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摘要

为了了解系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)的发病机制，我们研究了来自MsPGN患者和正常受试者的PBMCs的磷蛋白组学特征₂富集技术，二维纳米升液相色谱和线性离子阱四极杆质谱。我们总共识别了693个不同的磷酸化位点，对应439个基因。基因本体(GO)分析表明，蛋白质或核酸结合在分子功能中所占比例最大，其次是细胞核内的碱基、核苷、核苷酸和核酸代谢过程。KEGG通路分析表明，大多数差异基因富集于丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路和局部粘附通路。基因网络分析表明，丝氨酸/精氨酸重复基质(SRRM) 1、组蛋白去乙酰化酶(HDAC) 1和蛋白激酶C δ (PRKED)是网络中显著的调控因子。这些结果提示，蛋白磷酸化修饰的异常变化可能与MsPGN有关，可能与MAPK信号通路和局灶性粘附通路的调控异常有关。在这些途径中，连接度较高的差异基因SRRM1、HDAC1和PRKCD可能是MsPGN有前景的生物标志物。

关键字

系膜增殖性肾小球肾炎，差异磷酸化位点，分子功能，信号通路

简介

系膜增生性肾小球肾炎是肾小球肾炎最常见的一种形式，其特征为系膜细胞增多和肾小球细胞外基质扩张，常伴有单核细胞浸润[1-3]。一般来说，为了准确诊断MsPGN患者[4]的肾脏病变，需要进行肾活检。然而，由于机械性侵及感染和出血的风险，损伤肾脏不太适合重复此入路[5]。因此，开发新的生物标志物对于进一步了解MePGN的发病机制，提高其诊断、预后和治疗水平具有重要意义。蛋白质组学已被用于全面分析细胞内信号事件以及相关的翻译后修饰。很少有研究报道蛋白质组学在多种疾病中的复杂变化，即使是在MePGN中[6-8]。W Sui等人[8]利用iTRAQ技术分析MePGN患者肾脏组织中的总蛋白，发现MePGN蛋白组差异表达谱可能为MePGN患者的诊断提供新方法。

磷酸化是一个复杂的调节事件，涉及蛋白质的生物活性，实际上影响信号网络[9]。已证实磷酸化与系统性红斑狼疮、阿尔茨海默病、囊性纤维化和重度联合免疫缺陷有关[10-12]。然而，对MsPGN患者的磷蛋白组进行综合分析，目前国内外鲜有报道。因此，蛋白质组学的研究将有助于寻找新的生物标志物，进一步了解MsPGN的病因，提高诊断水平。磷酸肽蛋白质组采用高灵敏度液相色谱-质谱(LCMS/MS)系统，改进了磷酸肽识别软件，并采用复杂的生物信息学策略进行后续分析，包括基因本体论(GO)分析、通路分析和蛋白质网络分析[10]。来自蛋白质组学分析的丰富数据也为MsPGN的发病机制提供了见解。

在本研究中，我们使用了一种结合TiO的方法来研究MePGN中磷蛋白组的意义₂利用二维纳米升LCMS/MS技术，探讨MsPGN患者中差异表达的磷蛋白组，同时分析其基因本体论和通路。

材料和方法

PBMCs培养和裂解

本研究共纳入12名受试者，其中6名MsPGN患者和6名健康志愿者(表1)。所有MsPGN患者均来自桂林181医院肾内科住院患者^圣无活动性感染、糖尿病和自身免疫性疾病。在本研究中，这些患者均未接受免疫抑制治疗或非甾体抗炎药物治疗。所有病例均为原发性慢性肾小球肾炎。免疫沉积均匀，IgA和C3沉积，IgG沉积微弱。在体检科招募年龄、种族、性别匹配的健康对照。桂林市伦理委员会^圣医院批准了该研究，并在所有参与者知情同意的情况下获得了外周血样本。在临床无菌条件下，分别抽取6例MsPGN患者和6例正常患者的外周血标本。所有分离的PBMCs用淋巴细胞分离液(lymphoolyte®-H)分离，然后分别收集在EP管中。PBMCs的培养基本按照美国类型培养集(ATCC)的推荐进行。PBMCs在24孔板中培养24小时，使用添加的RPMI-1640培养基，在37℃、5% CO2的潮湿环境中培养。PBMCs在植物血凝素(PHA)刺激下增殖。所有pbmc在冰冷的缓冲溶液中洗脱两次。然后用双茚二酸(BCA)法测定蛋白质浓度。

