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摘要gydF4y2Ba

应激对动脉粥样硬化的影响是复杂的。在这里，我们讨论慢性复杂应激(CCS)与致动脉粥样硬化饮食(AD)结合时，如何导致小鼠动脉粥样硬化的发展。CCS小鼠模型由不同类型和强度的物理和心理压力源组成，以随机顺序呈现。87只小鼠分为标准饲料组(n=44)和AD组(n=43)，饲养4个月。两组均被细分为未接受CCS治疗组和接受CCS治疗组。CCS在研究的最后一个月进行。采用超声生物显微镜、组织病理学和荧光免疫组化检查、ELISA、PCR和流式细胞术。我们发现CCS联合致动脉粥样硬化饮食可加速动脉粥样硬化的过程，通过超声生物显微镜观察最大内膜中膜厚度和低回声斑块形成，苏木精和伊红染色观察平均主动脉孔面积，Oil Red-O染色观察最大Oil-Red-O含量，以及主动脉甘油三酯水平。这些变化伴有内皮功能障碍和基于主动脉下调的过度炎症gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba主动脉syndecan-1 mRNA表达上调(gydF4y2BaSdc1gydF4y2Ba)和血栓调节蛋白(gydF4y2BaThbdgydF4y2BamRNA的表达，以及主动脉中cd45阳性细胞的百分比增加。应激小鼠主动脉肿瘤坏死因子α上调(gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-αgydF4y2Ba）gydF4y2Ba主动脉核受体亚家族3 (C组，成员1)的基因表达、共同上调(gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba),gydF4y2BaNfkbgydF4y2Ba1gydF4y2Ba基于PNMT和nr3c1阳性细胞增加的mRNA表达和肾上腺功能亢进gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPnmtgydF4y2Ba肾上腺mRNA的表达。这些观察结果可能表明，CCS通过肾上腺和主动脉促炎细胞因子(gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-αgydF4y2Ba)相关的主动脉联合上调gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNfkbgydF4y2Ba1gydF4y2Ba基因表达加速了小鼠动脉粥样硬化的发展，特别是与致动脉粥样硬化饮食结合时。gydF4y2Ba

关键字gydF4y2Ba

肾上腺功能，主动脉促炎细胞因子，致动脉粥样硬化饮食，动脉粥样硬化，慢性复杂应激gydF4y2Ba

简介gydF4y2Ba

心血管疾病死亡率逐渐下降;然而，心血管疾病仍然是导致死亡的主要原因。动脉粥样硬化是一种影响大动脉和中动脉的慢性炎症性疾病，被认为是心血管疾病[2]的主要潜在原因。除了传统的危险因素(高血压、高脂血症、糖尿病)外，应激也与动脉粥样硬化的发病机制有关[3-6]。当然，压力和心血管疾病之间存在联系;然而，潜在的机制是复杂的，与人类相似的压力动物模型仍然需要发展。gydF4y2Ba

自主神经系统和下丘脑-垂体-肾上腺轴的激活是应激反应的主要特征，应激反应影响包括心血管系统[6]在内的其他器官的功能。当HPA轴被激活时，糖皮质激素(GCs)从肾上腺皮质释放出来。GCs是重要的类固醇激素，调节多种生理过程，包括发育、凋亡、代谢和稳态。糖皮质激素受体(GR)是一种属于核受体超家族的转录因子(核受体亚家族3,C组，成员1;NR3C1)。激活的GR转运到细胞核，调节其靶基因的转录，包括核因子(NF)-κB[7-9]。NF-κB是一种转录调节因子，影响细胞生长、增殖、发育以及炎症和免疫反应等许多生物学过程[10,11]。gydF4y2Ba

炎症被认为是动脉粥样硬化进展背后的驱动力。肿瘤坏死因子-α (TNF-α)激活的NF-κB在调节促炎细胞因子和内皮细胞连接分子如血小板内皮细胞粘附分子(PECAM)-1的表达中发挥重要作用。过多或不适当的白细胞在组织中积累有助于许多病理条件，如动脉粥样硬化和心肌梗死[6]。白细胞迁移的过程始于趋化因子、细胞因子等炎症介质的产生和内皮细胞粘附分子PECAM-1的上调，PECAM-1在白细胞迁移过程中起着重要作用。gydF4y2Ba

动脉粥样硬化的发展之前是内皮功能障碍。一氧化氮(NO)是内皮细胞产生的一种潜在的血管扩张剂，可抑制单核细胞粘附、血小板聚集和血管平滑肌细胞增殖，对动脉粥样硬化过程具有抑制作用。内皮屏障功能受损和随后的炎症反应诱导粘连分子的产生和免疫细胞的募集，这反过来又延续了巨噬细胞浸润、动脉粥样硬化斑块形成和不良血栓事件的恶性循环，导致动脉粥样硬化加速[12]。gydF4y2Ba

以前，致动脉粥样硬化饮食(AD)被证明可以加速动脉粥样硬化的过程gydF4y2BaApoEgydF4y2Ba^-/-gydF4y2Ba与标准饮食或西方饮食[13]相比这些结果表明动脉粥样硬化可以通过改变营养来调节。gydF4y2Ba

