微生物学和分子细胞生物学系，东弗吉尼亚医学院，诺福克，弗吉尼亚州，美国
微生物学和分子细胞生物学系，东弗吉尼亚医学院，诺福克，弗吉尼亚州，美国
微生物学和分子细胞生物学系，东弗吉尼亚医学院，诺福克，弗吉尼亚州，美国
糖尿病和代谢性疾病中心，儿科;印第安纳大学医学院，印第安纳波利斯，美国
糖尿病和代谢性疾病中心，儿科;印第安纳大学医学院，印第安纳波利斯，美国
微生物学和分子细胞生物学系，东弗吉尼亚医学院，诺福克，弗吉尼亚州，美国
DOI: 10.15761 / IMM.1000367
炎症是导致糖尿病的β细胞破坏的主要因素。炎症信号产生的活性氧(ROS)促进β细胞功能障碍。ros生成酶NADPH氧化酶-1 (NOX-1)的破坏为β细胞提供了保护。NOX-1的选择性小分子抑制剂(ML171或GKT137831)对NOD小鼠具有保护作用。与对照组相比，短时间(4周)给药NOX-1抑制剂可减少NOD小鼠向糖尿病的转化。胰岛形态的组织学分析显示，给予NOX-1抑制剂的小鼠白细胞组织主要局限于胰岛周围区域，与此相反，在载药对照组小鼠中，白细胞主要侵犯胰岛。这些数据支持抑制NOX-1在糖尿病中的治疗潜力，并提示NOX-1在炎症细胞、β细胞和胰岛细胞外基质完整性之间的相互作用中发挥作用。
炎症，糖尿病，β细胞功能，NADPH氧化酶-1，活性氧，小分子。
糖尿病是一种复杂和多方面的疾病。世界上越来越多的人口受到糖尿病及其慢性并发症的影响，预计在未来30年内其患病率将增加50%。糖尿病的主要潜在病因是β细胞衰竭和β细胞团丧失功能。相对于其他细胞，β细胞对活性氧(ROS)持续升高很敏感[1-3]。炎症导致β细胞功能障碍。β细胞和原代胰岛暴露于炎症介质会导致ROS升高，同时β细胞功能丧失[4-7]。NADPH氧化酶1 (NOX-1)是β细胞中ROS的细胞来源，由炎症细胞因子诱导[8-10]。
NOX-1的选择性小分子抑制阻断β细胞系和胰岛[8]中炎性细胞因子诱导的ROS。在同种小鼠β细胞系和小鼠或人原发性胰岛[8]中，选择性抑制NOX-1使β细胞免受炎症细胞因子的破坏作用。过表达的NOX-1导致β细胞功能障碍，而敲低NOX-1保护和保存暴露于炎症因子[11]的β细胞。抑制NOX-1是一种保留β细胞功能的候选策略。在本研究中，在糖尿病动物模型中已经开发了概念验证数据。结果显示，NOD小鼠的糖尿病发展具有保护作用，并支持抑制NOX-1对糖尿病的治疗潜力。
道德
相关机构监管委员会审查和批准了议定书和程序
细胞系
小鼠β细胞系βTC-3细胞在37°C在5%的CO中2/使用标准介质(Life Technologies, Grand Island, NY)的潮湿大气，如前所述[12]。人类供体胰岛来自非糖尿病供体(Prodo Laboratories Inc.， Aliso Viehio, CA)。
ROS测量
用种特异性细胞因子(PIC: 5ng/mL IL-1β， 10ng/mL TNF-α， 100ng/mL IFN-γ;研发系统，明尼阿波利斯，MN) 4小时。在PICs前30分钟加入NOX-1抑制剂(ML171或GKT137831)。处理后，用10μ m 6-羧基-2,7 ' -二氯双氢荧光素二乙酸酯(乙氧基甲酯)测定活性氧(ROS)，如先前报道的[10];DCF-DA(生命技术)。
葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)
如[8]中所述，对人类供体胰岛进行GSIS评估。按照制造商的说明，采用ELISA (Mercodia, Winston Salem, NC)测定胰岛素。
复合等离子体半衰期
血浆样品中的化合物含量由新泽西州西考克斯的front Laboratories Inc.使用LC-MS/MS进行测定。CD-1小鼠腹腔注射NOX-1抑制剂30mg/Kg。对于每种化合物，每个时间点注射3只老鼠。分别于注射后0.25、0.5、1、2、4、8、12小时收血入肝素管。血浆样品被冷冻并送往前沿实验室进行分析和半衰期计算。
点头的研究
雌性NOD/ShiLTJ (NOD)小鼠购自Jackson Laboratories。根据机构动物护理和使用委员会批准的协议，所有小鼠在印第安纳大学医学院实验动物资源中心保持在无病原体的条件下。小鼠被随机分配到每个队列(每组23只)。化合物是盲(编码)提供的。从6-10周龄开始，每天腹腔注射30mg/Kg(200µl)的NOX-1抑制剂，溶解于7:1:1:1:PEG200:cremophor:乙醇:水或载药单独。每周使用AlphTrak血糖计(Abbott实验室，Abbott Park, IL)进行血糖测量。在各自的研究结束时，对小鼠实施安乐死，收集血清，收集胰腺。在每一组中，由于健康问题，小鼠被提前从研究中移除;控制，一只鼠标;GKT137831，小鼠两只; ML171, four mice. The health issues did not appear to be related directly to the compound(s) as the other mice remaining in the study that received compound presented no adverse events. Administration of treatments (vehicle and compound in vehicle) was by daily intraperitoneal injection, this is the likely source of health issues.
