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摘要

背景/目的帕金森病(PD)没有可靠的诊断测试，尽管有许多尝试，以确定疾病早期诊断的特定生物标志物。据报道，PD患者脑脊液中存在不同的蛋白表达模式，包括载脂蛋白j /Clusterin (CLU)。CLU与许多生物学过程有关，包括衰老、氧化应激和细胞凋亡。CLU与突触前神经元蛋白α-突触核蛋白(α-synuclein)在路易氏皮质体中的共定位已在PD患者中显示出来。本研究的目的是验证CLU作为一种循环生物标志物的假设队列帕金森病患者。

材料/方法入选的PD患者96例，年龄和性别匹配的健康受试者(HS) 84例。测定血浆CLU水平，并与PD患者的运动和神经病理参数进行相关性分析。

结果/结论:在年龄小于60岁的受试者中，与HS相比，PD患者CLU的血液水平显著增加(PD: 283+149 mg/ml, HS: 106+74毫克/毫升;p = 2.7 x10⁴)。在年龄大于60岁的受试者中没有观察到统计学上的显著差异。此外，CLU血液水平与迷你精神状态检查(MMSE)呈显著负相关。年轻PD患者中CLU水平的升高可能与PD的早期生物标志物相关。因此，在临床方面尚未出现的PD患者中，测定循环CLU水平可能有助于早期诊断，从而允许及时的治疗方法。

简介

帕金森病(PD)是一种与年龄相关的神经退行性运动障碍，约有2%的50岁以上人群患有这种疾病。一些非运动症状也是PD患者的特征。帕金森病的诊断只能通过临床体征和症状以及死后检查的神经病理学结果。通过使用多巴胺转运蛋白单光子发射计算机断层扫描(DaT-SPECT)，我们最近报道了PD患者纹状体摄取普遍减少[2,3]。然而，目前还没有针对PD的特异性实验室检测方法，因此需要选择性生物标志物来辅助PD的诊断。

PD的分子发病机制涉及多种分子和细胞机制，如α-突触核蛋白蛋白稳态、线粒体功能、氧化应激和细胞凋亡[4]，其中许多与阿尔茨海默病(AD)和多系统萎缩(MSA)等其他神经退行性疾病的衰老有关[5-7]。在本次竞赛中，既往研究报道了PD患者脑脊液(CSF)中显著的生化变化，包括淀粉样前体蛋白、组织蛋白酶B前体[8]、嗜铬粒蛋白B和载脂蛋白H[9]和CLU[10]的变化。特别是在PD患者[11]中发现CLU与路易体中的α-突触核蛋白丝共定位。所有这些观察都导致了Clusterin在PD发病机制中的假定作用的假设。

CLU是一种分泌性异二聚体糖蛋白，在人体组织中普遍表达。CLU参与许多过程，包括氧化应激、凋亡、细胞周期调节和DNA修复。CLU是研究最多的循环分子伴侣之一，是一类功能蛋白，其主要功能是防止不适当的结合和非折叠多肽链的聚集，特别是在细胞/氧化应激条件下。这种情况可发生在神经退行性疾病，并决定细胞凋亡。CLU既定位于细胞质(分泌型CLU- sCLU)，也定位于细胞核(nCLU)。在这些不同的位置，这两种亚型以相反的方式决定细胞存活或细胞死亡。事实上，sCLU亚型被认为是一种抗凋亡因子[12-18]，而nCLU亚型被证明具有促凋亡活性[19-21]。

在本研究中，我们假设血浆CLU水平可以作为PD的早期标志物，当疾病的临床体征还不明显时，CLU的测定可能有助于年轻患者诊断PD，从而及时诊断并及时进行治疗干预。

材料与方法

病人

从巴里大学神经疾病和神经科学感官诊所的门诊患者中招募了96名PD患者。帕金森病不同于帕金森病、痴呆和严重共病，如感染性、炎症性、肿瘤性和代谢性疾病的患者被排除在研究之外。根据国家立法法令(2012年3月26日意大利官方公报第72号)，该研究已按照《赫尔辛基宣言》进行，所有患者签署了《为科学研究目的处理个人数据的一般授权知情同意书》。本研究是对巴里大学医学院神经内科神经疾病和神经科学感觉器官诊所多年来收集的血液样本进行的回顾性研究。在进行人体研究时，不需要伦理批准，患者签署的知情同意书就足以进行研究。使用英国脑库标准[22]诊断PD。收集了有关年龄、性别、帕金森运动症状持续时间以及多巴胺激动剂和左旋多巴等效剂量(LED)的信息。运动障碍专家评估了基本的帕金森症状(震颤、休息、僵硬和缓霉素)和运动并发症(包括运动波动和运动障碍)。统一帕金森病评定量表第III部分和第IV部分8UPDRS-III和UPDRS-IV)以及Hones和Yahr (HY)的分期在从药物马戏中消除一晚后至少12小时后进行测量。神经心理学检查也由心理学家进行评估，包括迷你精神状态检查(MMSE)[23]。 The FAS verbal fluidity test [24], the Geriatric Depression Scale [25], the Activities of Daily Living (ADL) and the Instrumental Activities of Daily Living (IADL) were also determined in PD patients. Both motor and neuropsychological information were obtained on the same day of blood sampling for laboratory analyzes. Eighty-four healthy subjects (Healthy Subjects group-HS), matched for age and sex with PD patients, were recruited among relatives of outpatients with neurological diseases other than parkinsonism. Demographic, motor and neuropsychological parameters evaluation of the subjects included in the study are reported in Table 1 and Table 2.

