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摘要

目的:为了了解莱蛋白在滑膜成纤维细胞中的生理和病理作用，我们综合研究了莱蛋白沉默引起的蛋白谱变化。方法:在TNF-α处理和-未处理的条件下，用莱林(siL) siRNA转染永生人滑膜成纤维细胞(HSFs)。用二维荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)对受siL影响的蛋白进行综合检测。用质谱法鉴定了感兴趣的蛋白质。结果:在2D-DIGE分析中，在TNF-α处理和-未处理的条件下，siL均显著改变了约五分之一的检测到的蛋白质斑点的强度(分别为239/1092和201/1092点)。siL检测到87个蛋白点中有24个蛋白点的变化强度大于或等于±1.3倍。24个蛋白点中有15个(62.5%)属于上皮间质转化(EMT)相关蛋白。结论:莱林在emt相关蛋白的调控中具有重要作用。尽管滑膜成纤维细胞不是上皮细胞，layilin在滑膜成纤维细胞中的功能应该在EMT的背景下进行研究。此外，莱林影响的emt相关蛋白可能参与了类风湿性关节炎的发病机制，其特征是滑膜成纤维细胞的增殖和侵袭。

关键字

莱林、滑膜成纤维细胞、TNF-α

简介

Layilin是一种具有c型凝集素样基序[1]的1型跨膜蛋白。有报道称莱林是透明质酸[1]的受体，也有报道称莱林与talin和merlin等细胞骨架蛋白结合，调节细胞粘附[2-4]。事实上，有研究表明，下调莱林可抑制癌细胞的浸润和转移[5,6]。最近，有报道称layilin在CD8的一个衰竭子集中高度表达⁺肝癌中的T细胞[7]。我们已经报道肾小球肾炎患者的肾小管上皮细胞比健康人的肾小管上皮细胞表达更强的layilin。综上所述，莱林有望在多种疾病中发挥病理生理作用。然而，对莱林的生理和病理作用了解甚少。

因此，莱林在类风湿关节炎(RA)中的作用也不清楚。风湿性关节炎是一种慢性多发性关节炎，组织学特征为滑膜成纤维细胞的增殖和侵袭，炎症细胞浸润到受累关节的扩张滑膜。众所周知，在类风湿关节炎中，炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α (TNF-α)发挥病理作用[9]。事实上，阻断炎性细胞因子被用作RA[10]的有效治疗方法。最近，一种名为Snail的转录因子被报道可调节TNF-α介导的类风湿关节滑膜成纤维细胞的激活。我们已经报道了TNF-α在人软骨细胞和人透明细胞肾癌细胞系KMRC-1中上调layilin的表达[8,11]。我们已经证明layilin参与了KMRC-1[8]的TNF-α介导的上皮间质转化(EMT)。因此，我们推测莱林参与了RA中TNF-α-介导的炎症过程。然而，莱林在滑膜成纤维细胞中的生理作用和病理作用尚不清楚。为了促进对layilin在滑膜成纤维细胞中的作用的理解，我们在这里综合研究了layilin沉默对TNF-α处理和-未处理条件下的人滑膜成纤维细胞(HSFs)的影响。

材料与方法

细胞培养

永生人滑膜成纤维细胞(hsf)购自应用生物材料公司(abm, Richmond, Canada)。hsf在添加10%胎牛血清(FBS, Wako, Japan)、100单位/ml青霉素和100 μg/ml链霉素(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)的Prigrow III培养基(abm)中培养。细胞在37℃5% CO中培养₂．

siRNA和TNF-α治疗HSFs

使用Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)转染hsf，使用200 pmol/f100 mm的人类LAYN siRNA(核苷酸462-486 (GGGAGGGACACAGAGGCCTTGTTAT)，位于NM_001258390.1, CA Carlsbad, Invitrogen)。作为阴性对照，细胞转染相同剂量的对照siRNA(隐身™RNAi阴性对照介质GC双工，Invitrogen)。24小时后，将HSFs在添加1%胎牛血清、100单位/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的Prigrow III饥饿培养基中继续培养24小时。然后细胞与10 ng/ml人TNF-α (PROSPEC, Ness Ziona, Israel)孵育24小时。蛋白质从细胞中提取到裂解缓冲液(7M尿素，2M硫脲，4% CHAPS)中。蛋白质样品在使用前保存在-80°C。

