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摘要

先前的研究表明，小麦胚芽凝集素(WGA)和菜豆凝集素(PHA)能够诱导血小板活化。由于内皮型一氧化氮合酶(eNOS)/一氧化氮(NO)/可溶性鸟苷环化酶/cGMP/cGMP依赖性蛋白激酶(PKG)途径是血小板抗聚集的主要机制之一，我们测试了WGA或PHA对该途径的影响。研究表明，WGA处理的血小板不产生NO，而PHA刺激NO的产生具有剂量和时间依赖性。研究发现，PHA诱导NO形成的增加依赖于eNOS的磷酸化/活化。Ca^{2 +}与STO-609和Compound C, Ca密切相关^{2 +}/calmodulin蛋白激酶激酶/AMP激酶抑制剂分别抑制PHA诱导的eNOS磷酸化。NO和cGMP升高的一个关键作用是PKG的激活，PKG可以磷酸化血管扩张剂刺激的磷蛋白(VASP)。结果发现，PHA对ser239和thr278上NO和cGMP的升高以及VASP的磷酸化均有明显的刺激作用，而STO-609和Compound C以及eNOS抑制剂L-NAME则对其有强烈的抑制作用。由此可见，PHA激活的CaMKK/AMPK通路可以通过刺激eNOS/NO/cGMP/PKG信号通路调节血小板活化。

关键字

CaMKK/AMPK通路，eNOS磷酸化/活化，人血小板，一氧化氮，菜豆凝集素，小麦胚芽凝集素

缩写

ACC: acetylCoA羧化酶;AKT:蛋白激酶B;AMPK: amp活化蛋白激酶;CaMKK: Ca^{2 +}/钙调蛋白激酶激酶;eNOS:内皮型一氧化氮合酶;LKB1:肝激酶B1;没有:一氧化氮;PHA:菜豆凝集素;PI3K:磷脂酰肌醇3激酶;PKA:蛋白激酶A;PKG:蛋白激酶G;PLC:磷脂酶C;VASP: vasodilator-stimulated磷蛋白质; WGA: wheat germ agglutinin.

简介

血小板活化参与止血和血栓形成。当血小板遇到因血管壁损伤而暴露的基质蛋白时，它们停留在暴露的内皮下表面，被激活，呈现形态改变，分泌颗粒内容物并聚集。抑制血小板聚集可通过阻断膜受体与细胞内信号通路的相互作用、干扰激活血小板的信使或增强生理血小板抑制剂(如内皮源性PGI2和一氧化氮(NO))的作用产生。这些化合物激活腺苷酸环化酶和鸟苷酸环化酶，分别导致cAMP和cGMP升高。这两种血小板环核苷酸的升高会干扰血小板活化信号通路，如细胞内Ca^{2 +}细胞骨架的提升和重组。

在人血小板中，NO的形成依赖于内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的激活。血小板eNOS现在很大程度上被认为是Ca^{2 +}ser1177和/或thr495残基的磷酸化/去磷酸化在其活性调控中起着至关重要的作用。ser1177位点的磷酸化激活eNOS，而thr495位点的磷酸化抑制[1]酶的活性。几种激酶调节eNOS磷酸化，包括amp活化蛋白激酶(AMPK)[2-4]。AMPK是一种代谢传感器，负责协调代谢和能量需求[5]。AMPK的α亚型在血小板中被凝血酶或内源性大麻素2-花生油基甘油刺激人类血小板激活。活化的AMPK磷酸化并抑制乙酰辅酶a羧化酶(ACC)， ACC被认为是AMPK活化的标志[6,7]。最近的研究表明，AMPK/ACC信号通路在胶原蛋白的作用下调节血栓烷A2和颗粒释放，从而影响血栓形成[8]。AMPK可以磷酸化eNOS的ser1177，在与细胞能量耗尽[9]相关的缺血条件下，发挥调节心肌细胞eNOS活性的作用。此外，AMPK还能磷酸化骨骼肌运动中的神经元NOS，调节胰岛素诱导的人血小板中eNOS的激活[10,11]。此外，AMPK通过磷酸化心肌细胞[12]中的神经元NOS产生氧化应激。