表1。研究对象的人口学和运动参数。

	年龄(岁)	性	帕金森病发病的平均年龄(岁)	运动症状的平均长度 (岁)	HY分期 (平均成绩)	UPDRS-III (平均成绩)
PD患者	66.2+9.7	53米 43 F	60+9	6.2+4.2	1.7+0.7	27.4+12.9
正常的课程	63.8+12.1	41米 43 F
统计评估	P = 0.3

表2。帕金森病患者的神经心理学评价。

MMSE(平均分)	FAS(平均分)	平均分(GDS)
26+4	22+11	9+6

血液edta取样和实验室测试

人类聚类素血液测定．使用BioVendor Laboratory Medicine, Inc (DBA, sergrate Milano, Italy)的商业试剂盒测定血浆-EDTA clusterin水平，所有受试者禁食一夜后采集静脉血样本，并使用EDTA作为抗凝血剂。对于PD患者，在药物消除一晚后进行血液采样，冲洗期至少为12小时。血浆样本在1100克离心10分钟，4°C，仔细收集上清。每个样品分成0.5 ml等分，保存于-70°C，直到使用夹心ELISA方法-生物素标记抗体评估clusterin。clusterin最低检出限为0.50 μg/l, 3个水平重复8次，b6%。精密度:中级精密度为9%。在BioVendor Human Clusterin ELISA中，标准品、质量控制品和样品在预先包被单克隆抗人Clusterin抗体的微孔板中孵育。在孵育和洗涤60分钟后，加入生物素标记的第二单克隆抗人聚簇素抗体，与捕获的聚簇素一起孵育60分钟。再次洗涤后，加入链霉亲和素- hrp缀合物。 After 30-minutes incubation and the last washing step, the remaining conjugate is allowed to react with the substrate solution (TMB). The reaction is stopped by addition of acidic solution and absorbance of the resulting yellow product is measured. The absorbance is proportional to the concentration of CLU. A standard curve is constructed by plotting absorbance values against concentrations of standards, and concentrations of unknown samples are determined using this standard curve.

统计分析

所得数据用平均值表示+标准差(米+SD)。组间比较采用方差分析检验(ANOVA)。在指定的地方，使用Student 'st以及。通过Spearman试验评估了CLU血水平与PD患者年龄之间的关系。当数据具有统计学意义时p< 0.05。

结果

为了将CLU确定为PD的早期标志物，我们测定了一组不同年龄(50 - 80岁)PD患者的血浆CLU水平，并将数据与年龄和性别匹配的对照健康受试者(HS)进行了比较。获得的数据表明，60岁以上的受试者血浆CLU水平无差异，无论PD或HS。

PD和HS患者血浆CLU水平见图1。在两组中没有观察到差异，尽管与PD患者相比，HS中CLU的轻度表达似乎是一种趋势(196+129毫克/毫升vs241+139 mg/ml, HSvsPD)。然而，当我们对年龄的受试者进行分组分析时，我们发现，与年龄小于60岁的HS患者相比，PD患者的CLU血浆水平升高。事实上，两组受试者的CLU水平没有统计学差异(237+135毫克/毫升vs222+HS(43名受试者)和PD(51名受试者)分别为133 mg/ml，当受试者年龄大于60岁时。相比之下，当比较年轻受试者(< 60岁)的CLU血浆水平时(106+74毫克/毫升vs283+HS 41例，PD 45例，分别为149 mg/ml，差异有统计学意义(p = 2.7 x 10)⁴)，如图2所示。我们还发现了统计学上的显著差异(p = 2.5 x 10³)，以年轻(< 60岁)和年长(>在我们的条件下，衰老可以掩盖与神经退行性过程相关的CLU的过度分泌，这一假设得到了支持。

图1．两健康受试者CLU循环水平(196+129 mg/ml)和PD患者(241+139 mg/ml)。如果不将两组受试者按几十岁进行比较，则没有发现统计学差异。