组织学
胰腺固定于10%福尔玛林(Fisher Chemicals, Fair Lawn, NJ)和石蜡包埋，制备7µM系列切片，并用H & E染色(AML实验室，Jacksonville, FL)。在显微镜分析中，每只小鼠的三个不重叠的胰腺切片进行分析。在这些部分中所出现的所有岛屿都被捕获并显示了代表性图像。使用DP-70相机和BX-51奥林巴斯显微镜(奥林巴斯，Center Valley, PA)在20倍物镜下拍摄图像。
数据分析
体外实验至少重复三次。学生的t检验或单因素方差分析(Prism 7.0;使用Graph-Pad Software, La Jolla, CA)来确定统计学显著性(95% CI和p< 0.05)。
目前的糖尿病治疗方案无法治愈，也没有解决糖尿病的根本原因——β细胞衰竭。炎症和由此产生的促炎细胞因子升高已被确认为β细胞功能丧失的重要原因;人胰岛在体外短暂暴露于炎症细胞因子会导致β细胞衰竭[13]。炎症细胞因子提高β细胞中的活性氧(ROS)，这些细胞高度容易受到氧化应激[1]。这种β细胞ROS的来源是NADPH氧化酶-1 (NOX-1)活性。NOX-1在驱动β细胞功能障碍中的关键作用已在保护β细胞的化学抑制剂和NOX-1基因缺失的研究中得到证实[8,11]。此外，直接过表达NOX-1促进β细胞功能障碍的状态，类似于炎性细胞因子刺激[11]。这些数据表明，抑制NOX-1是在持续炎症环境中保持β细胞功能的候选治疗策略[9]。
吩噻嗪化合物ML171是一种NOX-1抑制剂，对β细胞提供显著的保护，使其免受炎症细胞因子[8]的破坏作用。当胰岛或β细胞受到炎症细胞因子的挑战时，这种NOX-1抑制剂阻止ROS的产生并保留β细胞的功能。第二类结构的分子吡唑洛吡啶二酮已被确定为NOX-1和NOX-4[14]的有效双特异性抑制剂。评估了ML171(吩噻嗪)和GKT137831(吡唑洛吡啶二酮)抑制β细胞功能障碍和ROS产生的活性(图1)。在均质β细胞系中，βTC3、炎症细胞因子(PIC)使ROS增加了105%。相比之下，包含PICs的ML171或GKT137831分别阻断了78%和80%的炎症诱导ROS (p< 0.01)。为了评估β细胞的功能，我们测量了人类供体胰岛中葡萄糖刺激的胰岛素分泌(图1)。当葡萄糖从低升高到高(3到16.7mM葡萄糖)时，β细胞被刺激分泌胰岛素。暴露在炎症细胞因子下，这种功能反应缺失，导致葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)的损失。当胰岛暴露于PIC时，GKT137831加入到保持β细胞功能的人类供体胰岛中，从低(L)到高(H)葡萄糖过渡时，胰岛素分泌保持增加(图1)。在人类供体胰岛中与ML171保持相同的GSIS之前已发表[8]。GKT137831的新结果表明，小分子抑制NOX-1可以保留β细胞功能。GKT137831是一种双特异性的NOX-1/NOX-4抑制剂，并没有排除NOX-4的作用，但已有大量数据证实，在保存β细胞时，删除NOX-1是必要的，也是充分的[8,11]。
图1所示。NOX-1抑制剂阻断炎症因子诱导的ROS生成和GSIS解偶联。A，在NOX-1抑制剂ML171或GKT137831不存在或存在的情况下，用炎症因子(PIC)处理的βTC3 β细胞中ROS的生成(通过ddf - da的转化测定)。B，葡萄糖刺激胰岛素分泌的人供体胰岛暴露于低(L) 3mM葡萄糖或高(H) 16.7 mM葡萄糖与炎症细胞因子处理，GKT137831的存在或不存在。数据显示相对于控制(Ctrl)响应和来自三次实验。*， **/## =p<0.05, 0.01 rep .;# =控件的比较
这些数据强调了当胰岛暴露于炎症因子时，NOX-1在介导β细胞功能障碍中的关键作用。重要的是，该研究介绍了抑制NOX-1在糖尿病中的治疗潜力。为了推进这些化合物的概念验证研究在活的有机体内研究已经进行了评估。