凝集素是一种蛋白质或糖蛋白，通常来源于植物，能够识别并结合复杂糖缀合物的碳水化合物部分，而不改变任何已知的糖基配体[13]的共价结构。小麦胚芽凝集素(Wheat胚芽凝集素，WGA)是一种谷物凝集素，特异于两种n -乙酰化糖，n -乙酰基- d-氨基葡萄糖和n -乙酰基- d-神经氨酸，并与唾液化细胞表面受体相互作用[14,15]。菜豆凝集素(Phaseolus vulgaris agglutinin, PHA)是一种分子量为120kDa的四聚体蛋白，对氨基葡萄糖、甘露吡喃基残基[16]具有糖特异性。

之前，我们已经证明了WGA和PHA都能够刺激血小板聚集，但其强度不同，WGA比PHA[17]更强。在这些研究中，我们测试了WGA和PHA对NO产生的影响。结果表明，PHA能诱导NO的形成，而WGA对NO的形成没有影响。此外Ca^{2 +}/calmodulin-dependent kinase kinase (CaMKK) b/AMPKa通路似乎主要参与eNOS磷酸化以及随后PHA诱导的NO升高，CaMKK的抑制剂STO-609和AMPK的有效可逆抑制剂复合物C显著降低eNOS的磷酸化/活化和NO的形成。

材料和方法

材料

抗p- vasp (thr278)，抑肽酶，apyrase, Colorburst™电泳标记，化合物C，洋地黄皂苷，Dowex AG 50W-X8, EGTA，白细胞肽，b-巯基乙醇，L-NAME, PGE1, PMSF，蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Cat。N°P8340)， staurosporine, STO-609, 96孔板(CostarÒ)，所有化学品均来自Sigma-Aldrich, USA。MK2206来自美国Selleck化学公司。抗p- enos (ser1177)、抗p-丝氨酸和抗p-苏氨酸抗体、凝集素(WGA和PHA)和LY294002购自德国默克Millipore公司。每次实验前，将LY294002、MK2206、Compound C和STO-609从DMSO溶液中立即用盐水稀释。OxiselectÔ一氧化氮测定试剂盒(Cat;N°STA-802)来自Cell Biolabs, Inc。美国。cGMP EIA试剂盒(Cat。N°900-164)来自美国试验设计公司。 L-[2,3,4,5-^3.H]精氨酸来源于美国PerkinElmer Life and Analytical Sciences, USA。抗p- acc (ser79)、抗p- ampka (thr172)、抗p- vasp (ser239)、抗lkb1、辣根过氧化物酶结合二抗和抗b-actin购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。ECLÒ系统来自美国GE医疗。硝化纤维素膜(孔径0.45 μ m)产自美国Bio-Rad实验室。

采血和准备程序

从热那亚“Centro Trasfusionale, Ospedale San Martino”健康志愿者新鲜抽取的静脉血收集到130 mM柠檬酸三钠抗凝血溶液中(9:1)。这些献血者声称，在采血前的两周内，他们没有服用已知会干扰血小板功能的药物，并给予了他们的知情同意。用100´g全血离心25 min，制备洗净的血小板。在得到的富血小板血浆(PRP)上加入4 mU/mL的apyrase和4µM PGE1。然后PRP在1100´g条件下离心15分钟。颗粒用pH 5.2 ACD溶液(75 mM柠檬酸三钠，42 mM柠檬酸和136 mM葡萄糖)洗涤一次，1100´g条件下离心15分钟，然后在Ca中重悬^{2 +}无HEPES缓冲液包含145mm NaCl, 5mm KCl, 1mm MgSO4, 10mm葡萄糖，10mm HEPES (pH 7.4)。

亚硝酸盐+硝酸盐(NOx)的测量

洗涤血小板(1.0×10⁹血小板/mL)，在37°C盐水中预孵育，在100 μ M l -精氨酸的存在下，用凝集素进行刺激。在其他实验中，洗净的血小板(1.0×10⁹分别用生理盐水、M L-NAME、M STO-609、M Compound C、M LY294002、M MK2206、M Compound C、M LY294002、M Compound C、l -609、M Compound C、M LY294002、M MK2206、M Compound C、l -609、M Compound C、M LY294002、M Compound C、l -609、M Compound C、M LY294002、M MK2206分别用10µg/mL PHA处理120秒。按照商业试剂盒的说明书，在96孔板上用iMarkÔ微孔板阅读器(Bio Rad实验室)分光光度法测量NOx含量，测量波长为540 nm。

cGMP化验

洗涤血小板(1.0×10⁹血小板/mL)在37℃用生理盐水预孵育，然后在100 μ M l -精氨酸的存在下用凝集素刺激。在其他实验中，洗净的血小板(1.0×10⁹血小板/毫升)与盐水preincubated 500µM L-NAME 10µM sto - 609, 10µM C化合物,20µM LY294002或20µM MK2206然后挑战10µg / mL PHA,持续120秒。反应是停止的冷高氯酸(2米)。沉淀蛋白质被离心法在12000×g在4°C 2分钟。得到的上清液，用2m NaOH中和后，立即使用cGMP特异性EIA试剂盒根据制造商的规程进行分析。

