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摘要

2019年12月底，人们发现了通过空气传播的、可能致命的SARS-CoV-2，它导致了COVID-19。到目前为止，包括疫苗、抗体或任何抗病毒药物都没有发现有效果。SARS-CoV-2与2003年发现的SARS-CoV-1非常相似，它们识别相同的宿主细胞受体进入细胞。中东呼吸综合征冠状病毒是2012年发现的另一种致命的HCoV，属于SARS (β型)的同一组，但识别进入宿主细胞的不同细胞受体。

所有这些病毒只能在高水平的生物安全条件下进行安全研究，以保护实验室工作人员和环境。然而，这些安全预防措施减缓了寻找COVID-19药物和疫苗的努力，因为许多科学家无法获得所需的生物安全设施。

还有四种更常见的人类冠状病毒，如HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-HKU1和HCoV-NL63，这些病毒在多年前就已为人所知。它们在人类中引起自限性呼吸道感染，如普通感冒，可以在BSL2实验室中安全地进行研究。

本文对SARS和普通感冒病毒进行了比较，以期寻找更好的替代物，用于BSL2实验室识别SARS - cov -2的发病机制和治疗干预。我们关注以下关键问题，如病毒-宿主细胞相互作用机制;差异细胞系敏感性;物种取向;病毒复制效率;抗原表达模式;细胞凋亡的机制途径;以及病毒的结构和功能关系。

关键字

SARS, NL-63, COVID-19，治疗，SARS - cov -2，抗病毒

简介

冠状病毒(CoVs)是冠状病毒科中一组不同的包膜正链RNA病毒[1,2]。冠状病毒已在包括哺乳动物和鸟类在内的多种宿主中被确认，并已证明可导致多种呼吸道和肠道疾病[1,3,4]。四种冠状病毒从很久以前就在人群中持续传播，引起普通感冒，它们是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-NL63[5-8]。

HCoV-OC43、HCoV-229E和HCoV-NL63的季节性倾向于以冬季为主[9-15]，但在香港，HCoV-NL63呈春夏活动高峰，也为[16]。直到最近，人们普遍认为，除SARS-CoV外，已知的人类冠状病毒(hcov)主要导致轻度上呼吸道感染(URTIs)[9]。因此，没有对hcov的传播进行监测，也没有尝试开发针对这些病毒的疫苗或药物。

2003年，中国南方爆发了一种非典型肺炎——严重急性呼吸综合征(SARS)，导致SARS冠状病毒被发现为病原[17-20]。自SARS爆发以来，全球已有800多人(约10%)死亡[21]。SARS-CoV感染患者出现弥漫性肺泡损伤，有可能进展为急性呼吸窘迫综合征并最终死亡[22]。

近10年后，另一种此前不为人知的冠状病毒——中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)于2012年在阿拉伯半岛开始引发了一场新的流行病[23-25]。MERS感染可导致急性肺炎和肾功能衰竭，住院患者死亡率高达50%[26,27]。就在最近的2019年12月下旬，另一种高传染性的冠状病毒(SARS-CoV-2)被确认，截至2020年9月27日，该病毒迄今感染了全球3200万人，造成约100万人死亡。（https://www.worldometers.info/coronavirus/?utm_campaign=homeAdvegas1）.我们还没有针对这种病毒的任何抗病毒药物或疫苗来预防COVID-19。

我们试图将低致病性普通感冒病毒与高致病性SARS病毒进行比较，找出两者在细胞内感染和复制机制上的异同。这将帮助我们找到一种更好、更安全的替代病毒，在BSL-2型实验室中工作。

SARS与普通感冒病毒的比较

分类:冠状病毒是感染人类和动物的ssRNA病毒。根据基因组序列，将这7种新型冠状病毒进一步分为冠状病毒属(HCoV-229E和HCoV-NL63)和冠状病毒属(HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV-1、MERS-CoV和SARS-CoV-2)[24,28]。

人畜共患病:据信，人类出现冠状病毒感染始于动物宿主的人畜共患传播[21]。例如，在牛冠状病毒和HCoV-OC43之间显示出高度的基因组序列相似性，这表明存在动物-人传播[23,29]。在人类SARS- cov病例中，发现超过95%的基因组序列与蝙蝠冠状病毒相同，这表明蝙蝠可能是SARS病毒的人畜共患病源。