NOD小鼠是1型糖尿病的原型小鼠模型。该模型是一种遗传近交系，雌性小鼠有发展炎症介导的β细胞破坏和高血糖[15]的倾向。NOD小鼠模型与人类1型糖尿病非常相似，在很大程度上受遗传易感性的驱动，但也受环境因素的影响。例如，在一个群体中，并不是所有的雌鼠都会患糖尿病。不同研究机构之间的糖尿病转换率在发生高血糖的年龄和菌落转换率方面都有显著差异。这种机构差异即使发生在NOD小鼠从相同的供应商和运输到不同的研究所(数据未显示)。在本报告中，年轻NOD小鼠来自Jackson实验室，并在印第安纳大学糖尿病和代谢性疾病中心进行研究，其中雌性NOD小鼠在12周开始有强健和可靠的高血糖转化(70 - 85%)。
对一系列辅料及其组合的探索确定了化合物在PEG200中1.5mg/ml的稳定溶解度:Cremaphore EL;乙醇;ddH20(7:1:1:1)。BL6小鼠急性给药剂量逐渐增加至30mg/Kg，未见不良反应。随后，小鼠每天以最大剂量(慢性暴露)给药5天，并监测后续两周，未观察到不良反应(未显示)。没有关于ML171全身给药的报道数据。化合物GKT137831已在系统性研究中报道，并被证明对口服[16]具有良好的耐受性。研究了化合物的药代动力学特性与所选择的腹腔内给药途径。ML171和GKT137831的计算半衰期分别为2.58小时和4.79小时，两者都达到了高于复合IC的持续血浆浓度5030mg/Kg复方给药后持续2小时或更长时间。
在临床前分析中，NOD小鼠从第6周开始每天服用化合物或对照剂，并持续4周。23只老鼠被随机分配到每组。每组3只小鼠在第10周捕获。从第10周开始，每周监测每只小鼠的血糖水平，直到研究结束，这是当小鼠被分类为糖尿病(定义为，连续两次血糖读数≥250mg/dl)或25周时。
如图2所示为每组糖尿病发病率(图2):对照组(仅车辆)和复方治疗组。从6周龄开始，每天腹腔注射NOX-1抑制剂(GKT137831和ML171)的队列与仅接受等量对照对照的队列相比，糖尿病发生率有明显的差异。
图2。抑制NOX-1可以减少NOD小鼠的糖尿病转化。糖尿病发病率相对于小鼠年龄显示为每个队列(每组n=20入选)。每组另外3只小鼠在第10周进行研究。小鼠每天服用30mg/Kg的复方制剂，持续四周(6-10周)。本研究中分析和呈现的代表性年龄标记为(菱形)
这些数据表明，短的四周预防性暴露于NOX-1抑制剂可以减少NOD小鼠的糖尿病转化。为了提供组织学证据支持这一临床前结果，在研究过程中对小鼠的胰腺进行了研究。
对每组小鼠在10(10)、20(20)和25(25)周的胰腺进行组织学分析。
在10周龄时，对胰岛进行检查，以寻找对胰岛形态和结构的复合相关影响的证据(图3)。其次，寻找早期炎症发展的证据，以支持1型糖尿病模型的正常发展。正在测试的假设是通过抑制NOX-1来保护正在进行的炎症中的β细胞。第10周开始出现炎症的证据将有助于排除化合物对免疫激活的“脱靶”效应;这是糖尿病模型发展的核心过程。胰岛形态(上图)未因复合用药而改变(图3)。浸润的淋巴细胞(下方的开放箭头)显示早期炎症。炎症细胞的存在表明NOD模型下的免疫成分没有被化合物的使用所破坏。
图3。糖尿病前期(10周)NOD小鼠的组织学。载药对照小鼠(a,d)和给予GKT137831 (b, e)或ML171 (c, f)的小鼠的苏木精和伊红染色胰腺切片图像。胰岛位置标记(黑色箭头)。在代表性切片(d-f)中发现早期炎症细胞浸润，并标记(开箭头)。每只老鼠的三个不重叠的胰腺切片(每组n=3个)的分析中捕获的所有胰岛图像都具有代表性。
在研究中，小鼠在糖尿病发病时被采集。因此，在第25周之前分析的所有小鼠都出现了糖尿病(图2)。由于β细胞的损失，这些小鼠可能出现明显的炎症浸润，并出现大量的胰岛浓缩。研究中的小鼠在11周大时开始转变为糖尿病，并一直持续到研究结束。为了尽量减少由于年龄的变化，本报告将重点关注在20周龄时出现糖尿病的小鼠和在25周龄时无糖尿病的小鼠(研究终点)。