RNA提取、逆转录和定量聚合酶链反应(qPCR)

总RNA，用RNeasy从hsf中纯化^®(Qiagen, Venlo, Netherlands)，经高容量cDNA逆转录试剂盒转化为cDNA^®(Life Technologies, Rockville, MD, USA)，根据制造商的说明。

qPCR采用ABI Prism 7000序列检测系统(Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)进行。测定layilin和甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的mRNA, 2µg cDNA, 300 nM正、反引物和Power SYBR的混合物^®Master Mix (Applied Biosystems)进行qPCR。引物核苷酸序列如下:layilin: 5 ' -CACAGCCTGCCAGGACCTTTA和5 ' -TGCACCGGTCATCATTCCA, GAPDH: 5 ' -TGGTATGGTGGAAGGACTCA和5 ' -ATGCCAGTGAGCTTCCCGTT。热循环条件如下:95°C持续10分钟，然后95°C持续15秒，60°C持续60秒，循环40次。

二维荧光差分凝胶电泳

提取的蛋白质用2D-DIGE分离，如前所述[12,13]。简单地说，每个蛋白质样本都用菁染料5 (Cy5, Cy dye DIGE饱和染料;通用电气医疗保健，白金汉郡，英国)。通过混合等量的每种样品制备了一个内标准样品。然后用氰基染料3 (Cy3, GE Healthcare)标记标准样品。然后将每个cy5标记的蛋白样品(2.5µg)与cy3标记的标准样品(2.5µg)混合。该混合物应用于非线性等电聚焦(IEF)凝胶(宽度24cm, pH值3-11,GE Healthcare)。随后，用IEF分离的蛋白通过12.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进一步分离。然后，使用图像分析仪(Typhoon 9400 Imager, GE Healthcare)对分离的蛋白质点进行扫描。在每个蛋白点上，分别用Progenesis程序(PerkinElmer, MA, US)量化Cy5-和cy3 -荧光强度，用cy3 -荧光强度归一化。 The normalized Cy5-intensity was used for the quantitative comparison among the samples.

蛋白质识别

从2D凝胶中切除的感兴趣的蛋白质点被胰蛋白酶消化，如前所述[14]。将制备的多肽进行基质辅助激光解吸电离飞行时间/飞行时间质谱分析(MALDI-TOF/TOF-MS) (Ultraflex, BrukerDaltonics, Bremen, Germany)。获取的肽质量被编译，以便使用Mascot软件程序(Matrix Science, London, UK)在国家生物技术信息中心(NCBI)的蛋白质数据库中进行搜索。

统计分析

统计学意义采用Student 's t检验计算。

结果

layilin沉默影响蛋白的检测

本研究采用2D-DIGE和质谱技术，综合研究了siRNA对莱林在TNF-α处理和未处理条件下引起hsf蛋白谱的变化。首先，转染hsf的siRNA为人类layilin (siL)或对照siRNA (siC)。部分细胞被TNF-α进一步处理24小时。然后对培养的细胞样品进行2D-DIGE分析。在实验之前，用qPCR方法检测siL沉默layilin的效果。结果，layilin的表达被抑制到约7%(图1)，表明layilin沉默足以进行分析。

图1。在hsf中siRNA沉默layilin

hsf转染layilin或对照siRNA (siL或siC)。然后，从细胞中提取RNA进行实时荧光定量pcr，以估算layilin和GAPDH的mRNA数量作为对照。用GAPDH对测定的layilin mRNA水平进行校正。转染siC的细胞中校正后的mRNA水平的平均值被定义为1.0。带SD的平均值显示出来。