宿主细胞受体识别:血管紧张素转化酶2是SARS- cov -1和SARS- cov -2的细胞受体[30-33]，而MERS-CoV虽然属于SARS的同一类群(β型)，但识别二肽基肽酶4 (DPP4)而不是ACE-2受体[34]。另外两种α型冠状病毒HCoV-OC43和HCoV-HKU的细胞受体尚未得到证实，但被认为是9- o乙酰化唾液酸[31,35]。

HCoV-229E和HCoV-NL63均属于第1组(α型)冠状病毒，但前者以氨基肽酶N (CD13)为细胞受体[36,37]（HCoV-NL63)利用像SARS-CoV一样的ACE2受体感染[34]细胞。表1比较了普通感冒病毒和其他引起严重急性呼吸综合征的病毒(SARS)的一些特性。

表1。人类冠状病毒和它的不同类型[38]

在上述三种高致病性冠状病毒中，SARS-CoV-1和SARS-CoV-2在系统发育上比MERS-CoV[41]更加相似。两种sars冠状病毒都包含所有RNA病毒中最大的基因组[18]。SARS-CoV-2和SARS-CoV-1的基因组序列在核苷酸水平上具有极高的同源性，都需要高度特异性的实验室对这些病毒进行进一步研究。

因此，我们在这里重点研究了NL-63，一种低致病性的普通感冒病毒，并允许在BSL2实验室工作来研究SARS，因为它们共享相同的受体分子(ACE2)。

识别HCoV-NL63

2003年1月，一名7个月大的儿童因鼻炎、结膜炎和发烧出现在阿姆斯特丹一家医院。胸片显示毛细支气管炎的典型特征，发病5天后采集鼻咽抽吸标本(样本NL63)。所有已知呼吸道病毒的诊断检测均为阴性。临床标本接种于猴三级肾细胞(tMK;观察到细胞病变效应。感染因子随后可传代到LLC-MK2细胞(猴肾细胞系)上，最终被鉴定为一种新型冠状病毒，命名为NL-63[5]。最初的PCR产物显示与冠状病毒科成员的基因组序列相似，完整的基因组序列显示该病毒不是重组病毒，而是I组冠状病毒的新成员[42,43](图1)。

图1所示。人类冠状病毒基因组组织的比较示意图。HCoV-NL63:人冠状病毒HCoV-NL63 (NC_005831);HCoV-229E:人冠状病毒229E (NC_002645);SARS-CoV:严重急性呼吸综合征冠状病毒(NC_004718);HKU1- cov:人冠状病毒HKU1 (NC_006577);HCoV-OC43:人冠状病毒OC43 (NC_005147)。ORFs S(1)、E(2)、M(3)和N(4)表示，辅助基因编码的开放阅读框为灰色。[6、7]。Dijkman R, Jebbink MF, Wilbrink B，等。人类冠状病毒229E在刺突和包膜基因之间编码一个单一的ORF4蛋白。 Virol J 2006; 3: 106; Abdul-Rasool and Fielding. The Open Virology Journal, 2010, 4, 76-84]

呼吸的临床研究

科学和临床证据表明，HCoV-NL63感染上呼吸道和下呼吸道[44]，引起与HCoV-229E和HCoV-OC43相似的症状。

非呼吸道的临床研究: HCoV-NL63感染以前与胃肠道发现有关[32,33,45-47]。然而，这并不是HCoV-NL63感染所独有的，因为SARS-CoV和HCoV-HKU1 RNA此前已在患者腹泻样本中检测到[48,49]。然而，这些表现似乎是病毒侵入肠黏膜[10]的直接后果。

冠状病毒的受体介导细胞进入

冠状病毒通过刺突蛋白与细胞受体结合，介导特定靶细胞的感染。HCoV-NL63的刺突蛋白是一类融合蛋白，类似于流感病毒的血凝素和HIV-1的Env糖蛋白gp120/gp41。刺突蛋白的氨基末端部分(S1)包含受体结合域，羧基末端部分(S2)包含跨膜区。S1结构域介导最初与细胞受体的高亲和力结合[50- 53]，而c端S2结构域介导病毒和细胞膜的融合。冠状病毒融合肽位于S2[54]内部。