在20周龄时，胰腺切片含有炎症浸润，因此支持免疫介导的糖尿病发病。随着β细胞破坏的进程，胰岛的整体大小收缩，形成更小的胰岛。持续的β细胞攻击与显著的免疫细胞参与有关。在所有三个队列中，20周龄的糖尿病小鼠出现了典型的β细胞破坏的凝集胰岛结构，如图4的上面板所示，并以开放的绿色箭头标记。图4中还可见有活性免疫浸润的胰岛。值得注意的是，在复方治疗组胰岛表现为炎性细胞在胰岛周围(或晕)排列。这与对照组(灌药治疗)小鼠相反，对照组的活动性胰岛炎症吞噬(侵入)大部分胰岛。
图4。糖尿病(20周)和非糖尿病(25周)NOD小鼠的组织学。载药对照小鼠(a,d,g,j)和注射GKT137831 (b,e,h,k)或ML171 (c,f,i,l)的血氧素和伊红染色胰腺切片图像。面板显示有代表性的图像来自20周的糖尿病小鼠(a-f)和25周的非糖尿病小鼠(g-l)。标注了小岛的位置(黑色箭头)。糖尿病小鼠的浓缩胰岛在代表性切片(a-c)中被识别，并标记(开箭头)。在分析每只老鼠的三个不重叠的胰腺切片时，图像代表了捕获的所有胰岛
在25周大的时候，在研究结束时，对小鼠的胰岛进行检查。这些小鼠未达到糖尿病发病标准(血糖≥250 mg/dl)。胰腺切片检查显示保留的“正常”胰岛，如图4顶部所示。在25周时，也观察到与早期炎症相关的胰岛，如图4的底部所示，未观察到凝结的胰岛。对照组的胰岛炎症比用化合物治疗的小鼠更严重。在复方治疗的小鼠中观察到炎症细胞出现在胰岛周围。在对照组中，有一只没有患糖尿病的老鼠血糖读数为129。每个复方治疗组有5只小鼠无糖尿病。GKT137831血糖范围为95 ~ 210 mg/dl, n=5; ML171血糖范围为124 ~ 228 mg/dl, n=5。
总之，本研究的结果有助于支持对抑制NOX-1在糖尿病中的效用的概念验证评估。广泛的在体外而且体外数据显示，NOX-1激活在介导炎症驱动β细胞功能障碍中的重要性[8,9,11,17,18]。全身给药NOX-1抑制剂在小鼠中是耐受的，并能达到高于在体外集成电路50对于化合物。NOD小鼠在糖尿病前期短暂暴露于化合物中，可减少转化为糖尿病。这种临床前观察在胰腺的组织学评价中得到支持。这些数据证明了更多持续暴露于NOX-1抑制剂的研究是有必要的。重要的是，复方给药对糖尿病模型中胰岛的整体表现、形态或炎症机制的启动没有影响。这是考虑到系统性给药NOX-1抑制剂可能有“脱靶”作用并破坏免疫功能。所有研究组在第10周出现炎症浸润，支持模型的潜在机制被保留，并有助于排除对临床前结果的这种琐碎解释。
在第20周和第25周接受NOX-1抑制剂治疗的小鼠的胰岛与对照组相比有显著的不同。虽然在注射了NOX-1抑制剂的小鼠中存在炎症细胞，但在注射了该化合物的小鼠中，炎症细胞主要集中在胰岛周围区域，而在对照组中，炎症细胞浸润了整个胰岛。胰岛被包裹在由基底膜和间质基质组成的细胞外基质中。在1型糖尿病的发病过程中，白细胞从胰岛周围的毛细血管外渗，免疫细胞向胰岛周围区域迁移和积累，胰岛包膜的ECM破裂，白细胞侵入胰岛，最后β细胞破坏[19]。Korpos和Sorokin等人已经证明了胰岛周围包膜中ECM成分的丢失是导致白细胞入侵胰岛并引发[20]糖尿病的先决条件。在炎症反应中，β细胞通过上调通路和分泌因子积极响应[6,21]。这种串扰可能是ECM完整性丧失的一个重要环节[19,22,23]。抑制NOX-1似乎破坏了串扰，从而导致胰岛周围ECM的分解，从而将炎性白细胞限制在胰岛周围区域，减少糖尿病转化。胰岛周围ECM完整性的丧失与糖尿病发病率直接相关，突出了抑制糖尿病中NOX-1的治疗潜力。
本研究得到了联邦卫生研究委员会(274-03-15)和联邦研究商业化基金(MF16-019-LS)的资助。这项工作利用了美国国立卫生研究院向印第安纳大学医学院拨款P30 DK097512支持的核心服务。