磷蛋白的免疫印迹分析

在评估PHA剂量依赖效应的实验中，洗净的血小板(1.0´10⁹血小板/mL)，用生理盐水预孵育，用浓度增加的凝集素刺激120秒。当评估时间依赖性时，用10µg/mL PHA刺激血小板。在其他实验中，清洗过的血小板(1.0×10⁹血小板/mL)， 37℃盐水预孵育10µM STO-609、20µM LY294002、20µM MK2206或10µM Compound C，用10µg/mL PHA刺激120秒，加入2×Laemmli-SDS还原样品缓冲液停止孵育。样品在100℃下加热5 min，用5-10% SDS-PAGE分离，转移到硝化纤维素膜上。在Colorburst™电泳重量标记的情况下进行测试。在37°C条件下，用5% BSA (Tris缓冲盐水，pH 7.6，含10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)阻断印迹30分钟，然后在4°C条件下与抗-p- acc (ser79)，抗-p- ampka (thr172)，抗-p- enos (ser1177)，抗-p- vasp (ser239)或抗-p- vasp (thr278)(1:500稀释)抗体孵育过夜。膜广泛洗涤和培养60分钟在室温与辣根过氧化物酶结合的二抗。在进一步洗涤后，使用ECLÒ系统产生印迹。用62.5 mM Tris/HCl (pH 6.7)、2% SDS、100 μ M β-巯基乙醇在50℃下孵育30 min，然后用抗-肌动蛋白重新探针。带密度报告为相对于对照的折叠变化，归一化为b-actin，由Bio-Rad Chemi-Doc软件包直接定量。

以挪士活动分析

通过评价L-[^3.H] L -精氨酸(^3.H]瓜氨酸，根据适合人类血小板[18]的方法。简单地说，洗净血小板的等分(1.0´10⁹血小板/mL)，用生理盐水在37°C预热，用1个Ci L-[^3.H]精氨酸。在抑制作用被确定的实验中，洗过的血小板(1.0×10⁹血小板/mL)， 37℃盐水预孵育，M L-NAME 500µ、M STO-609 10µ、M Compound C 10µ、M LY294002 20µ或M MK2206 20µ，用10µg/mL PHA处理120秒，冷冻后停止孵育。然后用2000xg离心制粒血小板4分钟。超声后，将血小板裂解液与Dowex AG 50W-X8 (Na⁺-形式)吸收L-精氨酸和L-[^3.H]用液体闪烁计数法(Packard Instruments)测定上清液中的瓜氨酸。

免疫沉淀反应

洗涤血小板(1.0×10⁹血小板/mL) 37℃盐水预热，10µg/mL PHA孵育。加入等体积的裂解液(0.5% SDS、1% Triton X-100、0.75%脱氧胆酸钠、10 mM EDTA、1 mM PMSF、50 mM NaF、200 μ M Na)停止孵育_3.签证官₄白细胞介素100 μ g/mL，抑肽酶100 μ g/mL，西曲霉素10 μ g/mL，蛋白酶抑制剂鸡尾酒10 mL/mL)。裂解液经简单离心后，用1.0 μ g抗lkb1抗体在4℃下处理2 h。蛋白g -琼脂糖快速沉淀免疫复合物。冷冻60分钟后，用1.0 ml IP-wash 1 (10 mM pH 7.4 Tris/HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100)洗涤样品，然后用IP-wash 2 (10 mM pH 7。Tris/HCl, 750 mM NaCl, 0.5% Triton X-100)，最后用ip洗1。用100µL 2×Laemmli-SDS还原样品缓冲液提取样品，80°C加热10 min, 5-10% SDS-PAGE解析。将蛋白质转移到硝化纤维膜上，用5% BSA在37°C溶解于TBST中30分钟阻断印迹，在4°C与抗对丝氨酸或抗对苏氨酸抗体(1:500稀释)孵育过夜，处理方法如上所述。最后，按照上述方法剥离印迹，并用anti-LKB1进行重测。