在发现HCoV-NL63之前，人们普遍认为所有I组冠状病毒都使用CD13(也称为氨基肽酶N)作为受体，正如HCoV-229E所描述的那样。出乎意料的是，HCoV-NL63不能使用CD13作为细胞进入[34]的受体，而是异常地使用ACE-2受体。此外，该病毒在猴肾细胞中复制[5,14]，而其近亲HCoV-229E则不能。

有趣的是，SARS-CoV来自不同的冠状病毒群(IIβ群)，也能够在猴子肾细胞[5]中复制。hu -7和293T细胞表达SARS-CoV受体ACE2[31,44,49,55]，因此允许NL63-和SARS-CoV- s驱动的感染;而CEMx174、HeLa和HOS细胞则不允许[44,56,57];不表达ACE2[44,49]。

此外，针对ACE1外结构域的纯化抗体不调节携带229E-、NL63-或SARS-CoV-S[34]伪型对hu -7细胞的感染。相比之下，针对ACE2外结构域的纯化抗体或含有可溶性ACE2外结构域的假病毒粒子预孵卵能有效阻止由NL63-和SARS-CoV-驱动的感染，但不能阻止229E-S蛋白，这表明NL63- s利用ACE2进入感染细胞。此外，CD13使293T细胞对HCoV-229E S蛋白驱动的感染高度允许，但对HCoV-NL63或SARS-CoV不允许。所有这些信息都证实，尽管229E-和NL63-S蛋白之间有相似之处，但后者在进入细胞的过程中与ACE2结合，而不是像229-E那样与CD13结合。

利用NL63-和SARS-CoV-S的可溶性S1结构域进行FACS分析，发现NL63-S1与表达ACE2的细胞结合，而不是空载体，表明ACE2和NL63- s蛋白直接相互作用。值得注意的是，SARS-CoV-S与表达ACE2的细胞结合比NL63-S更有效，这可能表明其结合亲和力更高。简而言之，这些数据和共享的细胞趋向性提示HCoV-NL63和SARS-CoV[31]使用共享的受体(ACE2)。这种ACE2表面分子定位于人类鼻腔和气管支气管气道上皮细胞的纤毛细胞，因此支持病毒感染在上呼吸道[35]的存在。

HCoV-NL63的致病性降低表明，病毒结合ACE2并不是决定病毒致病性严重程度的唯一因素。为了了解SARS-CoV与HCoV-NL63在肺部致病性上的差异，有必要对该课题进行进一步研究，特别是在HCoV-NL63感染过程中ACE2表达的调控。

受体的接合由n端S1亚基决定;因此，动物和人类冠状病毒具有相同的功能组织，特别是S1亚基的氨基酸序列不同，导致与特定细胞受体相互作用。然而，表达SARS-CoV受体蛋白ACE2的细胞易受NL63-S驱动的感染[14]。

这是出乎意料的，因为NL63-S与SARS-CoV的整个S1亚基或SARS-CoV- s[15]中已经确定的ACE2相互作用域都没有显著的同源性，这表明这两种蛋白质要么形成了一个共同的三维结构，允许ACE2以类似的方式参与，要么两种s蛋白进化出不同的策略来靶向ACE2。

ACE2与NL63-S直接相互作用：NL63-S与ACE2之间的相互作用具有特异性。与NL63-S密切相关的ACE1蛋白不与NL63-S发生反应，另一方面，ACE2不能介导229e - s介导的感染，这表明ACE2在I类冠状病毒进入过程中并不是与fAPN功能相当的蛋白。

HCoV-NL63入口对ACE2的某些变化很敏感，这些变化干扰或邻近SARS-CoV入口的关键残基。此外，SARS-CoV RBD可以抑制HCoV-NL63 s蛋白介导的感染[39]。这些信息表明SARS-CoV和HCoV-NL63在ACE2上的结合位点重叠。相比之下，Hoffman等人使用另一组ACE2变体初步得出结论，这些病毒(SARS-CoV和HCoV-NL63)具有不同的结合位点，因为它们没有识别干扰其进入[58]的变体。

hCoV-NL63-S1缺失突变体和hCoVNL63-229E-S嵌合突变体的分析：为了确定NL63 s1蛋白中的哪个区域负责靶向ACE2，我们对一组n端s1缺失突变体进行了分析，表明hCoV-229E-S蛋白的中心区域和可能的NL63- s蛋白可能决定了c端受体结合域的正确折叠或方向，就像之前对hCoV-229E-S蛋白所提出的那样［53, 59]。

