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摘要

背景:近二十年来，试管婴儿行业一直试图通过促进单胚胎移植来减少高顺序多胎妊娠。虽然胚胎培养实践同时有所改善，但在确定移植胚胎数量并仍能优化妊娠成功率时，预后差的患者和高龄产妇(≥38岁)被证明是具有挑战性的病例。直到囊胚植入前遗传学筛查(PGS)与保守的胚胎移植决定相结合，才在世界范围内取得进展。本研究的目的是确定老年患者(年龄≥38岁)进行玻璃化加热整倍体ET周期时单胚胎移植(SET)与双胚胎移植(DET)的疗效。

方法与发现:回顾性队列分析对140例玻璃化加热整倍体囊胚移植患者(≥38岁)进行SET (n=122)或DET (n=18)。在第5、6或7天对所有囊胚进行活检，并用NGS或aCGH分析滋养外胚层样本。所有转院均为2013年1月至2015年6月患者在PGS后的首次转院尝试。采用卡方分析对每次ET治疗的着床和活产结果进行评价和比较(p<0.05)。患者平均年龄39.7岁，临床妊娠率83%(116/140)，活产率80%(112/140)。SET组活产率为79.5%(97/122)，与DET组相似(15/18,83.3%)。虽然妊娠结局比较在不同年龄组或治疗方法之间没有差异，但观察到SET植入率升高的趋势(p<0.10)。最重要的是，DET组的双胞胎率明显高于SET组的1%(1/97)，为73% (11/15)(p<0.001)。

结论:当使用整倍体囊胚时，我们认为SET应作为使用PGS的诊所的护理标准。对于高龄患者的首次ET尝试尤其如此，以优化着床率并减少宝贵的整倍体胚胎的潜在浪费。

关键字

胚泡，着床前遗传筛选，单胚胎移植，整倍体

介绍

今天的人类辅助生殖技术(ART)行业努力提高活产率，同时减少多胎妊娠的发生。反过来，目前的临床重点是如何最好地为夫妇提供只移植一个胚胎的选择，以减少多胎妊娠的机会。高顺序多胎妊娠，包括双胞胎，与妊娠并发症增加和许多围产期风险相关[1,2]，尤其是高龄产妇(≥38岁)。许多研究都提倡选择性单胚胎移植(eSET)，因为它可以减少90-95%的多胎妊娠[3-5]。虽然一些项目使用eSET降低了20%至40%的活产率[3]，但其他使用改进胚胎培养方法的研究表明，对保守的ET方法没有影响[6,7]。因此，许多文献认为只有在最佳人群中才支持SET[8]，例如年龄<35岁且具有>2个优质胚泡用于ET的患者[9]。Fujimoto及其同事[7]最近报道，eSET实际上提高了37岁以下患者的活产率，但对年龄较大的患者没有提高。也有报道称，玻璃化-全ET周期可以通过将胚胎移植到一个更同步的孕酮受体子宫环境中来改善妊娠结局[10]。

考虑到目前胚胎筛选技术的发展趋势，胚胎选择已成为一个重要的问题。主观形态学分级是判断胚胎质量的普遍标准[11]，但仅凭形态学判断，限制了我们选择高着床成功率胚胎的能力[12]。其他使用延时成像(TLI)的最新发展显示出改善选择过程的希望[13]。然而，后一种方法，形态分级和TLI，并不能高度预测囊胚产生后的遗传正常。应用植入前遗传筛查(PGS)，结合基因组阵列技术，在移植前确认胚胎整倍体状态，已被证明是胚胎选择的一种非常有效的方法[14,15]。囊胚活检/PGS的临床应用减少了自然流产和多胎妊娠，总体上提高了活产率[5,14-16]。事实上，现在已经证明囊胚的质量分级(>一般到良好质量;3BB或更高)与整倍性的可预测性无关[17]。

在2017年之前，美国生殖医学学会的ET指南建议高龄产妇移植2或3个囊胚。卵巢储备的减少和非整倍体率的增加通常限制了每个周期产生的可存活胚胎的数量。问题在于知道哪些胚胎(如果有的话)基因正常。虽然多胚胎移植增加了活产成功率[4,6]，但在妊娠风险较高的人群中，确实存在多胎妊娠的风险。本研究的目的是确定在接受IVF/PGS治疗的老年IVF患者群体中移植整倍体胚胎的适当数量。