利用2D-DIGE综合分析TNF-α处理和未处理条件下layilin沉默对蛋白的影响

通过2D-DIGE分析，在2d -凝胶上共检测到1092个蛋白点(图2A)。在没有TNF-α的情况下，1092个斑点中239个(21.9%)在siL和siC条件下的强度差异显著(表1)。239个斑点中，siL条件下29个斑点的强度是siC条件下的1.3倍或更高，24个斑点的强度是siC条件下的1/1.3倍或更低(表1)。然后我们比较了TNF-α处理条件下siL和siC的强度(表1)。结果是，即使在TNF-α处理的情况下(第1类)，siL条件下有17个斑点的强度明显高于siC条件。其他12个斑点在TNF-α处理的条件下(第2类)siL和siC条件下没有显著差异。siL条件下没有斑点的强度明显低于siC条件(第3类)。2的24点显示显著降低强度的siL条件比碳化硅条件即使在TNF -α治疗条件(类别6)。其他22点没有显示硅和碳化硅条件之间的显著差异(5级)。没有斑点显示更高强度的siL条件比碳化硅条件(4级)。蛋白质点的类别1和6被认为是受layilin,肿瘤坏死因子-α的存在与否无关。第2类和第5类斑点的蛋白质被认为仅在TNF-α-未治疗的情况下受莱林的影响。

表1。在TNF-α-未处理的条件下，layilin沉默显著改变其蛋白斑点的数量

蛋白质斑点的总数	TNF-a (-)			TNF-a (+)		本研究中的类别
	不同强度的斑数(p<0.05)			按siL/siC分类的斑点数量
1092	239	硅/碳化硅≥1.3	29	↑	17	1
				→	12	2
				↓	0	3.
		硅/碳化硅≤-1.3	24	↑	0	4
				→	22	5
				↓	2	6

另一方面，在TNF-α-处理条件下，1092个斑点中有201个(18.4%)在siL和siC条件下表现出明显的强度差异(表2)。在201个斑点中，siL条件下14个斑点的强度是siC条件下的1.3倍或更高，siL条件下20个斑点的强度是siC条件下的1/1.3倍或更低(表2)。然后我们比较了TNF-α-未治疗条件下siL和siC条件的强度(表2)。结果是，即使在TNF-α-未处理的情况下(第7类)，siL条件下有5个斑点的强度明显高于siC条件(第7类)。其他9个斑点在TNF-α-未处理的情况下(第8类)siL和siC条件下没有显著差异。siL条件下没有一个斑点的强度明显低于siC条件(第9类)。即使在TNF-α-未治疗的情况下，siL组中有4个斑点的强度明显低于siC组(第12类)。其他16个斑点在TNF-α-未治疗条件下siL和siC无明显差异(第11类)。siL条件下没有斑点的强度明显高于siC条件(第10类)。第7类和第12类斑点的蛋白质被认为受到莱林的影响，无论TNF-α是否存在。第8类和第11类斑点的蛋白质被认为仅在TNF-α-未治疗的情况下受莱林影响。

表2。在TNF-α处理的条件下，layilin沉默显著改变了蛋白斑点的数量和强度

蛋白质斑点的总数	TNF-a (+)			TNF-a (-)		本研究中的类别
	不同强度的斑数(p<0.05)			按siL/siC分类的斑点数(p<0.05)
1092	201	硅/碳化硅≥1.3	14	↑	5	7
				→	9	8
				↓	0	9
		硅/碳化硅≤-1.3	20.	↑	0	10
				→	16	11
				↓	4	12

layilin沉默影响蛋白的鉴定

接下来，我们尝试用maldi - tof质谱法对TNF-α-未处理条件下受layilin沉默影响的53个蛋白点(29个上调，24个下调，表1)进行蛋白鉴定。结果，53个蛋白点中有15个被识别出来(图2B，表3)。

图2。莱林消声效果的2D-DIGE分析在hsf

(A) hsf转染siRNA为layilin (siL)或对照siRNA (siC)。然后将细胞培养24小时，然后进行24小时饥饿。然后，取部分培养的细胞用10 ng/ml的TNF-α进一步处理24小时。从hsf中提取的蛋白质进行2D-DIGE (n=3)。MW，分子量。