综上所述，需要对NL63-S1进行详细的点突变，以识别ACE2相互作用中具有关键功能的残基。

pH-dependent细胞条目:冠状病毒进入宿主细胞的内化要么通过直接与质膜融合，要么通过内吞作用和随后与内体膜融合发生。使用后一种途径进入的病毒可以被降低内体pH值的溶酶作用剂(如巴菲霉素A、氯喹和NH)抑制₄Cl。

用巴菲霉素A或NH治疗hu -7细胞₄Cl发现NL63-S蛋白驱动的进入依赖于细胞内囊泡[34]的低ph环境。对于HCoV-229E感染和SARS-CoV-S介导感染也有同样的描述[60,44,56]。然而，也有一个相反的结果，即NL63-S介导的表达ACE2的hek293t细胞感染不受NH的影响₄Cl[61]。

组织蛋白酶有助于病毒感染：组织蛋白酶是一组不同的内体和溶酶体蛋白酶，包括天冬氨酸、丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶，具有内肽酶和外肽酶活性[62]。组织蛋白酶在呼肠孤病毒感染中的作用已被证实[63-67]。在受体介导的内吞作用后，呼肠病毒粒子通过组织蛋白酶B、L或s介导的部分蛋白水解转化为感染性亚病毒粒子，其中一种或多种酶降解呼肠病毒外衣壳蛋白σ3，暴露出底层的蛋白µ1，从而介导内体膜的穿透[68-70]。这表明，两种利用共同受体的冠状病毒通过不同的机制进入细胞。

由于组织蛋白酶抑制剂可以发生交叉反应，因此进行了一项研究，以找出表达人类ACE2的293T细胞中外源性组织蛋白酶B、L和S的表达的后果。外源性组织蛋白酶L显著增加SARS/MLV感染，但对NL63/MLV和VSV-G/MLV无影响。同样，外源性组织蛋白酶S也适度增强SARS/MLV感染，但令人惊讶的是，抑制NL63/MLV感染。这表明，过表达的组织蛋白酶S(在中性pH下分泌并活跃)可以消化和灭活hcov - nl63s蛋白，但不能消化和灭活SARS-CoV蛋白。

总的来说，这些数据表明，将组织蛋白酶L引入该酶限制或缺失的细胞可以显著促进由SARS-CoV介导的感染，而不是HCoV-NL63 S蛋白[71](表2)。组织蛋白酶S似乎对SARS-CoV感染也有一定贡献，并可能部分补偿某些细胞中组织蛋白酶L的缺失[71]。其他细胞蛋白酶是否通过类似于组织蛋白酶L在SARS-CoV感染中所起作用的机制促进HCoV-NL63感染，或者HCoV-NL63是否像HIV-1和VSV一样独立于靶细胞蛋白酶感染细胞，仍有待研究。

表2。SARS冠状病毒(非NL63)利用组织蛋白酶L感染ACE2表达细胞[71]

NL-63和SARS-CoV:刺突蛋白对ACE2的差异向下调控

多项证据表明，ACE2在SARS-CoV传播中起着关键作用:(i) ACE2在细胞系中的表达与SARS-CoV刺突蛋白(SARS-S)驱动进入的易感性相关[34,49]，(ii)在小鼠中敲除ACE2可取消对SARS-CoV感染[30]的允许性。

值得注意的是，最近有人提出，与SARS-CoV结合而不是NL63与ACE2结合会诱导ACE2从细胞表面脱落，有证据表明，这一过程是细胞吸收SARS-CoV所必需的[72]。ACE2的脱落是否真的是感染进入的先决条件，并有助于先前观察到的SARS-S对ACE2的下调，仍有待确定。

