些时候(Invitrogen, Carlsbad, CA): 20个非癌对照
(n1至n20);10例大便伴腺瘤性息肉≥1cm (TNM分期0-1);2期TNM患者粪便10例213.10)结肠癌;5例患者大便伴TNM期3结肠
癌症的3.13.5);5例TNM期结肠癌患者的粪便(S4155).
表4。粪便样本中一些miRNAs CP值的标准差(SDs)按其递减的顺序排列
mir - 96 |
mir - 143 |
mir - 146 a |
mir - 214 |
miR-21 |
miR-9 |
miR-7 |
mir - 92 a |
miR-20a |
mir - 134 |
mir - 938 |
7.898177 |
7.295028 |
6.593613 |
6.550193 |
6.356752 |
6.042022 |
5.793815 |
5.623533 |
5.450223 |
5.288764 |
5.204872 |
mir - 222 |
mir - 138 |
mir - 127 - 5 - p |
miR-29b |
mir - 17 |
mir - 183 |
mir - 196 a |
18 srrna |
mir - 199 - a - 3 - p |
MiR - 106 |
- |
5.193460 |
4.789436 |
4.139903 |
3.804948 |
3.796239 |
0.612726 |
0.5513392 |
0.379780 |
0.144222 |
表5所示。miRNA标记物作为总RNA功能的数值基础。
病人# |
诊断 |
总RNA (µg/g粪便) |
CP * |
|
样本 |
集团 |
|||
2 |
健康的控制 |
0.28 |
25.99 |
|
5 |
健康的控制 |
0.30 |
27.21 |
|
8 |
健康的控制 |
0.29 |
25.96 |
26.05 |
14 |
健康的控制 |
0.31 |
25.09 |
|
17 |
健康的控制 |
0.32 |
26.01 |
|
56 |
IV期癌 |
0.31 |
20.18 |
|
57 |
IV期癌 |
0.32 |
22.03 |
|
58 |
IV期癌 |
0.31 |
22.43 |
21.90 |
59 |
IV期癌 |
0.30 |
||
60 |
IV期癌 |
0.31 |
*CP:在Roche LC 480聚合酶链式反应仪中通过算法计算的交叉点值。
表6所示。预测MicroRNA指数(PMI)
癌症病例 |
真阳性(TP) |
假阴性(FN) |
正常的课程 |
假阳性(FP) |
真阴性(TN) |
%灵敏度=TPx 100,%特异性=TNx 100
Tp + fn + fp + tn
图1所示。miRNA分子定量的实验工作流程。
图2。miRNA-199a-3p与归一化标准的多组比较图18岁在健康对照组和四个被研究的结肠癌组中,TNM阶段0到4。
图3。粪便样本的火山图显示组内方差最小,导致低p-使用2计算的值(dct)使用Qiagen公司的项目,治疗0- 1期结肠癌。
图4。用TaqMan茎环定量成熟miRNA的散点图®MGB探针qPCR人miRNA表达分析60例健康和结肠癌患者粪便样本中miRNA的表达。癌症的阶段由图中最下面一行表示。正常健康人20例,结肠癌患者40例(TNM期0 ~ 4期)。高表达的例子出现在右边,低表达的例子出现在左边。在Roche LightCycler®480 PCR仪上采用CP或E-method检测茎环RT-minor grove结合qPCR的表达。选择刻度,使最小值在面板左上角标记的“最小”标记上对齐。最大值也是如此,它在面板右上方标有“Max”的标记下排列。
图5。用TaqMan茎环定量成熟miRNA的散点图®MGB探针qPCR人血浆miRNA表达分析,用于TNM 0 ~ 3期。