材料与方法

胚胎培养，分级，活检和PGS

使用MCO-5M迷你三洋/松下三气恒温箱(5% 02/5.3 - 6.0% CO)₂)在潮湿的空气条件下(37°C)，我们每25 μL滴Global™培养基(LG;Life Global, Guilford, CT)在Ovoil™(Vitrolife, Englewood, CO .)下补充7.5%合成蛋白补充剂，直到囊胚活检[17,18]。取卵后2-6小时评估所有卵母细胞的成熟度并进行ICSI。胚胎在第3天进行初步评估;采用1480 nm二极管激光器(Zilos-tk™;Hamilton Thorne, Beverly, MA)，胚胎孵育持续到第5,6天，可能到第7天进行评估和活检确定[5,18]。第3天形成的带开口允许滋养外胚层(TE)通过带上10-12 μm的沟提前破裂。采用改良的Gardner评分法对囊胚进行活检分级[11]。修改是必要的，以考虑过早孵化:3级= < 10% TE挤压(完整囊胚)，4级= 10% - 50% TE挤压(膨大囊胚)，5级≥50% TE挤压(孵化囊胚)[5,18]。内细胞团块(ICM)和TE分别从高质量的“A”到一般质量的“B”和差质量的“C”进行独立评分，其中ICM的第一个字母分配给ICM, TE的第二个字母分配给ICM。 A grade of 3BB or better was required to initiate biopsy. All residual developing embryos were allowed to continue in vitro culture to Day 7 for possible late biopsy consideration. The diode laser was again used on Day 5/6/7 for biopsying, combining laser pulse ablation and mechanical aspiration to separate 3–10 TE cells [5]. All TE samples were aseptically tubed, frozen and shipped to Genesis Genetics (Plymouth, MI) or Ovation Fertility Genetics (Henderson, NV) for array CGH or NGS analysis.

玻璃化和胚胎移植

在第5,6或7天，使用microSecure-VTF在基于甘油的非dmso玻璃化(VTF)溶液中玻璃化囊胚(≥3BB级)(Innovative cryoenterprises, Linden, NJ;19)。无菌microSecure VTF采用3步稀释(5分钟/5分钟/1分钟);将单个囊胚装入300 μm ID的柔性支架中(Cook Medical, Spencer, IL;3 μl体积);然后将柔韧片干燥，首先将尖端插入预先标记的0.3 ml CBS™胚胎吸管中;将吸管焊接密封后直接投入LN中₂(19、20)。通过将玻璃化的柔韧体直接放入温暖的(37°C) 0.5 M蔗糖浴中实现快速加热[21]。在10秒内，将每个囊胚直接从柔板上移到一个开放的200 μl 1.0 M蔗糖溶液中，然后在油下转移到100 μl液滴中，间隔3分钟。胚胎在下降的蔗糖溶液(T1-T4)中连续稀释，然后在Hepes-LG培养基中等渗平衡。在玻璃化ET (VFET)之前，将加热后的囊胚在LG培养基+蛋白中培养1-3小时。

所有的VFET都包括激素替代周期，使用口服雌二醇、雌二醇贴片或肌肉注射雌二醇(IM)，然后注射孕酮油。血清孕酮水平<1.0 ng/ml，子宫内膜厚度>8 mm时开始使用黄体酮油。注射孕酮5.5 d后进行VFET。经阴道超声引导ET手术。妊娠在et后10天开始测试，植入后4周开始通过阴道超声评估。通过与患者的书面或口头交流确认活产。

研究设计与统计分析

通过一项观察性回顾性队列分析，我们试图确定在植入前遗传学筛查的高龄产妇(年龄≥38岁)中，SET与DET的疗效。我们评估了2013年1月至2015年6月来自南加州生殖科学研究所(SCIRS)医疗记录的158个冷冻整倍体胚胎移植周期。根据最近一项验证整倍体囊胚着床潜力的研究，本研究的纳入标准仅仅是产生至少1个BB级及以上的整倍体囊胚(n=140)[5]。只进行了VFET周期，排除了所有供体卵子/胚胎周期。每次首次移植尝试计算着床、临床妊娠、活产和自然流产的初始比较。采用卡方分析来比较SET组和DET组之间妊娠结局(如临床妊娠、植入、活产率、双胞胎产量)的差异。临床妊娠判定需要确认心脏活动，而着床率包括超声检查检测到的任何囊。

结果

140例合格研究患者的平均年龄为39.7岁，组间无差异。临床总妊娠率为83%(116/140)，活产率为80%(112/140)。当SET与DET比较时，活产率(分别为79.5%和83.3%)无统计学差异。然而，SET植入率(82.9%)比DET(75%)有更高的趋势(p<0.10)。我们无法发现总体和年龄组之间的显著差异(表1)，这是由于DET组的样本量小，而总体妊娠成功率高。毫不奇怪，与本研究中SET后的单卵双胞胎(1/ 97,1%)相比，DET的双胞胎率明显更高(p<0.001)，为73%(11/15)。