此外，目前尚不清楚SARS-S和NL63-S是否对ACE2表达有差异干扰，这可能导致了这两种病毒的致病性差异。酶联免疫吸附试验(ELISA)形式的结合研究显示，SARS-S对重组ACE2的捕获效率很高，而ACE2与NL63-S的结合几乎检测不到。最后，重组SARS-S的ace2转染细胞的预孵卵可以阻断SARS-S和NL63-S伪病毒的后续感染，而重组NL63-S的抑制作用则不那么明显。综上所述，这说明SARS-S与ACE2结合的效率高于NL63-S[31,73]。

由于复制效率的差异，不可能对SARS-CoV和nl63感染的培养物中ACE2下调的直接比较。然而，可以推测，与SARS-CoV相比，NL63相对低效的ACE2参与可能导致复制减少和ACE2向下调制。然而，ACE2脱落只是SARS-CoV和NL63感染的副产物，并不是感染进入所必需的。

晶体结构

NL63和SARS-CoV受体结合域与宿主细胞受体复合物:NL63-CoV和SARS-CoV在RBD核和rbm中无结构同源性;然而，这两种病毒识别共同的ACE2区域，很大程度上是因为ACE2上有一个“病毒结合热点”。在I类冠状病毒中，RBD核心是保守的，但rbm是可变的，这解释了这些病毒如何识别不同的受体。这些结果为理解病毒进化和病毒-受体相互作用提供了结构性基础。

病毒学中一个尚未解决的基本难题是病毒如何进化到能够识别它们的受体蛋白[74]。具体来说，不同的病毒如何识别相同的受体蛋白，以及相似的病毒如何识别不同的受体蛋白?

到目前为止，SARS-CoV RBD与ACE2复合物的晶体结构是任何冠状病毒S1中唯一可用的原子结构[75]。SARS-CoV RBD包含两个子结构域，一个核心和一个受体结合基序(RBM)，只与ACE2接触。ACE2含有一个爪状肽酶结构域，活性位点周围有2个裂片。SARS-CoV结合到ACE2肽酶结构域n端叶的外表面。I类冠状病毒S1的结构信息一直缺乏，无论是单独的还是与其受体复合的。

最重要的问题是，尽管NL63-CoV和SARS-CoV在S1亚基上没有明显的序列同源性，但它们是如何同时使用ACE2作为受体的呢?一种假设是，NL63-CoV和SARS-CoV共享同源RBM，通过RNA重组，SARS-CoV从NL63-CoV或NL63-CoV相关的I族冠状病毒获得RBM，获得对ACE2的结合亲和力和对人类细胞的感染性[39,76]。最近的晶体结构分析显示，在RBD核和rbm中缺乏结构同源性，表明NL63-CoV和SARS-CoV识别共同受体蛋白的两种独立方式[77]。

ACE2上常见的病毒绑定热点：ACE2上的病毒结合热点位于nl63 - cov受体界面的中心。在未结合ACE2的结构中，Lys-353投射成解[78]。在NL63-CoV结合后，Lys-353嵌入疏水通道中，周围是ACE2 Tyr-41和NL63-CoV Tyr-498的2个芳香环和ACE2 Asp-37和NL63-CoV Ser-535的2个烷基链[77]。在隧道的末端，ACE2 Asp-38与Lys-353形成盐桥，中和其电荷。由于疏水环境，这种盐桥在能量上是稳定的[78]，对病毒-受体相互作用至关重要。Lys- 353的丙氨酸取代或任何其他涉及热点结构的残基取消了NL63-CoV的结合[79]。ACE2上相同的病毒结合热点也是SARS-CoV结合的关键。两个不同病毒受体界面上的热点结构惊人地相似[77]。受体部分几乎相同，蛋白侧链构象有细微变化。在病毒部分，SARS-CoV上的Thr-487和Tyr-491分别取代NL63-CoV上的Ser-535和Tyr-498，成为4个隧道壁中的2个。适应ACE2上的热点对SARS-CoV的发病机制至关重要。