(B)用MALDI-TOF-TOF/MS对siL显著改变的蛋白斑点强度进行蛋白鉴定。在2D凝胶上识别的斑点的位置用带有斑点编号的圆圈表示。

在第一类斑点中，无论TNF-α是否存在，都被认为被layilin下调的蛋白如下:ID1217:超氧化物歧化酶[Mn]线粒体(SODM)， ID893:钙结合线粒体载体蛋白SCaMC-1 (SCMC1)， ID923: serpin H1 (SERPH)， ID532: 78kDa葡萄糖调节蛋白(GRP78)， ID1001:异质核核糖核蛋白A2/B1 (ROA2)， ID1477:第2类斑点的蛋白被认为只有在TNF-α-未处理的条件下才被layilin下调，鉴定如下:ID1262: SODM, ID998: ROA2, ID714:烟酰胺磷酸基转移酶(NAMPT)， ID911:角蛋白，II型细胞骨架1 (K2C1)和ID885: SCMC1。第5类斑点中被认为只有在TNF-α-未处理的条件下才被layilin上调的蛋白被鉴定为:ID540: GRP78, ID271:生长/分化因子10 (GDF10)， ID811:谷胱甘肽合成酶(GSHB)， ID1190:黑色素瘤相关抗原B3 (MAGB3)。

同样，我们尝试在TNF-α-处理条件下对34个受layilin沉默影响的蛋白点进行蛋白鉴定(14个上调，20个下调，表4)。结果，34个蛋白点中有10个被鉴定出来(图2B，表4)。

在第7类斑点中，无论是否存在TNF-α，都被认为被莱林下调的蛋白被鉴定为:ID1217: SODM和ID1312:过氧iredosin -2。第8类斑点中被认为只有在TNF-α-处理条件下才被莱林下调的蛋白被鉴定为:IDs1228和1229:蛋白NipSnap同源物3A (NPS3A)。在第11类斑块中，被认为只有在TNF-α-处理条件下才被layilin上调的蛋白如下:ID1468: vimentin, ID705: cdc42相互作用蛋白4 (CIP4)， ID1322:过氧化物酶体双功能酶(ECHP)， ID1375:锌指蛋白350 (ZN350)， ID1446:胱抑素- b (CYTB)， ID1296:过氧化物氧化蛋白-2 (PRDX2)。

讨论

我们在此利用蛋白质组学方法全面研究了TNF-α处理和-未处理条件下layilin沉默对HSFs的影响。我们发现，在两种条件下，layilin沉默显著改变了约五分之一的检测到的蛋白点的表达。53个在TNF-α-未处理的条件下出现±1.3倍或更大强度变化的点，根据TNF-α-处理条件下layilin- silence的变化，进一步划分为1-6类。同样，在TNF-α-处理条件下，34个蛋白点的强度变化为±1.3倍或更大，根据layilin- silence在TNF-α-未处理条件下的变化，将其进一步归类为7-12类。

版权所有OAT。版权所有

第1类和第7类以及第6类和第12类的蛋白点被认为含有由layilin独立于TNF-α信号调节的蛋白。在这里，分类1和7中确定了7个蛋白质。有趣的是，7个蛋白中有5个被报道与EMT相关(ID1217: SODM, ID923: SERPH, ID532: GRP78, ID1001: ROA2, ID1312:过氧化物还原蛋白-2.)。具体来说，据报道，SODM是一种催化超氧自由基的酶，在TNF-α诱导的EMT过程中上调，并增强CD44的表达，CD44在高度恶性肿瘤细胞[15]上强烈表达。SERPH是热休克蛋白之一，据报道在环孢素诱导的小鼠肾上皮细胞EMT中升高[16]。GRP78是一种热休克蛋白，据报道可增加纤维连接蛋白和整合素β1，增强结肠癌细胞[17]的粘附性。此外，GRP78的表达已被报道在人结肠腺癌[17]的EMT中增加。ROA2是一种核核糖核蛋白，据报道在肺癌细胞[18]中高度表达。据报道，沉默ROA2可上调E-cadherin，下调E-cadherin[18]的转录阻滞剂，因此，ROA2可促进EMT。总的来说，这4种蛋白质被认为参与了EMT的诱导和/或促进。 The up-regulation of these 4 proteins by layilin-silencing observed here indicates that layilin constitutively suppresses these 4 proteins. On the other hand, PRDX2 has been reported to inhibit TNF-α-induced EMT in colon cancer cells [19]. The up-regulation of PRDX2 by layilin-silencing observed here indicates that layilin constitutively suppresses PRDX2.