统计分析

数据为至少四次独立实验的平均值±标准差，每次实验一式两份。两组间采用未配对学生t检验进行统计学比较。多组比较采用双向方差分析和Tukey事后检验。p<0.05为差异有统计学意义。

结果

PHA和WGA对NOx和cGMP生成的影响

用PHA处理血小板可导致显著的NO生成。凝集素效应与剂量和时间有关。PHA的峰值为10 mg/mL(图1A)， 120秒后达到最大值，并维持5分钟(图1B)。相反，WGA不改变基础NO水平(图1A和图1B)。NO通过鸟苷酸环化酶的活化刺激cGMP的形成。因此，我们测量了凝集素对cGMP产生的影响。经PHA处理的血小板中cGMP水平显著升高，而经WGA处理的血小板中cGMP水平不升高(图1C和1D)。PHA效应是剂量依赖性的(图1C)和时间依赖性的(图1D)。PHA诱导的cGMP升高与NO升高密切相关(R²= 0, 9971, P > 0, 0001)。

图1所示。PHA和WGA对NOx和cGMP浓度的影响。洗涤血小板(1.0×10⁹血小板/mL)在100 μ M l -精氨酸中孵育120秒，不同浓度(面板A, C)或10 μ g/mL凝集素(面板B, D)。NOx(面板A, B)和cGMP(面板C, D)的测定详见方法。每条表示重复进行的4次独立实验的平均值±SD。双向方差分析- tukey的事后检验:*P<0,0001，§P<0,001

PHA对eNOS磷酸化和活化的影响

由于WGA不诱导血小板NO升高，对PHA的研究正在进行中。结果表明，PHA刺激eNOS ser1177位点磷酸化。这种效应与剂量和时间有关，分别在10 mg/mL(图2A)和120秒(图2B)时达到峰值。为了确定血小板经PHA处理是否会导致eNOS的激活，我们测量了凝集素对L-[^3.H]精氨酸与L-[^3.H]瓜氨酸。我们发现，PHA能激活eNOS，尤其是10 mg/mL的PHA能使瓜氨酸形成增加3倍(图2C和2D)。eNOS活性与eNOS磷酸化密切相关(R²=0,9928, P=0,0003)和NO产量(R²= 0, 9991, P > 0, 0001)。

图2。PHA对eNOS磷酸化/活化的影响。A、B组:水洗血小板(1.0×10⁹血小板/mL)用不同浓度(图A)或10 μ g/mL PHA(图B)孵育120秒。采用抗p- enos (ser1177)免疫印迹法对合适的等分物进行检测。印迹是四个独立实验的代表。在右侧面板折叠变化相对于控制密度扫描±SD的eNOS磷酸化测量在四个实验。C、D面板:洗涤血小板(1.0×10⁹血小板/mL)在100µl -精氨酸(C)或10µg/mL PHA (D)条件下孵育120秒。方法中描述了eNOS活性的测定。每条表示重复进行的4次独立实验的平均值±SD。双向ANOVA-Tukey的事后测试:* P < 0 0001 # # P < 0, 05

AMPK参与eNOS磷酸化/活化

eNOS酶受不同的调节机制调控，包括由特定的蛋白激酶如蛋白激酶B (AKT)和AMPK磷酸化[9,10,19]。因此，我们测试了这些激酶的特定抑制剂对PHA刺激eNOS磷酸化的影响。我们发现磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和AKT抑制剂LY294002和MK2206分别对该参数无效(图3A和3B)，而AMPK抑制剂Compound C对该参数有较大的抑制作用。CaMKKb是参与AMPK激活的主要上游激酶之一。因此，为了验证CaMKKb/AMPKα通路对eNOS磷酸化的影响，我们测试了CaMKKb特异性抑制剂STO-609对PHA诱导eNOS磷酸化的影响。我们已经证明了STO-609具有很大的抑制作用(图3A和3B)。同样地，eNOS抑制剂L-NAME、STO-609和Compound C显著(p<0,0001)降低eNOS活性、NO和cGMP升高，而LY294002和MK2206不改变经PHA处理的血小板中的这些参数(图3C和3D)。