因此，受体蛋白上的病毒结合热点可能决定了病毒-受体的相互作用、病毒的发病机制和病毒的传播能力，因此是病毒潜在的主要结合靶点。

ACE2与NL63和SARS的结合特征

ACE2在这个位置含有一种天冬氨酸，而大多数动物，包括人、大鼠、小鼠、猫和狗的ACE2表达一种甘氨酸[80,81]。同样，SARS-CoV、HCoV-NL63 S1-Ig(301-749)不能有效结合大鼠ACE2，但与棕榈果子狸D354G型ACE2的结合效率高于人类ACE2。然而，与SARS-CoV S1形成鲜明对比的是，HCoV-NL63 S1- ig(301-749)在354残基处没有与棕榈果子狸ACE2与天然天冬氨酸结合。因此，甘氨酸354附近的残基可能与HCoV-NL63的关联有关。

进一步，引入大鼠ACE2的糖基化区域(残基82-84;表示为MYP/NFS)进入人类蛋白中，适度减少SARS-CoV S1的结合[81]。这种修改同样减少了HCoV-NL63 S1结合。HCoV-NL63 S蛋白再次遵循相同的模式。然而，在人ACE2残基354中引入一种天冬氨酸对SARS-CoV S1的关联只有中等程度的影响，而它完全取消了与HCoV-NL63 S1的关联。因此，残渣354调节HCoV-NL63 s蛋白与人类和棕榈果子狸ACE2的关联。这些人类ACE2变体结合HCoV-NL63和SARS-CoV S1的能力反映在它们支持由这些病毒的S蛋白介导的感染的能力[81]。结合SARS-CoV S1结构域效率较低的几种变体也较低地结合HCoV-NL63 S1- ig[81]。

总的来说，这些数据表明SARS-CoV和HCoV-NL63 S1结构域结合了ACE2的大部分重叠区域。此外，SARS-CoV RBD抑制由SARS-CoV和HCoV-NL63 S蛋白介导的感染[77]。

复制nl - 63

冠状病毒利用翻译后蛋白水解处理作为其复制蛋白表达的关键调控机制。HCoV-NL63 1a和1ab多蛋白可能被病毒蛋白酶裂解，以促进负责病毒复制和转录的多亚基蛋白质复合体的组装。据预测，HCoV-NL63的基因组在1a多蛋白的50区编码两种蛋白酶[82]。首先，木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)由位于基因组5 '端附近的非结构蛋白(nsp) 3基因表达。这种假定的HCoV-NL63的类木瓜蛋白酶由PL1pro和PL2pro两个结构域组成，预计这两个结构域都具有催化活性。

据预测，该酶可以在nsp1|nsp2、nsp2|nsp3和nsp3|nsp4之间的三个位点切割1a/1b蛋白，通过自动切割释放功能性木瓜蛋白酶样蛋白酶蛋白(nsp3)分子。对PLpro的预测切割位点的分析表明，这种HCoV-NL63酶具有在两个具有短不带电侧链的小氨基酸之间切割的专一性，与其他冠状病毒中的同源酶类似[83]。

治疗方面

抗病毒药物:已知几种抑制剂至少可以减少包括HCoV-NL63在内的部分冠状病毒的复制[84,85]。这些抑制剂作用于冠状病毒复制周期的各个步骤，如受体结合、膜融合、转录和翻译后处理。一种有趣的HCoV-NL63抑制剂是静脉注射免疫球蛋白[83]，它已经被食品和药物管理局批准为静脉注射药物。静脉注射免疫球蛋白已成功用于治疗多种疾病，主要是原发性免疫缺陷和自身免疫性神经肌肉疾病，但也用于治疗呼吸道疾病(如呼吸道合胞病毒)[86]和川崎病[84]。

病毒复制的抑制也可以发生在病毒和细胞膜融合的水平。HCoV-NL63的刺突包含两个七聚重复区HR1和HR2，位于刺突蛋白靠近跨膜结构域的S2部分。病毒与受体结合后，构象变化导致包含三个hr1和三个hr2的六螺旋束的形成，随后融合肽的暴露介导了病毒和宿主细胞之间的膜融合。对于逆转录病毒、副粘病毒和冠状病毒[85,87]，来自HR2结构域的多肽可以抑制病毒感染，很可能是通过与HR1相互作用。因此，该肽阻断了HR1-HR2天然相互作用的形成，防止了膜融合，从而减少了感染。