在本研究中，我们讨论了慢性复杂应激(CCS)如何导致小鼠动脉粥样硬化的发展，特别是当与致动脉粥样硬化饮食结合时。该小鼠模型由5种不同强度的压力源(物理和心理压力源)组成，以随机顺序呈现，类似于人类生活中发展的压力源。我们假设肾上腺的过度活跃和主动脉促炎细胞因子和NF-κB的共同激活介导了内皮功能障碍，过度的主动脉炎症反应是ccs加速小鼠动脉粥样硬化过程的潜在机制，特别是当与致动脉粥样硬化饮食结合时。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

动物的准备gydF4y2Ba

本研究是按照美国国立卫生研究院的《实验动物护理和使用指南》中的建议进行的。该方案得到了gydF4y2Ba山口大学动物保育及使用委员会gydF4y2Ba(许可证编号:gydF4y2Ba13 - 013gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba在异氟醚氧麻醉下进行超声生物显微镜检查gydF4y2Ba，并尽一切努力尽量减少痛苦。gydF4y2Ba

成年(12周)雄性C57BL/6j小鼠，来自日本Charles River株式会社(Tokyo, Japan)。这些小鼠分别被放置在12小时光照/12小时黑暗周期中，并以标准饮食(SCD, 56%碳水化合物，23%蛋白质，5%脂肪的饮食)或致动脉粥样硬化饮食(AD, 12%碳水化合物，52%蛋白质，21%脂肪的饮食，#7685-130119,Oriental Bio Service Inc.)喂养。日本京都，参考先前的研究，在基线腹主动脉超声成像后16周记录[13]。在研究开始时和之后每周对小鼠称重。每周计算食物摄入量。研究人群一开始有87只老鼠。将小鼠随机分为SCD组(n= 44)和AD组(n=43);然后将这些组随机分为未接受CCS治疗组和接受CCS治疗组;最后采用23只无CCS的SCD小鼠、21只有CCS的SCD小鼠、22只无CCS的AD小鼠和21只有CCS的AD小鼠进行本研究。gydF4y2Ba

有意识小鼠的CCS协议gydF4y2Ba

CCS在研究的最后一个月进行。它由5种不同压力暴露水平的压力源(物理压力源和心理压力源)随机排列而成，类似于人类产生的压力源，参考前人的研究[14,15]。简而言之，这些包括gydF4y2Ba约束应力(gydF4y2Ba物理压力):gydF4y2Ba小鼠被放置在单独的通风有机玻璃限制器中一段时间，不限制尾部运动;gydF4y2Ba同向照射(gydF4y2Ba心理压力源):gydF4y2Ba两只老鼠(分别来自不同的笼子)被放在一个新的笼子里，笼子里有干净的被褥，没有先前建立的优势信号(即尿液气味);gydF4y2Ba避免喝水(不可预测的轻微压力):gydF4y2Ba一个干净的空笼子用0.3 cm深的冷水(20-22°C)浸泡，并提供一个1 cm高，3 cm直径的平台作为干燥环境;gydF4y2Ba潮湿的被褥(不可预测的轻微压力):gydF4y2Ba一个干净的空笼子被0.3厘米深的冷水(20-22°C)浸泡，老鼠在应激期间呆在笼子里;gydF4y2Ba笼倾斜gydF4y2Ba(不可预测的轻微压力):gydF4y2Ba笼子倾斜20度，老鼠在压力下呆在那里。为了避免习惯化，压力源被随机分配，每天一个压力源，每个压力源持续6小时，从上午08:30(-10:00)到下午14:30(-16:00)，连续5天(从周一到周五)，然后在研究的最后一个月休息2天(周六和周日)。除了CCS，在同一时间段内，对没有CCS的小鼠进行了相同的程序，包括水和食物剥夺。gydF4y2Ba

血液和组织采集gydF4y2Ba

在研究结束时，用0.5 - 1%的异氟醚氧麻醉小鼠，然后从左心室采集血液样本;经左心室全身灌注等渗生理盐水后，采集肾上腺和主动脉(主动脉弓至髂分叉处)。一侧肾上腺和部分腹主动脉组织片完全淹没在含有RNA的收集血管中，该收集血管中含有后来的RNA稳定试剂(Qiagen, Tokyo, Japan);该组织在4℃下孵卵过夜，然后从试剂中取出，转移到-80℃保存，直到实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析，并测量主动脉蛋白浓度和甘油三酯水平。剩余的肾上腺和主动脉组织固定在4%多聚甲醛0.1 m磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，然后在15%蔗糖中洗涤，最后在4°C保存，直到进一步分析。血液样本采集于含肝素的试管中，离心15000倍gydF4y2BaggydF4y2Ba采集后立即在4°C下保存20分钟，以获得血浆，然后在-80°C保存，直到进一步分析。gydF4y2Ba

主动脉蛋白和甘油三酯水平测量gydF4y2Ba

主动脉样本用裂解缓冲液(Cell Signal Technology Inc.， Danvers, MA)均质，并以10,000 rpm (9,170 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba)在4°C下放置10分钟。由此产生的上清液被用作主动脉总蛋白，用于测量主动脉蛋白浓度和主动脉甘油三酯水平。用Bradford方法测定蛋白质浓度，用自动分析仪(FDC4000;富士医疗系统，东京，日本)。gydF4y2Ba