图3。抑制剂对凝集素诱导的eNOS磷酸化、eNOS活性、NOx和cGMP浓度的影响洗涤血小板(1.0×10⁹血小板/mL)， 37℃盐水预热，M L-NAME、M Compound C (Com C)、M STO-609 (STO)、M LY294002 (LY)、M MK2206 (MK)分别用10 g/mL PHA (PHA)、100µl -精氨酸(MK)分别孵育120秒。用抗p-eNOS (ser1177)免疫印迹合适的等分物(面板A, B)。在右侧面板(B)中，报告了四个实验中eNOS磷酸化的密度扫描±SD相对于对照的折叠变化。eNOS活性(图C)、NOx(图D)和cGMP(图E)含量详见方法。B、C、D、E板的每条表示4次重复独立实验的平均值±SD。学生的t-测试:§P<0,0001，♦P<0,005，▪P<0,05 vs无;*P<0,0001，§§P<0,005, vs PHA

PHA对AMPK磷酸化/活化的影响

图3报道的数据表明CaMKKb/AMPKα通路在PHA诱导的eNOS磷酸化/激活过程中起重要作用。事实上，PHA以剂量和时间依赖性的方式刺激AMPK在thr172位点的磷酸化(图4A和4B)。一旦被激活，AMPK可以磷酸化许多靶点，包括ACC。在包括血小板在内的细胞和组织中，这种酶在ser39位点的磷酸化通常被用作AMPK激活的标记物[6,7]。血小板经PHA处理后ACC发生磷酸化，其磷酸化模式与AMPK重叠(图4A和4B)。

图4。PHA诱导AMPKa的磷酸化和活化。洗涤血小板(1.0×10⁹血小板/mL)按不同浓度(面板A)或10 μ g/mL(面板B) PHA孵育120秒。分别用抗p- ampka (thr172)或抗p- acc (ser79)进行免疫印迹。印迹是四个独立实验的代表。在底部面板折叠变化相对于控制密度扫描±SD的AMPKa和ACC磷酸化测量在四个实验。双向ANOVA-Tukey的事后测试:* P < 0 0001 * * P < 0, 0005

除了CaMKKb外，肝激酶B1 (LKB1)也可能是参与人类血小板[1]中AMPK活化的上游激酶。因此，我们测定了血小板提取物免疫沉淀后LKB1的磷酸化水平。用PHA处理血小板后，未观察到LKB1丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化(数据未显示)。因此CaMKKb是PHA诱导AMPK磷酸化/活化的主要激酶。这一发现得到了图5数据的支持，该数据显示，STO-609显著降低了AMPK和ACC受PHA挑战的磷酸化水平(p<0,0001)。

图5。STO-609对凝集素诱导的AMPK磷酸化/活化的影响。洗涤血小板(1.0×10⁹血小板/mL)， 37℃用生理盐水或10 μ g/mL M STO-609 (STO)加热，10 μ g/mL PHA孵育120秒。然后将合适的等分物分别用抗p- ampk (thr172)或抗p- acc (ser79)进行免疫印迹，具体见方法。印迹是四个独立实验的代表。在右侧面板中报告了四个实验中与AMPKa的密度扫描±SD控制和ACC磷酸化相关的折叠变化。学生的t-测试:§P<0,0001, vs无;* P < 0, 0001 vs PHA

PHA对血管扩张剂刺激磷酸化蛋白(VASP)的影响

cGMP升高通过蛋白激酶G (PKG)激活，诱导VASP磷酸化[20]。因此，我们评估了PHA对VASP ser239和thr278残基磷酸化的影响。PHA的作用与剂量和时间有关(图6A和6B)。CaMKKb/AMPKα通路参与VASP磷酸化的结果得到了STO-609或化合物c预处理的血小板的支持，这两种抑制剂都取消了PHA诱导的VASP ser239和thr278位点的磷酸化(图7)。

图6。PHA诱导的VASP磷酸化。洗涤血小板(1.0×10⁹血小板/mL)与不同浓度(面板A)或10 μ g/mL(面板B) PHA孵育120秒。分别用抗-p- vasp (thr278)或抗-p- vasp (ser239)进行免疫印迹。印迹是四个独立实验的代表。在底部面板折叠变化相对于控制密度扫描±SD的VASPser239和thr278磷酸化测量在四个实验。双向ANOVA-Tukey的事后测试:* P < 0, 0001

图7。抑制剂对PHA诱导VASP磷酸化的影响。洗涤血小板(1.0×10⁹血小板/mL)， 37℃盐水预热10 μ g M STO-609 (STO)或10 μ M Compound C (Com C)，用10 μ g/mL PHA孵育120秒。然后将合适的等分物分别用抗-p- vasp (ser239)或抗-p- vasp (thr278)进行免疫印迹。印迹是四个独立实验的代表。在右侧面板中报道了四个实验VASPthr278和ser239磷酸化的密度扫描相对于控制的折叠变化。学生的t-测试:§P<0,0001 vs无;* P < 0, 0001 vs PHA