表1。患者和对照组的基线临床数据

	MsPGN病人	健康对照组
男性/女性(n)	4/2	4/2
年龄(年)	37.75±17.76	35.50±4.93
收缩压(毫米汞柱)	137.25±20.12	118.33±7.26
舒张压(毫米汞柱)	88.00±5.83	83.17±8.11
血红蛋白(g / L)	117.25±34.71	98.83±14.43
总蛋白(g / L)	42.50±10.86	77.99±8.14
白蛋白(g / L)	20.60±5.23	53.16±12.54
球蛋白(g / L)	21.90±9.81	12.58±1.99
肌酐(µ摩尔/升)	105.75±43.21	84.67±19.54
尿酸(µ摩尔/升)	401.75±67.39	236.00±55.57
尿素(更易/ L)	7.53±6.07	17.07±10.89
钙(更易/ L)	1.86±0.14	2.08±0.37
磷(更易/ L)	1.42±0.33	1.15±0.44
钾(更易/ L)	3.65±0.25	2.53±0.49

此处则浓缩

当细胞达到合适的汇合点时，我们在SDS的存在下通过两步LysC和胰蛋白酶消化溶解细胞。磷酸肽被TiO富集₂珠。这种用于高分辨率质谱的磷酸肽富集策略在磷酸化位点的定位上有了新的发展，最近的大规模研究加强了磷酸化的含量。简单地说，肽样品主要用TiO孵育₂然后在NH中洗脱₄哦。收集每一种富集洗脱液进行质谱分析。随后，使用安捷伦3100 OFFGEL分馏器，通过IEF将洗脱液的其余部分分成几个馏分。我们添加10 μ l的10% TFA到每个分数和阶段尖端。在最大电流为50 μ a、最大功率为200 mW[12]的条件下收集多肽。最后，所有洗脱在TiO₂柱分离、浓缩、干燥，-80°C保存备用。

质谱:我们使用二维纳米升液相色谱系统与线性离子阱四极杆质谱联用(LTQ-Orbitrap XL, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)进行质谱分析。LTQ-Orbitrap XL的过程包括MS1扫描和MS2扫描。我们收集多肽并测量生成的肽片段，并使用自动增益控制目标值，MS1为1000000,MS2为50000。该过程激活了动态排除，重复计数，排除持续时间为20秒，质量公差为±5ppm。MS1扫描为剖面扫描模式，MS2扫描为质心扫描和多级激活扫描模式。

错误发现率(罗斯福):使用MaxQuant 1.0.13.13对原始文件进行预处理。在MaxQuant中，我们根据肽长度、质量误差估计和所有正向和反向肽识别的吉祥物分数自动过滤，估计所有肽识别的错误发现率(FDR)为1%。用国际蛋白质指数(IPI;版本3.52)的人类数据库和综合酶特异性的开放质谱搜索算法(OMSSA;2.1.4)版本。采用Mascot进行肽段强度鉴定，利用Coon OMSSA蛋白组学分析软件套件(COMPASS)筛选肽段、蛋白及磷酸化位点至FDR≤0.01。

统计分析:为筛选两组间差异磷酸化位点，采用以下方法。①计算两组间的折叠变化。②设置阈值为1，表示两组间平均折叠变化≥2次;t检验的p值≤0.05。采用MATLAB 7.5进行t检验。③标记基因根据NCBI数据库命名对应的蛋白质。

结果

差异磷酸化位点的识别与聚类分析

在本研究中，利用超灵敏和高分辨率的质谱仪对MsPGN的PBMCs中的磷蛋白组进行了分析。在不到两周的时间里，我们利用欧氏距离和平均值对差异磷酸化位点进行了聚类分析，根据NCBI数据库的注释信息，共识别出693个差异磷酸化位点和439个对应基因。

去分析

通过GO数据库识别与差异磷蛋白相关的单个或多个生物功能，以表征磷蛋白组。氧化石墨烯的主要功能信息为生物过程、细胞成分和分子功能。结果表明，在生物过程中核苷酸和核酸代谢过程(21.4%)、细胞成分组织(21.3%)、转运(14.7%)和多细胞生物发育(12.1%)最为突出(图1A)。细胞成分分类显示，细胞核(29.7%)、质膜(16.6%)、胞浆(15.8%)和细胞骨架(13.1%)是磷酸化的主要亚细胞成分(图1B)。参与磷酸化的最重要的分子功能是MsPGN PBMCs中的蛋白质结合(35.5%)、催化活性(16.1%)、核酸结合(13.6%)和核苷酸结合(12.9%)(图1C)。