组织病理学和荧光免疫组化检查gydF4y2Ba

取3 μm厚的小鼠主动脉切片(降主动脉2段和腹主动脉2段)进行苏木精-伊红(HE)染色，取8 μm厚的小鼠主动脉冷冻切片(降主动脉2段和腹主动脉2段)进行油红O染色，利用计算机化显微镜系统(BZ-II VIEWER和BZ-II ANALYZER 2007;日本大阪Keyence公司)10倍放大。gydF4y2Ba

免疫荧光染色:用低温恒温器(Leica CM1850)将8 μm厚的小鼠肾上腺冷冻切片，用4%多聚甲醛包埋在0.1 m PBS中，然后用NR3C1一抗(H-300，兔多克隆;苯基乙醇胺甲基转移酶(PNMT, ab167427，兔单克隆;Abcam，剑桥，英国)，并进一步用cy3标记的抗兔IgG (AP182C, Chemicon)按1:10 00稀释。细胞核用TO-PRO染色gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba-3碘化物(分子探针，卡尔斯巴德，CA)。最后在共聚焦激光扫描显微镜下观察切片(LSM5 Pascal/Version 3.2;卡尔蔡司微缩成像有限公司，蔡司，德国)。在20倍放大的共聚焦显微镜下，连续10个区计数细胞总数(细胞核数)和免疫阳性细胞总数(包括细胞核在内的免疫荧光表达细胞)。每个值的比值以免疫反应阳性细胞的百分比计算。gydF4y2Ba

超声生物显微技术gydF4y2Ba

超声生物显微镜在visualsonic Vevo 660上进行gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba微超声系统(多伦多，加拿大)，换能器频率为55 MHz，在基线和研究结束时使用异氟醚氧麻醉。在先前对小鼠的研究中，对最大内膜中膜厚度(max IMT)和斑块进行了评估[16]。在长轴和短轴视图下观察腹主动脉病变，并用b型和m型超声记录。根据先前对人类[17]的研究，斑块被定义为高回声或低回声斑块，与它们的外膜相比，它们表现出更高或更低的回声。低回声斑块不稳定，炎性浸润明显，脂质含量高，易破裂，而高回声斑块稳定，纤维组织和钙含量丰富[见文献17综述]。使用Visual sonic Vevo 660内置软件离线测量b型和m型图像的cine loop和max IMTgydF4y2Ba^TMgydF4y2BaMicro-Ultrasound系统。gydF4y2Ba

等离子体分析gydF4y2Ba

血浆分析采用自动分析仪(FDC4000i;使用去甲肾上腺素研究ELISA试剂盒(BA E-5200, LDN, Nordhorn, Germany)根据制造商说明书检测血液中去甲肾上腺素水平。gydF4y2Ba

实时逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)gydF4y2Ba

使用RNeasy从腹主动脉组织中提取总RNAgydF4y2Ba^®gydF4y2Ba纤维组织Mini Kit (Qiagen, Tokyo, Japan)和肾上腺使用RNeasy Mini Kit (Qiagen, Tokyo, Japan)。ReverTra王牌gydF4y2Ba^®gydF4y2BaqPCR RT Master Mix with gDNA Remover用于去除gDNA，并根据制造商的说明合成cDNA。RT-PCR使用Applied Biosystems StepOne™系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)对mRNA表达进行定量评估。基因表达检测包括氧化低密度脂蛋白(凝集素样)受体1 (ID: Mm00454588_g1, NCBI参考序列:NM_138648.2, NM_001301094.1和NM_001301096.1;基因符号:gydF4y2BaOlr1gydF4y2Ba)，一氧化氮合酶3，内皮细胞(ID: Mm00435204_m1, NCBI参考序列:NM_008713.4;基因符号:gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba)， syndecan1 (ID: Mm00448920_g1, NCBI参考序列:NM_011519.2;基因符号:gydF4y2BaSdc1gydF4y2Ba)，凝血调节蛋白(ID: Mm00437014_s1, NCBI参考序列:NM_009378.3，基因符号:gydF4y2BaThbdgydF4y2Ba)，肿瘤坏死因子(ID: Mm99999068_m1, NCBI参考序列:NM_013693.3;基因符号:gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-gydF4y2BaαgydF4y2Ba)， B细胞1 kappa轻多肽基因增强子核因子p105 (ID: Mm00476361_m1, NCBI参考序列:NM_008689.2;基因符号:gydF4y2BaNfkb1gydF4y2Ba)，核受体亚家族3,C组，成员1 (ID: Mm00433832_m1, NCBI参考序列:NM_008173.3;基因符号:gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba)，苯基乙醇胺- n -甲基转移酶(ID: Mm00476993_m1, NCBI参考序列:NM_008890.1，基因符号:gydF4y2BaPnmtgydF4y2Ba)，血小板/内皮细胞粘附分子1 (ID: Mm01246167_m1, GenBank: BC085502.1和BC008519.1;基因符号:gydF4y2BaPecam1gydF4y2Ba）;都是从应用生物系统公司购买的。的相对表达式gydF4y2BaOlr1gydF4y2Ba，gydF4y2BaSdc1, Thbd, Nos3, Nr3c1, Pnmt, Nfkb1, Tnf-α和Pecam1gydF4y2Ba将mrna归一化至甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ID: Mm99999915_g1, NCBI参考序列:NM_001289726.1和NM_008084.3;基因符号:gydF4y2BaGapdhgydF4y2Ba)相同cDNA样本中的mRNA，使用制造商推荐的比较定量方法;相对表达量表示为与不含CCS的SCD值相比的倍数变化。gydF4y2BaNos3, Sdc1gydF4y2Ba,gydF4y2BaThbdgydF4y2Ba参照前人研究方法作为内皮损伤的标志物[18,19]。gydF4y2Ba

