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收稿日期:2019年3月1日
接受日期:2019年3月15日
出版日期:2019年3月25日
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©2019 Yoon H.这是一篇开放获取的文章,根据创作共用署名许可条款发布,该条款允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制,前提是注明原作者和来源。
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Yoon H(2019)培养人多能干细胞的培养基、细胞外成分及分化。Integr Mol Med 6 DOI: 10.15761/ im .1000361
干细胞研究中心,鸭鸥亭奇迹医院,韩国
干细胞研究中心,鸭鸥亭奇迹医院,韩国
DOI: 10.15761 / IMM.1000361
人多能干细胞(hPSCs)的培养对于实验需求或临床应用是必要的。人类干细胞培养与哺乳动物体细胞培养有许多相同的标准。由于培养中的细胞暴露在与活体不同的环境中,细胞本身倾向于适应和适应文化条件。特别是hPSCs是具有多能性和再生能力[1]的动态细胞,容易受到外界病原体或培养环境的影响。此外,在长期培养过程中保持未分化状态而不丧失再生能力或多能性的方法可能会影响细胞的特性,导致hpcs的真实性和稳定性的改变。hPSCs培养过程中的定性评估包括纯度、活力、形态外观、一致性(贴壁细胞覆盖培养皿表面的百分比)、功能、污染和交叉污染、真实性、分化状态和遗传稳定性[1]的鉴定。其中,培养hPSCs的关键要素是细胞系的真实性、无菌性和稳定性[1,2]。
我们讨论了包括支原体在内的细菌和病毒的污染,以及培养期间细胞真实性和稳定性的变化。
病原体(如细菌、病毒、酵母和其他真菌)可以消灭细胞,并引起临床风险。除了明显的污染外,生长缓慢的微生物,或者对抗生素有耐药性的微生物,可以无形地影响细胞,改变细胞的特性,扭曲实验结果[1,3]。在整个培养过程中,保持细胞或组织的无菌性是至关重要的。HPSCs尤其敏感,因为它们通常在不含抗生素和抗真菌药物[4]的富营养化培养基中培养。在储存或处理[5]之前,培养的细胞应检查支原体、细菌、真菌、牛病毒、猪病毒和人病毒病原体。如果细胞被污染,应立即丢弃,最好将可能接触到的培养箱中的细胞丢弃。只有当培养的细胞不可替换时,才能在不处理细胞系的情况下去除污染,并应在严格的检疫[4]下处理。
支原体是最常见的引起培养细胞感染的细菌。这些胞内原核微生物一般比细菌小。
对抗生素的耐药性:支原体对包括青霉素在内的常见抗生素具有耐药性,因为它们缺乏细胞壁[2]。
通过灭菌过滤渗透:支原体可通过标准过滤器(> 0.1µm,通常为0.22µm),特别是在较高的压力速率下[2]。
感染检测困难:此外,该菌繁殖时不干扰细胞生长,不使培养基混浊,不改变培养基[4]的pH值。
支原体的有害影响包括增殖特性(生长、活力)的改变、细胞形态的改变、遗传的不稳定性、表型的改变、转化、生理功能的改变、细胞代谢的改变、细胞膜抗原性(表面抗原和受体表达)的变化,病毒易感性(病毒繁殖的增加或减少),细胞死亡,细胞病变效应,如斑块形成,总培养变性,对凋亡的敏感性增加,淋巴细胞激活的诱导或抑制,诱导或抑制细胞因子的表达和各种生化检测的干扰[2,4,6]。
支原体污染的常见来源是来自其他支原体阳性细胞培养的细胞系的交叉污染、研究人员、非灭菌试剂、实验室设备、N2低温保存容器液体和实验动物[2]。污染培养试剂、新细胞系带入实验室和实验室工作人员是主要来源m . orale,m . fermentans,m . hominis污染。这些来源占支原体污染的一半以上。m . arginini可通过血清(胎牛血清、新生牛血清)[4]引起细胞培养污染。
虽然微生物培养被认为是金标准,但由于微生物培养的持续时间是28天或更长[2],已经开发了替代方法。支原体检测的常用方法包括酶促法、聚合酶链反应(PCR)、选择性培养基培养和检测细胞DNA染色等。商业试剂盒(包括real-time PCR)可以检测到大部分支原体,特异性非常高,在2 - 3小时内产量[2]。在2013年的调查中,只有25%的实验室进行了支原体检测,一些科学杂志要求完成支原体检测以发表[7]。
据报道,15% ~ 88.7%的培养细胞被支原体感染,在首次发现[2]后感染率没有明显下降。
培养基变化及检测:感染的培养基通常浑浊,表现为培养基pH急剧下降。但是,如果污染不严重,则可能无法通过肉眼观察判断污染程度。在低分辨率显微镜下,细菌看起来像在细胞间移动的小颗粒。
感染来源:细菌污染可能通过水浴、冰箱、水槽和研究人员发生。
预防:防止细菌污染最有效的方法是无菌技术,使用II类生物安全柜(BSC II)和保持细胞培养实验室环境[8]的清洁。在细胞系的衍生过程中,培养基中使用抗生素可能是必要的。但不建议在细胞库或培养中常规使用,因为它会影响细胞生理,导致错误的安全感[2]。
特点:病毒体积小,是细胞培养过程中最难检测的污染物。病毒引起培养细胞特性的改变。这包括在不产生感染性病毒颗粒的情况下在DNA和RNA水平上表达病毒序列,利用宿主细胞资源进行病毒复制,并整合到培养细胞的基因组中进行病毒复制[9]。