图1 a。基于参与生物过程的pbmc中磷蛋白的功能分类．最大的一组含有与碱基、核苷、核苷酸和核酸代谢过程相关的蛋白质。另外两大类是参与细胞成分组织和运输的蛋白质

图1 b．基于细胞成分位置的磷蛋白分布。最丰富的细胞成分是核蛋白和与质膜、胞浆或细胞骨架相关的蛋白。该信息由基因本体注释编译而成

图1 c。pbmc中磷蛋白的分子功能。最大的基团是蛋白质结合，其次是催化活性和核酸结合。该信息由基因本体注释编译而成

代谢包括多种信号通路，由DNA、RNA改变和复制应激激活，并通过激酶级联转导，主要通过一些特定的蛋白激酶。通过KEGG通路数据库，使用GenMAPP v2.1进行规范化通路映射。本研究确定了44条与大多数差异磷酸化位点相关的代谢通路(表2)，其中包括MAPK信号通路、局部粘附、肌动蛋白细胞骨架调控、FC γ r介导的吞噬、血管平滑肌收缩、RNA运输等。MAPK信号通路(图2A)和局灶粘连(图2B)的频率较高，表明这些通路发生了更多的改变。

图2 a。MePGN的PBMCs通路分析。MAPK信号通路特异性含量显示，黑色阴影矩形代表差异表达基因

图2 b。基于通路分析的病灶粘连细节，黑色阴影矩形代表差异表达基因

表2．MsPGN患者与健康对照组差异表达通路的排序

通路	P值
MAPK信号通路	0.003494
粘着斑	0.000573
Fc γ r介导的吞噬作用	8.16 e-07
血管平滑肌收缩	7.14 e-06
肌动蛋白细胞骨架的调节	0.002977
RNA运输	0.000656
Fc epsilon RI信号通路	5.77 e-06
促性腺激素信号通路	4.86 e-05
T细胞受体信号通路	9.03 e-05
白细胞transendothelial迁移	0.000172
紧密连接	0.000534
趋化因子信号通路	0.00902
内吞作用	0.034331
胰腺分泌	0.001066
自然杀伤细胞介导的细胞毒性	0.009163
单纯疱疹病毒感染	0.043805
长期的抑郁	0.000385
胃酸分泌	0.000563
磷脂酰肌醇信号系统	0.000951
沙门氏菌感染	0.001529
唾液分泌	0.001907
核糖体	0.002198
剪接体	0.015999
长期势差	0.001978
Progesterone-mediated卵母细胞成熟	0.006306
缝隙连接	0.007588
逆行神经的信号	0.013264
Glutamatergic突触	0.042641
志贺氏菌病	0.004493
幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号转导	0.007649
VEGF信号通路	0.012929
B细胞受体信号通路	0.013733
ErbB信号通路	0.023767
信使rna监测通路	0.02754
囊泡运输中的SNARE相互作用	0.002067
非小细胞肺癌	0.011991
致病性大肠杆菌感染	0.012924
nod样受体信号通路	0.016014
细菌侵入上皮细胞	0.033175
利什曼病	0.040738
非洲锥虫病	0.014259
Vasopressin-regulated水重吸收	0.025544
内分泌和其他因素调节的钙重吸收	0.036159
甲状腺癌	0.037167

基因网络分析

为了进行基因网络分析，我们整合了不同的相互作用，包括酶与酶、蛋白质与蛋白质和基因表达的相互作用。简单地说，我们通过KEGGSOAP (http://www.bioconductor.org/packages/2.4/bioc/html/KEGGSOAP.html)利用R (http://www.r- project.org/)软件，分析了基因调控与蛋白质修饰之间的相互作用。酶-酶相互作用表明两种酶催化的反应是连续的。蛋白质-蛋白质相互作用的数据下载于MIPS数据库(http://mips.helmholtz-muenchen.de/proj/ppi/)．采用共引算法对已报道文献的基因表达相互作用进行分析。共被引基因频率越高，基因表达相互作用的概率越大。最后，根据以上三个结果对基因网络进行了综合整合，揭示了基因间的相互作用。在网络中具有较高线路连通性的基因被认为是枢纽基因，对网络的稳定性起着中心作用。一般来说，枢纽基因多为转录因子，有时可能是激酶。在这项研究中，基因网络分析显示它是一个网络图（图3一）和直方图(图3B)。结果显示SRRM1、HDAC1和PRKED为枢纽基因。