小鼠主动脉内白细胞堆积的流式细胞术分析gydF4y2Ba

在研究结束时，用0.5 - 1%的异氟醚氧麻醉部分小鼠，并在经左心室全身灌注汉克斯平衡盐溶液(HBSS)后采集整个主动脉(从主动脉弓到髂分叉)。脂肪组织和腹主动脉旁淋巴结被仔细地从主动脉上剥离。将分离的主动脉与HBSS一起置于收集管中。gydF4y2Ba

单细胞悬液的制备gydF4y2Ba

主动脉解离酶原液(ADESS)使用小鼠肿瘤解离试剂盒(1300-096-730,Miltenyi Biotec Gmbh Inc.)制备。Bergisch Glabdach，德国)。简单地说，100 μL酶D、50 μL酶R和12.5 μL酶A在gentleMACS中以1% BSA-10 mM HEPES-HBSS缓冲液设置为1.5 mLgydF4y2Ba^TMgydF4y2BaC管(130-093-237,Miltenyi Biotec Gmbh Inc.)Bergisch Glabdach, Germany)，主动脉在37℃孵育。整个主动脉从HBSS移至绅士macsgydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba装有制备好的ADESS的C管。主动脉被切成小块，使用gentleMACS™Dissociator (Miltenyi Biotec Gmbh Inc.)进行粉碎均质。Bergisch Glabdach, Germany)在37°C下与ADESS孵育30分钟后。这个过程一共重复了三次;然后，10毫升autoMACSgydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba(130-091-221, Miltenyi Biotec Gmbh Inc.)加入Bergisch Glabdach, Germany)，匀浆通过70 μm预分离过滤器(130-095-823,Miltenyi Biotec Gmbh Inc.)。Bergisch Glabdach，德国)制成15毫升的试管。细胞经离心(300 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba， 10分钟，4°C)制备来自总主动脉的单细胞悬液。gydF4y2Ba

用CD45-PerCP抗体染色主动脉细胞悬液gydF4y2Ba

最多10个gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba45 μL autoMACS悬浮有核细胞gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba加入运行缓冲液和5 μL CD45-PerCP抗体(常见白细胞抗原标记物)，充分混合，4℃暗处孵育10分钟。加入1 mL autoMACS清洗细胞gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba运行缓冲液，300倍离心gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。完全吸出上清液。用适量(0.5 mL) autoMACS重悬细胞颗粒gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba运行Buffer和5 μL PI(活/死细胞活力染色)。样品在流式细胞仪(Cytomics FC500, Beckman Coulter, CA)上运行。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

连续数据以均数±标准差(SDs)表示。极端值被Smirnov-Grubbs检验排除。每组的样本量(小鼠数量)已在研究前的实验设计中确定。但是，各组中每次分析引入的小鼠数量还包括Smirnov-Grubbs试验剔除的小鼠数量、CCS过程中因猝死而丢弃的小鼠数量，以及用于重复性实验的小鼠数量，最终导致各组小鼠数量不尽相同。各组间分别采用联列表(m × n)卡方检验和Bonferroni事后检验评价腹主动脉斑块形成情况，仅采用联列表(2x2)卡方检验评价无CCS组和有CCS组小鼠腹主动脉低回声斑块形成情况的差异。两组之间(CCS前和CCS中)的连续变量比较采用成对检验gydF4y2BatgydF4y2Ba四组间连续变量比较采用单因素方差分析(ANOVA)进行检验。当方差分析发现f值显著时，采用Bonferroni/Dunn事后检验进行多次比较。使用Statcel2 for Windows软件(OMS Publishing, Inc.， Saitama, Japan)进行统计分析。的价值gydF4y2BaP < 0.05gydF4y2Ba被认为有统计学意义。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

血浆TCHO，体重，营养和热量的消耗gydF4y2Ba

在CCS过程中，因小鼠猝死(3只SCD, 2只AD)和运动障碍(1只SCD)而丢弃;最终，本研究分析了40只SCD小鼠(23只无CCS小鼠，17只有CCS小鼠)和41只AD小鼠(22只无CCS小鼠，19只有CCS小鼠)。我们使用的致动脉粥样硬化饮食(AD)含有12%的碳水化合物、52%的蛋白质、21%的脂肪(445千卡/100克饮食)，或标准饮食(SCD)含有56%的碳水化合物、23%的蛋白质、5%的脂肪(362千卡/100克饮食)。gydF4y2Ba