讨论

凝集素是一种来源于植物的蛋白质或糖蛋白。PHA是一个120kDa的四聚体蛋白，对氨基葡萄糖(1-2)甘露吡喃基残基具有糖特异性。WGA是一种分子量为120kDa的谷物凝集素，对b- d -氨基葡萄糖残基具有糖特异性。关于细胞中WGA效应的研究已经进行了很多，但是关于PHA的资料却很少。研究表明，WGA激活巨噬细胞和人中性粒细胞中NADPH氧化酶活性，诱导人血小板中蛋白酪氨酸快速磷酸化和磷脂酶C (PLC)的激活[21-24]。最近发现Src/Syk通路、适配器蛋白SLP-72和交换蛋白Vav参与凝集素诱导的PLCg2激活，在刺激这些机制[17]方面WGA比PHA更有效。对PHA和WGA等不同凝集素在激活小鼠巨噬细胞中NO产生和调控作用的研究表明，PHA刺激NO产生，而WGA不影响[25]。PI3K、蛋白激酶C、Ca等不同关键信号通路在PHA刺激巨噬细胞NO生成调控中的重要性^{2 +}[25]显示p42-44MAPK、JNK和Jak/STAT通路。eNOS磷酸化涉及多种蛋白激酶，如AKT、蛋白激酶A (PKA)、蛋白激酶C、AMPK和Ca^{2 +}/calmodulin-dependent protein kinase II[3,4,19,26-29]。在内皮细胞和血管中，瘦素通过pi3k独立的AKT激活eNOS磷酸化/激活，从而刺激NO释放，而缓激肽通过AKT或Ca激活eNOS^{2 +}/calmodulin-dependent protein kinase II[30,31]。另一方面，脂联素通过AMPK[32]磷酸化eNOS，通过pi3k依赖、akt独立的机制刺激血管内皮细胞产生NO。其他作者提出证据表明，AKT参与脂联素刺激的eNOS磷酸化，表明内皮细胞[33]中AMPK和AKT之间存在串扰。最后，凝血酶和组胺通过AMPK介导的途径刺激eNOS磷酸化，而不依赖于PI3K/AKT[34]。在本研究中，我们首次证明了PHA能够通过CaMKKb/AMPKα依赖的eNOS磷酸化/激活途径(如STO-609或Compound C)激活eNOS，从而极大地抑制这些酶。相反，PI3K抑制剂LY294002和AKT抑制剂MK2206的作用较差(图3)。因此，在人血小板中，PHA刺激的eNOS磷酸化/激活可能是ampk介导的机制，而不依赖于PI3K/AKT通路。以前我们已经证明，WGA表现为一种有效的血小板激动剂，而PHA似乎对[17]的作用较弱。相反，PHA是一种刺激eNOS磷酸化/活化和NO升高的强效凝集素。NO通过增加血小板内cAMP和cGMP激活腺苷酸和鸟苷酸环化酶。这些环核苷酸直接激活PKG，间接激活PKA。 The NO/cGMP/PKG/PKA pathway targets several proteins involved in the inhibition of platelet activation cascades including VASP and myosin light chain kinase [20,35]. VASP is a substrate of PKA, PKG and AMPK that phosphorylate the sites ser157, ser239 and thr278, respectively. The phosphorylation at ser157 influences VASP localization but had a minor impact on F-actin assembly, whereas VASP phosphorylation at ser239 or thr278 impairs VASP-driven actin filament formation [36]. PHA stimulates VASP phosphorylation at ser239 and thr278 residues (Figure 6). Thus, we can suppose that PKG and AMPK-mediated phosphorylation of VASP at these residues interferes with F-actin accumulation and has a minor impact of VASP localization focal adhesion as cells spread.

总之，本研究表明，在人类血小板中，PHA通过AMPK激活刺激eNOS磷酸化/激活。该机制总体上由CaMKKb介导，而LKB1参与较少。因此，eNOS的磷酸化/活化及其引起的细胞内NO和cGMP浓度的升高可能对血小板功能相关信号通路的激活起到调控作用。

确认

这项工作得到了意大利热那亚大学(Fondo di Ricerca di Ateneo 2017)的支持。

参考文献

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