第2类和第5类蛋白点被认为含有只有在TNF-α-未治疗的情况下才受莱林影响的蛋白质。这些蛋白可能受到TNF-α和layilin沉默的相反调节。另外，如果TNF-α下调了layilin，那么在TNF-α处理的条件下，layilin沉默实际上不会影响蛋白质。在第2类和第5类中，鉴定出9个蛋白质。9个蛋白中有5个与EMT相关，分别为ID1262: SODM、ID998: ROA2、ID714: NAMPT、ID271: GDF10、ID811: GSHB。其中，从ID1262中鉴定出的SODM和从ID998中鉴定出的ROA2也分别从ID1217和ID1001中鉴定出。这说明在som和ROA2上存在不同的翻译后修饰。如上所述，som和ROA2均有诱导或促进EMT的报道。NAMPT是NAD的限速酶⁺最近有报道称，它可以促进EMT，独立于它的酶活性[20]。GDF10是TGF-β超级家族的一员，据报道可以抑制口腔鳞癌[21]中的EMT。在谷胱甘肽合成酶的GSHB上，有报道称GSHB的减少可以促进EMT，导致[22]纤维化。因此，所有5个EMT相关蛋白，SODM, ROA2, NAMPT, GDF10和GSHB都被认为是诱导或促进EMT的。

类别8和11的蛋白点被认为含有TNF-α信号通路中受layilin调节的蛋白质。在第8类和第11类的8个鉴定蛋白中，CIP4、CYTB、PRDX2和VIME 4个蛋白(50%)被报道与EMT相关。由于这4种蛋白均因layilin沉默而下调，我们认为这4种蛋白通过layilin被TNF-α上调。有报道称CYTB和PRDX2在EMT过程中被抑制或抑制EMT[19,23]。另一方面，据报道CIP4和VIME在EMT过程中增加或促进EMT[24,25]。

总的来说，在24个识别的蛋白斑点中，有15个(62.5%)被发现与emt相关。在这15个蛋白中，有10个蛋白与上述EMT的诱导或促进有关。在这里，layilin- silence上调了10个蛋白中的7个，同时下调了其余3个蛋白。类似地，16种蛋白质中剩下的5种与上述EMT抑制相关。在这里，layilin- silence下调了5个蛋白中的4个，同时上调了剩下的1个蛋白。因此，目前还不容易确定莱林对EMT的整体作用，尽管人们认为莱林与EMT有关。需要进一步的研究来阐明layilin在EMT和类EMT变化中的确切作用。

同样，在24个鉴定蛋白中，有15个(62.5%)被发现与emt相关。这一结果提示莱林在RA的发病机制中具有emt相关的作用。众所周知，RA患者的滑膜成纤维细胞具有高生长潜力和对软骨和骨[26]的高侵袭性。最近有报道称风湿性关节炎中滑膜成纤维细胞的这些特性变化与多种EMT标志物的上调有关[27,28]。因此，引起EMT的机制可能与滑膜成纤维细胞的特性改变有关，尽管滑膜成纤维细胞不是上皮细胞。

综上所述，本研究提示layilin深度参与了滑膜成纤维细胞中emt相关蛋白的调控。莱林在RA滑膜成纤维细胞中的作用应从EMT的角度进行研究。

确认

我们感谢横山MK女士和泽田Y女士的技术支持。

利益冲突陈述书

一个也没有。

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