在研究结束时，喂食不含CCS的AD的小鼠血浆TCHO(图1A)显著增加，而CCS抑制了喂食相同AD的小鼠的这种增加(图1A)。gydF4y2Ba

图1。动物基本特征gydF4y2Ba

血浆TCHO (A)、BW (B)和蛋白质(C)、脂肪(D)、碳水化合物(E)、卡路里(F)消耗的代表性结果。白色条形代表没有CCS的小鼠，黑色条形代表有CCS的小鼠;将40只SCD小鼠(23只未加CCS, 17只加CCS)和41只AD小鼠(22只未加CCS, 19只加CCS)从B到F进行分析;结果以平均值±SDs表示。gydF4y2Ba^＊gydF4y2BapgydF4y2Ba与无CCS的SCD相比<0.05，gydF4y2Ba^__gydF4y2Bap < 0.05gydF4y2Ba与拥有CCS的SCD，gydF4y2Ba^＃gydF4y2Bap < 0.05gydF4y2Ba与无CCS的AD在方差分析中遵循Bonferroni/Dunn事后检验统计分析，gydF4y2Ba^＄gydF4y2Bap < 0.05gydF4y2Ba在CCS之前的配对gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。gydF4y2Ba

在CCS之前(SCD或AD育种3个月后)，与喂食SCD(没有和有CCS小鼠)的小鼠相比，喂食AD(没有和有CCS小鼠)的小鼠BW显著增加(图1B)。在研究结束时，与喂食SCD(不喂食CCS小鼠和不喂食CCS小鼠)的小鼠相比，喂食AD(不喂食CCS小鼠和喂食CCS小鼠)的小鼠BW(图1B)也显著增加，但CCS抑制了喂食CCS AD的小鼠AD诱导的BW增加。相比之下，CCS对喂食SCD小鼠的BW没有显著影响。这些结果伴随着蛋白质(图1C)、脂肪(图1D)和卡路里(图1F)的高消耗，而与喂食SCD的小鼠(没有和有CCS的小鼠)相比，喂食AD的小鼠(没有和有CCS的小鼠)在CCS之前和期间的碳水化合物消耗(图1E)都很低。但与CCS前相比，喂食CCS的AD小鼠显示出蛋白质、脂肪、碳水化合物和卡路里消耗的抑制趋势(统计分析没有发现差异，gydF4y2BaP = 0.0567gydF4y2Ba在所有);与此相反，喂食CCS的SCD小鼠对CCS的消耗增加(图1C-1F)。gydF4y2BaP < 0.05gydF4y2Ba在所有)。gydF4y2Ba

结果表明，AD饮食引起高脂血症和较大的体重增加;然而，接受CCS的AD小鼠在研究结束时体重下降，并抑制了血液TCHO的升高，这是由于在应激治疗期间全面抑制了营养物质和卡路里的消耗。gydF4y2Ba

最大IMT与腹主动脉斑块形成gydF4y2Ba

与没有CCS的SCD小鼠相比，有CCS的SCD、无CCS的AD和有CCS的AD组小鼠的最大IMT(图2A和2C)和斑块形成(图2B)均有所增加，应激小鼠喂食AD时最大IMT和高回声斑块形成最高。高回声形成分别为4.5%(无CCS的SCD)、73%(有CCS的SCD)、38%(无CCS的AD)和100%(有CCS的AD)。此外，低回声斑块，即不稳定斑块，仅出现在喂食AD饮食的小鼠中，CCS增加了这种低回声斑块的形成(14只CCS小鼠中有8只(57%)，而21只没有CCS的小鼠中有2只(10%)，χgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 9.3,gydF4y2BaP < 0.05gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

图2。超声生物显微镜成像评估最大IMT和斑块形成gydF4y2Ba

(A)基线和研究结束时腹主动脉最大IMT的代表性例子，两个箭头之间的间距表示最大IMT，水平比例尺= 100ms，垂直比例尺= 300μm。(B)研究结束时腹主动脉硬斑块(箭头)和软斑块(箭头)形成的代表性例子;与外膜相比，这些可分别定义为更高和更低的回声;比例尺= 300μm。(C)最大IMT的代表性结果。白色条形代表没有CCS的小鼠，黑色条形代表有CCS的小鼠;用C分析37只SCD小鼠(22只未加CCS, 15只加CCS)和35只AD小鼠(21只未加CCS, 14只加CCS);结果以平均值±SDs表示。gydF4y2Ba^＊gydF4y2Bap < 0.05gydF4y2Ba与没有CCS的SCD，gydF4y2Ba^__gydF4y2Bap < 0.05gydF4y2Ba与拥有CCS的SCD，gydF4y2Ba^＃gydF4y2Bap < 0.05gydF4y2Ba与无CCS的AD在方差分析中遵循Bonferroni/Dunn事后检验统计分析，gydF4y2Ba^‡gydF4y2Bap < 0.05gydF4y2Ba和基线的对比gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。gydF4y2Ba

动脉粥样硬化的病理表型基于平均主动脉壁面积、主动脉最大Oil-Red-O含量和主动脉甘油三酯水平gydF4y2BaPecam1gydF4y2Ba- - -gydF4y2BaOlr1gydF4y2Ba-介导的白细胞在整个主动脉细胞悬液中堆积gydF4y2Ba

每组处理5只小鼠HE染色，但由于组织切片制备不成功，1只无CCS的SCD和1只无CCS的AD被丢弃;通过HE染色，与无CCS的SCD小鼠相比，AD和CCS均诱导平均主动脉壁面积增加(图3A和3B)。gydF4y2Ba