表1。高龄产妇的整倍体SET与DET妊娠结局。

版权所有OAT。版权所有

年龄 (岁)	集			依据
	植入	临床怀孕的	婴儿安全出生	植入	临床怀孕的	婴儿安全出生
38-40	79.1% 72/91	79.1% 72/91	75.8% 69/91	68.8% 11/16	87．5% 7/8	87．5% 7/8
41-42	93.1% 27/29	93.1% 27/29	89.7% 26/29	88.9% 16/18	88.9% 8/9	88.9% 8/9
43 +	100% 2/2	100% 2/2	100% 2/2	0% 0/2	0% 0/1	0% 0/1
总计	82.7% 101/122	82.7% 101/122	79.5% 97/122	75.0% 27/36	83.3% 15/18	83.3% 15/18

缩写:SET -单胚胎移植;DET -双胚胎移植。

讨论

虽然最初的研究推荐SET仅用于理想的患者群体，年龄<35岁且胚胎质量>2个[6,9]，但我们认为SET应作为一线尝试，用于已知质量一般至良好的整倍体囊胚的每个年龄的患者。当对比整倍体囊胚的SET和DET时，两种方案对高龄产妇产生相似的活产结果。更重要的是，通过移植单个整倍体胚胎，几乎消除了双胞胎的风险。相反，移植两个整倍体囊胚导致异常高的双胞胎率。虽然大多数不孕患者和夫妇会欢迎两个孩子的祝福，但我们的目标一直是一个健康的足月分娩。与单胎妊娠相比，双胎妊娠的早产风险增加了6倍，围产期死亡率增加了3倍，并且孕妇高血压疾病和出血等并发症的风险也增加了[1,2]。

从根本上说，当胚胎被筛选为基因正常时，它们的植入潜力超过了移植多个胚胎的需要。这一数据验证了我们将SET作为所有使用整倍体囊胚的首次ET尝试的标准临床实践的决定。PGS-ET周期先前已显示可提高40-43岁女性的着床率和活产率(分别为50.9%和45.5%)[22]，但其水平低于我们实验室的观察结果。有趣的是，与DET相比，SET组有倾向于增加着床率的趋势。这可能暗示着床过程中胚胎之间可能存在不利竞争，然而，我们之前在体外记录了胚泡合并可能发生[18]。后一事件表明滋养外胚层细胞与其他囊胚高度相容，并且确实在第6天被编程为细胞入侵，甚至偶尔彼此入侵(0.015%)。总的来说，我们的回顾性分析受到DET小样本量的限制，但随着患者人数的增加，我们相信这些植入率的差异将具有重要意义。

我们的临床实践是促进高龄产妇的囊胚活检/PGS周期，因为我们知道在这一人群中胚胎非整倍体的发生率越来越高[23]。我们的经验与最近的其他报告相似，38-40岁的整倍体率为25.2-35.3%，41-42岁为15.9-20.5%，43岁以上为17-23.1% (Ovation Fertility, 2017年未发表的数据)。因此，分别有24%、42%和81%的患者无法在随后的VFET周期中产生整倍体囊胚。然而，我们的方法让人感到乐观，我们为患者提供了一条信息丰富、直接、情感更平衡的怀孕成功之路。毫无疑问，PGS确实增加了周期的成本，但我们不能忽视那些经历了多次失败和胎儿丢失的女性所承受的巨大情绪困扰和创伤，这些女性正在移植形态良好的非整倍体胚胎。此外，胎儿丢失可能会使患者未来的生育能力复杂化，并延迟他们再次怀孕的能力。在本研究评估的老年人口中，时间是一种宝贵的商品。我们认为有能力诊断潜在的周期失败，并大大降低≥38岁妇女(即SAB;在未经测试的ET周期中，25-75%)，强烈证明了囊胚活检/PGS干预的合理性。考虑到有限的妊娠损失和与整倍体SET相关的健康单胎活产的增加，我们现在能够为大多数患者提供更愉快、更安全、更积极的试管婴儿体验。

致谢

作者要感谢Ovation Fertility的胚胎学团队(正式名称为SCIRS)，感谢他们在胚胎培养、活检和玻璃化方面的专业技术合作，从而促进了我们实验室产生的可靠、优秀的结果。

利益冲突

Robert Anderson博士和John Whitney博士分别担任Illumina的ART医学和技术顾问。所有其他作者没有商业关系声明。

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