图2．按年龄分组的健康受试者和PD患者的循环CLU水平显示。差异有统计学意义(p = 2.7 x 10⁴当比较60岁以下人群的数据时，观察PD患者和HS之间CLU水平的差异(106+68毫克/毫升vs283+分别为149 mg/ml)。两组比较无明显差异(HSvs60岁以上。

在同一图中，还报告了HS中CLU循环水平的统计分析，分为60岁以下和60岁以上。统计上(p = 2.5 x 10³)两组受试者CLU水平不同(106+68毫克/毫升和237+年轻或年长受试者分别为135 mg/ml)。相反，比较年轻人(< 60岁)和老年人(>60岁)PD患者。

Spearman检验分析显示，两组间差异显著(p = 1.3 x 10³PD患者血浆CLU水平与年龄呈负相关(r = -0.4)， HS组不存在(r = -0.04)(表3)。此外，年龄相关的线性多元回归分析显示CLU与年龄相关性显著(p = 6.0 x 10³PD患者CLU血中水平与MMSE呈负相关(r = -22.6)，而血浆CLU水平与FAS言语流动性测试、运动症状持续时间、Hones和Yahr分期无相关性(表4)。

表3。PD患者年龄与聚簇素水平的相关性。

	斯皮尔曼测试 (血液Clu /年龄)	p
PD患者	R = - 0.4	1.3 x 103
健康受试者	R = - 0.04	0.8

表4。多元线性回归。数据按年龄校正。

变量	回归系数	p
患者的	- 22.6	6.0 x 103
FAS	4.4	0．1
运动症状持续时间	- 1.7	0.8
HY分期	- 7.5	0.8

讨论

我们的研究结果清楚地表明，与相同年龄的HS相比，年轻PD患者(< 60岁)血浆CLU水平升高，这可以作为PD退行性过程的早期标志。此外，我们的研究显示血浆CLU水平与MMSE评估获得的数据呈负相关，类似于先前报道的阿尔茨海默病的数据。确实，一些作者证明血浆CLU水平与MMSE呈负相关，并且与阿尔茨海默病患者认知能力下降更快相关[26-28]。我们关于60岁以下HS的数据与Trougakos及其合作者[29]关于类似健康受试者队列的报告一致。

正如我们在本文中报道的，CLU通常在老年HS(≥60岁)中升高，这可能导致对PD中神经退行性过程决定的CLU上调的误解。这项研究表明，在年轻的PD患者中，CLU的血浆水平应该被测量，当CLU的表达仍然没有被年龄相关的水平升高所掩盖时。在这方面，Collier和同事已经证明，蛋白酶体/溶酶体功能受损，氧化应激和炎症，随着年龄的增长而增加，并积极产生脆弱的帕金森前期状态，是与PD[30]中多巴胺神经元退化相关的相关过程。我们的研究结果支持这一观点，它可以确定脑脊液中CLU水平的相关性早熟高表达，提示血液中CLU的检测是一种简单安全的神经退行性过程发病机制的早期标记物。事实上，PD患者脑脊液中CLU水平的升高，作为神经退行性进化的一个指标，已经被其他作者报道过。特别是，与HS相比，不足两年的PD患者的CLU水平增加了两倍。在患有PD[31] 2年以上的患者中未观察到这种现象。

氧化应激参与PD的神经发病机制，可能涉及包括CLU在内的几种分子介质[29,32]。我们之前报道了线粒体相关肌病患者的肌肉活检中CLU上调，表明CLU上调与线粒体相关退行性疾病[33]中发现的氧化应激相关。许多报道表明，CLU在人体组织中广泛表达，在健康和疾病中具有多种功能[34-36]。此外，CLU在功能上参与了许多生理过程(即衰老)和病理过程，包括与年龄相关的疾病(即神经退行性疾病、心血管疾病、代谢综合征)，并被认为是氧化损伤的潜在标志物[29,37]。一些研究也表明，CLU作为细胞保护因子对抗氧化剂[38]的有害影响。帕金森病(PD)折磨大约2%的50岁以上人口[1]。目前尚无明确的生物标志物。PD的一个重要观察是存在神经元内路易体，主要由CLU共定位的α-突触核蛋白丝组成。这种形成被认为是神经退行性变[39]的假定标记物。不幸的是，尽管有这些信息，到目前为止，PD的生物标志物还不存在，诊断只能通过核医学DAT SPECT帮助下的临床观察来确定。 The ability to early diagnose PD is a stringent need as well as the identification of serological markers for detection of patients with PD.

结论

总之，我们首次证明，与HS相比，PD患者的循环CLU水平有显著变化。我们表明，当疾病的临床方面还不明显时，测定血浆CLU水平是一种简单安全的方法，用于检测对年轻PD患者早期诊断有用的有效生物标志物，并用于优化治疗方法。

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