图3。主动脉平均壁面积，最大Oil-Red-O含量gydF4y2Ba甘油三酸酯水平gydF4y2Ba，白细胞堆积，和gydF4y2BaPecam1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOrl1gydF4y2Ba信使rna表达gydF4y2Ba

(A)主动脉壁面积(HE染色)、Oil-Red-O含量(Oil -Red-O染色)、整个主动脉细胞悬液中CD45+细胞(流式细胞术)的代表例，箭头表示局部病变，标尺bar = 100μm。(B)主动脉平均面积的代表性结果。(C)主动脉max Oil-Red-O含量的代表性结果。(D)主动脉甘油三酯水平的代表性结果。(E)用流式细胞术在整个主动脉细胞悬液中鉴定为CD45+细胞的主动脉白细胞堆积的代表性结果，数字表示C门(紫色细胞群)中活的主动脉CD45+白细胞的百分比。(F)主动脉的代表性结果gydF4y2BaPecam1gydF4y2Ba信使rna表达。(G)主动脉的代表性结果gydF4y2BaOrl1gydF4y2Ba信使rna表达。结果以平均值±SDs表示;白色条形代表没有CCS的小鼠，黑色条形代表有CCS的小鼠。gydF4y2Ba^＊gydF4y2Bap < 0.05gydF4y2Ba与没有CCS的SCD，gydF4y2Ba^__gydF4y2BapgydF4y2Ba与有CCS的SCD相比<0.05，gydF4y2Ba^＃gydF4y2Bap < 0.05gydF4y2Ba与无CCS的AD的方差分析遵循Bonferroni/Dunn事后检验统计分析。gydF4y2Ba

每组5只小鼠进行油红O染色，但由于组织切片制备不成功，1只无CCS的SCD、1只有CCS的SCD和1只有CCS的AD被丢弃;与无CCS的SCD小鼠相比，AD和CCS均诱导主动脉最大Oil-Red-O含量增加，特别是在有CCS的AD小鼠中(图3A和3C)。gydF4y2Ba

与无CCS的SCD小鼠相比，有CCS的AD小鼠的主动脉甘油三酯水平升高(图3D)，在有CCS的SCD小鼠和无CCS的AD小鼠中呈上升趋势(无显著统计学差异)。gydF4y2Ba

本研究采用CD45染色联合活/死活性染料(碘化丙啶染色)流式细胞术分析小鼠主动脉内的白细胞。每组处理6只小鼠进行流式细胞术研究，但在统计分析过程中，2只无CCS的SCD和1只无CCS的AD因极值而被丢弃。仅在SCD和ad喂养的CCS小鼠中，整个主动脉细胞悬液中主动脉白细胞的百分比(CD45+白细胞的浸润)增加(图3A和3E)。gydF4y2Ba

PECAM-1通过其介导白细胞浸润的能力参与动脉粥样硬化的发病机制，氧化LDL已被证明可以通过细胞因子刺激的内皮细胞促进单核细胞迁移gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba通过涉及内皮细胞PECAM-1上调的机制[见文献[20]的综述]。在本研究中，CCS，而不是ad诱导的高脂血症，诱导了显著的上调gydF4y2BaPecam1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOrl1gydF4y2Ba(氧化LDL受体)mRNA的表达(图3F和3G)。gydF4y2Ba

内皮功能障碍gydF4y2Ba

在本研究中，基于主动脉基因表达的改变，ccs诱导的白细胞浸润伴有内皮功能障碍gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba(图4),gydF4y2BaThbdgydF4y2Ba(图4B)，以及gydF4y2BaSdc1gydF4y2Ba(图4C)在应激小鼠中的作用，其表现为下调gydF4y2BaNos3gydF4y2BamRNA表达上调gydF4y2BaThbdgydF4y2Ba和/或gydF4y2BaSdc1gydF4y2Ba与喂食无CCS的SCD的小鼠相比，CCS小鼠的mRNA表达。gydF4y2Ba

图4。内皮功能障碍gydF4y2Ba

通过主动脉检测内皮功能障碍gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba(一),gydF4y2BaThbdgydF4y2Ba(B)gydF4y2BaSdc1gydF4y2Ba(C)本研究中mRNA的表达。结果以平均值±SDs表示;白色条形代表没有CCS的小鼠，黑色条形代表有CCS的小鼠。gydF4y2Ba^＊gydF4y2Bap < 0.05gydF4y2Ba与没有CCS的SCD，gydF4y2Ba^__gydF4y2Bap < 0.05gydF4y2Ba与拥有CCS的SCD，gydF4y2Ba^＃gydF4y2Bap < 0.05gydF4y2Ba与无CCS的AD使用方差分析，然后进行Bonferroni/Dunn事后测试统计分析。gydF4y2Ba

肿瘤坏死因子-gydF4y2BaαgydF4y2Ba相关的主动脉联合上调gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNfkb1gydF4y2BamRNA表达伴白细胞浸润和内皮功能障碍gydF4y2Ba