另一种抑制复制的新方法是RNA干扰(RNAi)[88]。Pyrc等人(2006a)探索了靶向HCoV-NL63的小干扰RNA (siRNA)的抗病毒潜力[85]。在细胞培养感染中分析了两个靶向刺突蛋白基因保守序列的sirna的抑制特性。将相对少量的siRNA转染hcov - nl63易感细胞，使其对病毒感染具有抵抗力。

HCoV-NL63也可以在转录水平上被嘧啶核苷类似物抑制:α- d - n4 -羟基胞苷和6-氮杂吡啶[85]:这些药物抑制HCoV-NL63转录的确切机制尚不清楚。一般来说，蛋白酶抑制剂在翻译后处理水平起作用。冠状病毒的Mpro具有高度保守的底物识别口袋，从而为设计针对多种冠状病毒的广谱抗病毒药物提供了机会。一种有效的抑制剂N3对多种Mpro酶具有广谱抑制作用，包括HCoV-NL63编码的Mpro酶[89]。通过与来自其他人类冠状病毒(包括致命的SARSCoV和MERS-CoV)及其相关人畜共患冠状病毒的Mpro的比较研究，HCoV-NL63 Mpro结构可能为合理开发广谱抗病毒治疗药物治疗人类冠状病毒引起的感染提供关键见解．

讨论

羧基肽酶ACE2是肾素-血管紧张素系统的重要组成部分，控制血压[90,91]。ACE2在肺和肠中的表达解释了SARS-CoV向性[13]的重要方面，该蛋白可能在SARS-CoV传播中发挥核心作用[80]。

SARS-CoV和NL63虽然分别属于不同的类群β型和α型，但使用相同的宿主细胞受体ACE-2。然而，进入的结果是截然不同的。SARS-CoV病例中出现严重呼吸窘迫，但NL63患者通常只出现轻微呼吸道感染。使用完整的重组系统，发现NL63 S蛋白与ACE-2的相互作用比SARS-CoV S蛋白弱，尽管接触所需的残基相似。研究还证实，NL63 S的ace -2结合位点位于190和739残基之间，是一个亲和力较低的结合位点，这可能解释了SARS-CoV感染与NL63不同的病理后果[5,18,20,31,92,93]。

此外，病毒介导的ACE-2下调调控被认为是SARS-CoV感染的基础病理[30,94]，但目前尚不清楚为什么NL63不应该是这样。与ACE-2接触后，两种病毒的细胞内化途径似乎也不同。SARS-CoV需要溶酶体半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶L的存在来感染易感细胞，而NL63不需要这样的要求[71]。

目前尚不清楚组织蛋白酶L是如何促进SARS-CoV感染的。存在几种兼容的可能性。Cathepsin L可能非特异性地降解SARS-CoV S蛋白的S1结构域，从而允许融合所需的S2结构域的构象转变。ACE2也可能是组织蛋白酶的靶点，从而促进其与S蛋白的解离。成熟内皮细胞中组织蛋白酶L的低表达可限制SARS-CoV感染[95]。研究确定HCoV-NL63是否更有效地感染这些细胞在活的有机体内比SARS-CoV更有根据。

以上信息表明，虽然两种病毒都利用ACE-2作为受体，但受体结合的后果是不同的，尽管其原因尚不清楚。Li等人(2007年)表明，一种RBD的标记形式与表达许多天然和合成ACE-2变体的细胞系孵育表明，ACE-2接触残基对结合SARS-CoV和NL63 S至关重要，与[39]重叠。

这两种病毒的结合位点与酶的活性位点不同[77,96]，这与MLN-4760(一种有效的ACE-2抑制剂)处理含有ACE-2的细胞对S-RBD相互作用或病毒进入没有影响的事实相一致[97]。Marzi et al.(2004)的研究表明，SARS-CoV和NL63-S蛋白的可溶性形式都与可溶性ACE-2结合在体外具有本质上不同的亲和性[98]。他们还证实，ACE-2残基对SARS-CoV S的结合至关重要，也可以消除NL63 S的结合，而且NL63 S的结合不涉及其独特的氨基末端序列。ACE-2的分泌形式与绿色荧光蛋白(GFP)融合，提供一个配体和一个替代标记，用于检测配体结合，揭示了冠状病毒S蛋白与ACE-2结合的统一格式。SARS-CoV S和S1蛋白均能有效地抑制ACE-2，而nl63s蛋白按体重计算可减少10- 100倍的抑制ACE-2。因此，ACE-2与不同CoV-S蛋白相互作用亲和力的差异与检测格式无关，可能是感染不同病理结果的基础。