图3。MePGN PBMCs中的基因网络分析，包括基因的表达、结合和转录后修饰等相互作用

图3 b。基因网络的连通性分析表明SRRM1、HDAC1和PRKCD是较高的连通性基因

讨论

世界卫生组织委员会将MePGN定义为超过80%的肾小球中系膜细胞的基本一致增加。细胞增殖和纤维化是典型的症状，并可能最终导致终末期肾脏疾病。最近的一些研究表明，慢性肾脏疾病PBMCs中的细胞因子、组蛋白H3、赖氨酸4、P2X7受体在发作过程中起着关键作用[14-16]。因此，MePGN患者PBMCs蛋白的改变可能与发病机制有关。蛋白质磷酸化是细胞发育、分化和信号转导的重要翻译后修饰。从这个意义上说，磷蛋白的全面识别有助于我们理解这一过程，使我们能够找到预防和修复肾脏损伤的重要治疗靶点。

哺乳动物体内的大多数磷蛋白都能在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上被磷酸化。当蛋白激酶或磷酸酶被激活或抑制时，磷酸化蛋白的相对丰度会发生改变，导致细胞生物学功能或代谢途径异常。利用TiO₂本研究结合LTQ-Orbitrap XL富集技术，与正常对照相比，在MePGN中鉴定了对应439个注释基因的693个差异磷蛋白。GO分析这些差异磷酸化位点和基因显示，蛋白质或核酸结合占分子功能的比例最大，涉及细胞核内的碱基、核苷、核苷酸和核酸的代谢过程。

系膜细胞增殖是MePGN的典型特征之一。Kenichi Suga[17]表明Hic-5作为过氧化氢(H₂O₂)诱导的局灶性粘附蛋白参与系膜细胞表型的改变，从而在MePGN中产生异常的细胞外基质重塑。一般认为MePGN的免疫发病机制是免疫复合物沉积、炎症和细胞因子异常分泌。MAPKs是丝氨酸和苏氨酸信号转导酶，在细胞因子[18]的细胞外刺激下可通过磷酸化激活。MAPK信号通路具有重要的生物学功能。MAPK通路的激活或抑制已被证实是系统性红斑狼疮[19]和类风湿性关节炎[20]的潜在发病机制，可能与炎症有关。Src可通过MAPK信号通路[21]介导细胞因子刺激的气道肌细胞基因表达。IL-1β在人肾小球疾病系膜细胞中通过MAPK激活差异表达并显著上调中性粒细胞明胶酶相关脂钙素受体的观点已被提出[22]。本研究通过通路分析发现，MAPK信号通路、Focal粘连和Fc γ r介导的吞噬作用在MePGN的发病机制中发生了显著的改变。值得注意的是，MAPK信号通路的调控在MsPGN的PBMCs的磷酸化作用下异常激活。这一结果表明，上述途径中磷酸化蛋白的活性或表达发生了改变，这是由MePGN与正常蛋白之间的差异基因介导的。 We had faith in that MAPK signaling pathway may be available for treating MsPGN via appropriate regulation or interventions, which supplied an experimental groundwork for researching the pathogenesis and novel therapy of MsPGN. However, future more researches are essential to verify the accuracy of the result using western blot or other appropriate methods.

HDAC1可以在Ser位点磷酸化⁴²¹和爵士⁴²³残基，促进其酶活性和复合物的形成[23-25]。HDAC1活性在正常胚胎肾基因表达、生长和分化[26]中起着关键作用。它还介导肾上皮细胞和肾间质成纤维细胞的增殖，以及小管间质损伤中炎症和纤维化反应诱导的HDAC1[27-30]。在本研究中，网络分析表明SRRM1、HDAC1和PRKED是网络中显著的调控因子。这一结果提示HDAC1在PBMCs的磷酸化过程中发挥了潜在的重要作用，为探索MsPGN发病机制提供了实验理论的补充。

结论

综上所述，MAPK信号通路是一种重要的代谢途径，HDAC1在磷酸化过程中起着重要作用。提示异常的蛋白磷酸化可能参与了MsPGN的发病机制。此外，干预相关基因和通路的活性可能能够预防或延缓MsPGN的进行性肾损伤。然而，本研究是揭示磷蛋白组修饰的初步研究。需要进一步的验证和研究来阐明MsPGN的发病机制。

确认

本工作获得广东省科技计划项目(No. 2016a020215029)、广东省科技计划项目(No. 2017b020209001)、广西自然科学基金项目(No. 2017JJA130240)、平山市卫生计生系统科研项目(No.201507)的资助，衷心感谢参与本研究的患者。

道德声明

本研究已获得桂林181伦理委员会批准^圣该医院遵守《关于人体医学研究伦理原则的赫尔辛基宣言》。

的利益冲突

我们声明我们之间没有利益冲突。

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