CCS可引起白细胞浸润和内皮功能障碍，特别是与致动脉粥样硬化饮食联合使用时。这些变化均伴有主动脉瓣明显的上调或升高趋势(无统计学差异)gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba(图5),gydF4y2BaNfkb1gydF4y2Ba(图5B)，以及gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba-gydF4y2BaαgydF4y2Ba(图5C) CCS小鼠的mRNA表达。结果表明，gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba-gydF4y2BaαgydF4y2Ba相关的主动脉联合上调gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNfkbgydF4y2Ba1gydF4y2BamRNA表达可能在CCS过程中部分介导主动脉炎症反应和内皮功能障碍，尤其是在CCS的AD小鼠中。gydF4y2Ba

图5。gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba-gydF4y2BaαgydF4y2Ba-gydF4y2Ba相关的主动脉联合上调gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNfkb1gydF4y2Ba信使rna表达gydF4y2Ba

CCS可上调大鼠主动脉mRNA的表达gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba(一),gydF4y2BaNfkb1gydF4y2Ba(B)和gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-gydF4y2BaαgydF4y2Ba(C).结果以平均值±SDs表示;白色条形代表没有CCS的小鼠，黑色条形代表有CCS的小鼠。gydF4y2Ba^＊gydF4y2Bap < 0.05gydF4y2Ba与没有CCS的SCD，gydF4y2Ba^＃gydF4y2Bap < 0.05gydF4y2Ba与无CCS的AD的方差分析遵循Bonferroni/Dunn事后检验统计分析。gydF4y2Ba

应激引起的肾上腺过度激活gydF4y2Ba

压力导致应激器官的激活，首先是皮质醇和肾上腺素释放到循环中。因此，我们测定了ccs诱导的肾上腺功能变化。如图6所示，CCS，特别是在联合致动脉粥样硬化饮食的小鼠中，激活肾上腺功能，表现为增加gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPnmgydF4y2BatgydF4y2BamRNA表达(图6A和6B)， NR3C1-和pnmt阳性细胞的百分比(图6C-6E)。CSS诱导标准饲料喂养的小鼠血液去甲肾上腺素浓度升高(图6F);而在有CCS的AD小鼠中，仅呈上升趋势(无显著统计学差异)。这些结果表明CCS可能通过激活肾上腺素gydF4y2BaPnmtgydF4y2Ba基因，该基因受糖皮质激素调控，至少部分类似于重复固定应激的结果[21,22]。gydF4y2Ba

图6。ccs诱导的肾上腺过度激活gydF4y2Ba

(A)肾上腺的代表性结果gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba信使rna表达。(B)肾上腺的代表性结果gydF4y2BaPnmtgydF4y2Ba信使rna表达。(C) LSM评估的肾上腺NR3C1-(白色箭头)和PNMT-(黄色箭头)阳性细胞的代表性例子;比例尺= 10μm。(D) nr3c1阳性细胞百分比的代表性结果。(E) pnmt阳性细胞百分比的代表性结果。(F)血去甲肾上腺素浓度的代表性结果。结果以平均值±SDs表示;白色条形代表没有CCS的小鼠，黑色条形代表有CCS的小鼠。gydF4y2Ba^＊gydF4y2Bap < 0.05gydF4y2Ba与没有CCS的SCD，gydF4y2Ba^__gydF4y2Bap < 0.05gydF4y2Ba与拥有CCS的SCD，gydF4y2Ba^＃gydF4y2Bap < 0.05gydF4y2Ba与无CCS的AD的方差分析遵循Bonferroni/Dunn事后检验统计分析。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

本研究采用一种新的复杂慢性精神应激(CCS)小鼠模型。该小鼠模型由不同类型和强度的生理和心理压力源组成，以类似于人类压力源的随机顺序呈现。我们的数据表明，在喂食标准饮食和致动脉粥样硬化饮食时，CCS可以控制动脉粥样硬化的过程。CCS与致动脉粥样硬化饮食之间的协同作用也可能加速小鼠动脉粥样硬化的发展。CCS可引起小鼠主动脉壁内皮功能障碍和白细胞过度堆积，导致动脉粥样硬化过程。这些影响可能部分由ccs诱导的肾上腺亢进和促炎细胞因子(gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-gydF4y2BaαgydF4y2Ba)相关的主动脉联合上调gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNfkb1gydF4y2Ba基因表达。gydF4y2Ba