ACE-2相互作用在NL63 S、NL63 S15-739和NL63 S196-739上很明显，但在NL63 S15-195上不明显(下标数字表示每个片段中包含的残基)，证实了NL63唯一的180残基氨基端不与ACE-2结合[58,39]。Li等(2007)表明NL63 S和SARS-CoV S结合了一个重叠的ACE-2序列[39]。然而，本研究表明ACE-2残基353的作用明显不同。此外，与过量ACE-2 - gfp的感染细胞孵育后，SARS-CoV与NL63 S1[39]之间的ACE-2结合差异为2 - 3倍。

由此可见，SARS-CoV S蛋白对ACE-2的亲和力明显高于NL63 S蛋白，但多价性部分减小了差异的因素。我们推测，虽然NL63可以像SARS-CoV一样有效地使用ACE-2作为病毒进入的受体，但与ACE-2结合下游事件的结合结果可能不同。

此外，研究还证实，SARS-CoV S结合的关键ACE-2残基也参与了NL63的结合，但个别残基的贡献可能不同，例如这里的K353A。这将与S蛋白和受体之间的分子接触有关，这已被描述为SARS-CoV，但在NL63中仍不清楚[75]，尽管已识别出对接触至关重要的残基[79]。

目前尚不清楚ACE-2信号是否与SARS-CoV和NL63 S蛋白结合有关，以及这是否与感染的病理有关。研究病毒S蛋白参与ACE2的模式是否影响病毒复制和发病机制将是特别有趣的。建立HCoV-NL63复制的逆向遗传系统和动物模型是这些研究的必要条件。

圣路易斯华盛顿大学医学院的研究人员通过将一种温和病毒的一个基因与新冠病毒的一个基因交换，对其进行了基因改造，从而开发出了一种杂交病毒。由此产生的混合病毒感染细胞，并像SARS-CoV-2一样被抗体识别，但可以在普通实验室安全条件下处理。然而，这种安全模型病毒缺乏其他基因，这些基因应该解释它们的致病性和/或抗病毒疗法。

NL63和SARS-CoV-S与ACE2相互作用的表征也可能对抑制剂的开发具有重要意义，因为S-ACE2界面是治疗干预的主要靶点。最后，HCoV-NL63和SARS-CoV复制之间的明显相似之处以及HCoV-NL63在人类中的频繁感染表明，致病性hcov可以进化，这凸显出针对hcov的有效疫苗的必要性。

结论

位于圣路易斯的华盛顿大学医学院的研究人员通过将一种温和病毒的一个基因与一种来自SARS-CoV-2的基因交换，对其进行了基因改造，从而开发出了一种杂交病毒[99]。由此产生的混合病毒感染细胞，并像SARS-CoV-2一样被抗体识别，但可以在普通实验室安全条件下处理。然而，这种安全模型病毒缺乏其他基因，这些基因应该解释它们的致病性和/或抗病毒疗法。

在1981年和1988年采集的样本中检测到HCoV-NL63，表明该病毒长期在人群中传播并引起疾病。在1.0-9.3%的儿童、老年人和免疫功能低下者中，HCoV-NL63可导致下呼吸道感染和泌尿道炎，症状从轻到重不等。

目前的数据清楚地表明，HCoV-NL63在临床上比以前怀疑的更重要，因为它共享相同的细胞受体ACE-2，类似于大多数致病性bsl -2不兼容的SARS病毒。NL-63和SARS在宿主细胞进入机制和致病性方面的一些相似和不同之处，可能为寻找最致命的SARS病毒的适当治疗方法开辟新的策略。

的利益冲突

作者声明没有竞争利益。

致谢

这项工作得到了Nanoviricides (Shelton, CT, USA)机构拨款的支持。两位作者贡献相同，同时也感谢所有同事在稿件准备过程中给予我们的帮助。

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