有害作用:病毒可以在不杀死细胞的情况下破坏细胞或引起长期亚致死感染。被血液传播病毒污染的培养细胞会造成严重的身体风险。牛血清伴牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染培养的细胞,使细胞生长缓慢,但在显微镜下难以检测。具有免疫能力的人对BVDV不敏感。在细胞培养中检测的常见病毒病原体有:丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、人类嗜t淋巴细胞病毒I/II、eb病毒、人类巨细胞病毒、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒和人类疱疹病毒。
感染来源:病毒污染来源包括细胞系、不能灭菌的动物源性培养试剂(特别是胰蛋白酶和血清)、抗体、原代培养物(如小鼠胚胎成纤维细胞)和操作者[10,11]。
计划培养的细胞系可能通过交叉污染(感兴趣的细胞培养被其他细胞系污染,并由错误识别或错误标记取代)转变为其他细胞系。细胞系的真实性或身份的检查是最低质量控制系统的一个关键组成部分。
历史:细胞系的真实性问题与错误标记、交叉污染和其他细胞过度生长有关,可追溯到20世纪60年代[3]。已经发现许多细胞系在研究人员不知道[11]的情况下被调换或交叉污染成HeLa细胞。仅仅是[12],就可能需要几十年的时间来解决已经发表的关于错误识别或污染管线的任何问题。
背景与结果:研究人员对同时生成多个hPSCs系的要求非常高。细胞交叉污染、鉴定错误的细胞系以及使用高传代培养细胞可能导致实验或临床误导性结果[13]。
发生率:一般情况下,18-36%的细胞系被证明是错误的[13]。研究表明,捐赠给公共储存库的细胞株中,多达30%的细胞株受到了细胞类型的污染,这些细胞类型在原始细胞株之外迅速增殖,如HeLa细胞[11]。根据怀特赛兹的一项研究et al。9%的受访者在不知情的情况下使用了海拉污染物,但这一数字可能也被低估了,因为只有三分之一的受访者检测了细胞身份。尽管如此,香农et al。[7]报道,只有46%的研究人员测试了细胞系的真实性。
鉴定时间:当怀疑细胞交叉污染时,至少在从外部获得的细胞系用于[4]实验之前,需要对细胞系进行鉴定。
方法:将获得的细胞系与原分离细胞系的特性进行比较,进行细胞系鉴定。目前已提出了许多检测方法:染色体分析/核型分析、同工酶分析、多位点DNA指纹分析、短串联重复序列分析、聚合酶链反应片段分析和“DNA条形码”区域[2]测序。基因分型可以区分每个细胞系中的小遗传变异[2].DNA分型利用基于pcr的技术,通过DNA指纹分析分析相似的高多态性DNA序列[15].国际干细胞库计划(ISCBI)建议使用核心13个基因座进行干细胞鉴定,但不提供具体数目的基因座[1].目前,短串联重复序列(Short Tandem Repeats, STR)分析是细胞系鉴定的参考方法[2].
细胞系稳定性是指在细胞培养过程中保持原有的细胞特性。由于选择性压力和遗传漂变,细胞株在长期培养的情况下,其原有的功能可能发生改变或消失,导致与原细胞[13]的特性不同。此外,iPSCs在增殖过程中可以自发分化(部分或完全),有利于这种异质性。
不稳定的原因:核型不稳定的原因可能包括长期培养、传代过程中的胁迫以及原始hPSCs的性质(基因型或表观遗传变异)[4]。hPSCs的基因型或表观遗传变异可能源于供体细胞固有的变异、重编程过程中诱导的变化或培养传代过程中的积累。细胞的表观遗传记忆可以说是在不改变DNA序列的情况下对DNA进行修饰的集合,遗传修饰可以改变基因的表达,从而改变细胞[13]的性质和行为。此外,细胞中的基因突变有时会促进细胞的生长,并可能变成异常细胞。有证据表明,遗传机制的改变可能赋予了异常群体的生长优势,产生了这些细胞的选择优势,并影响了细胞群体的同质性[16]。
如果干细胞要用于再生治疗,保持干细胞处于未分化状态是很重要的。然而,干细胞的核型畸变可以被诱导,使细胞在长时间传代中保持稳定状态,这增加了恶性转化的可能性,同时随着自我更新细胞对其培养条件的逐步适应[6]。基因操作可以改变人造血干细胞的特性。细胞的特征必须在基因操作前后进行,以识别任何可能发生的有害变化。
试验:ISCBI指南推荐细胞g显带用于细胞库,以鉴定细胞系的稳定性[5,17]。更高分辨率的基因组方法,包括比较基因组杂交(CGH)微阵列,单核苷酸多态性(SNP)阵列和全基因组测序可以使用[18]。然而,这些更高分辨率的基因组方法提供了大量的数据,但有局限性,因为很难知道分析的信息具体如何影响细胞稳定性[19]。虽然体内畸胎瘤试验已被公认为确认人乳头细胞干细胞多能性的金标准,但由于缺乏明确的临床意义、缺乏方法的可靠性和高费用[20],它可以被体外胚胎体(EB)试验取代。建议每5-10代检查细胞系的遗传稳定性。培养用于治疗患者的PSC应仔细检查突变和核型改变可能导致肿瘤形成。
简短的沟通
收稿日期:2019年3月1日
接受日期:2019年3月15日
出版日期:2019年3月25日
©2019 Yoon H.这是一篇开放获取的文章,根据创作共用署名许可条款发布,该条款允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制,前提是注明原作者和来源。
Yoon H(2019)培养人多能干细胞的培养基、细胞外成分及分化。Integr Mol Med 6 DOI: 10.15761/ im .1000361
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