动脉粥样硬化动物应激模型研究gydF4y2Ba

通过对动物的研究，可以深入了解压力和动脉粥样硬化疾病之间的联系。动物应激模型通常分为生理应激模型和心理应激模型。对于动物模型来说，模拟人类疾病的自然过程和应激反应是很重要的;不幸的是，人类的压力是复杂的，以往研究中使用的动物压力模型的复杂性非常有限[见文献6综述]。本研究参考前人研究方法，采用慢性复杂应激小鼠模型[6,14]。该小鼠模型由不同类型和强度的生理和心理压力源组成，以随机顺序呈现，类似于人类的体验。gydF4y2Ba约束应力gydF4y2Ba是应力诱导的一种物理方法。先前的一项研究报道，抑制应激(120分钟/天，14天)通过氧化应激[23]诱导内皮功能障碍。gydF4y2Ba同种的接触gydF4y2Ba是一种社会心理压力，可以减少社会互动，增加焦虑衍生的行为，类似于人类的压力诱导的精神病理学。在大鼠研究中，社会挫败测试与交感神经亢进和快速心律失常相关[见文献24综述]。在一项小鼠研究中，由于出现了更多的微观瘢痕[25]，纤维化的体积分数比对照动物大6倍。gydF4y2Ba不可预测的慢性轻度压力:gydF4y2Ba在一项研究中gydF4y2BaApoEgydF4y2Ba^-/-gydF4y2Ba小鼠不可预测的慢性轻度应激促进了斑块特征，与易损病变相关，导致人类[26]心肌梗死和中风。本研究采用三种不可预测的慢性轻度应激(避水、潮湿被褥和笼侧倾斜)。我们的慢性复杂应激小鼠模型以随机顺序应用各种应激模块，在研究的最后一个月，每天一个应激源，每个应激源持续6小时，连续5天(从周一到周五)，然后休息2天(周六和周日)。CCS被证明可以加速动脉粥样硬化的过程，这表明这种慢性复杂应激小鼠模型可能有助于深入了解人类压力和动脉粥样硬化之间的联系。gydF4y2Ba

CCS加速了动脉粥样硬化的发展gydF4y2Ba

压力和心血管疾病之间的联系还没有完全弄清楚。自主神经系统对慢性或意外压力的过度反应可产生心血管功能障碍。先前的研究表明，急性克制应激引起致命的心动过缓，与大鼠心脏交感迷走神经平衡向交感神经优势转移有关，重度抑郁症患者被证明具有异常高的交感神经活动，包括交感神经流向心脏[14,27]。在本研究中，CCS项目采用了5种压力情境，评估了CCS对心血管疾病主要潜在病因动脉粥样硬化进展的影响。我们的数据表明，CCS可能加速了小鼠动脉粥样硬化的进展(图2)以及白细胞过度反应(图3A和3E)和主动脉内皮功能障碍(图4)。这些结果与基于肾上腺PNMT分泌增加和血浆去甲肾上腺素浓度的自主神经系统过度反应有关(图6C, 6E和6F)， HPA轴的激活由肾上腺NR3C1分泌增加证明(图6C和6D)。我们的研究结果表明，HPA轴和自主神经系统是对压力情况的第一个反应，在ccs加速动脉粥样硬化的发展中发挥作用。gydF4y2Ba

CCS可通过gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-αgydF4y2Ba相关的合作上调gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNfkb1gydF4y2BamRNA表达可诱导主动脉壁内皮功能障碍和白细胞过度堆积，尤其是与致动脉粥样硬化饮食联合使用时gydF4y2Ba

血管内皮在动脉粥样硬化性疾病的发生和发展中起着重要作用。内皮的主要作用是通过产生NO来调节血管功能，降低血管阻力，抑制血小板粘附，降低血管平滑肌细胞增殖[28]。应激激活HPA轴，导致肾上腺GCs分泌增加[见文献12综述]，GCs的作用是通过糖皮质激素受体(GR)介导的，GR是核受体超家族(NR3C1)的转录因子。人内皮细胞与皮质醇的孵孵期使NOS3 mRNA和蛋白的表达水平降低到对照的60-70%，这些反应被糖皮质激素受体拮抗剂米非司酮[29]阻止。糖蛋白糖萼包裹血管内皮。血管内皮中糖萼的损伤导致内皮屏障功能受损，血管中血小板和白细胞粘附和剪切应力增加。在急性冠状动脉综合征期间观察到较高水平的syndecan-1 (Sdc-1，内皮糖萼损伤的生物标志物)，这表明内皮糖萼损伤可能参与了患者[31]的动脉粥样硬化斑块易损过程。血栓调节蛋白(thrombobomodulin)是一种内皮膜糖蛋白，是C蛋白抗凝途径的重要组成部分，在调节纤溶[32]中起作用。我们的结果与先前的研究一致，表明ccs诱导的上调gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba肾上腺和主动脉的mRNA表达均伴有主动脉的下调gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba信使rna表达。此外，ccs诱导的上调gydF4y2BaNr3c1gydF4y2BamRNA的表达也有上调gydF4y2BaSdc1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaThbdgydF4y2BamRNA表达，提示内皮屏障功能受损和thbd介导的纤溶调节。此外，激活的NR3C1与糖皮质激素反应元件结合并与NF-相互作用gydF4y2Ba_КgydF4y2BaB是糖皮质激素介导的转激活和反式抑制相关的主要调节机制[33]。gydF4y2Ba

NF -gydF4y2Ba_КgydF4y2BaB是一个组成型表达的转录因子家族，影响细胞的生长、增殖和发育以及炎症和免疫反应[见文献34综述]。NF -gydF4y2Ba_КgydF4y2Ba由于NF-的作用，B通路被认为是一种典型的促炎信号通路gydF4y2Ba_КgydF4y2BaB在促炎基因的表达，包括细胞因子，趋化因子和粘附分子。在不同的内部和外部压力的反应，NF-gydF4y2Ba_КgydF4y2BaB是对炎症刺激的反应，如促炎细胞因子TNF-α信号通路和活化的NF-gydF4y2Ba_КgydF4y2BaB还能促进促炎细胞因子、趋化因子、受体和粘附分子的产生，包括TNF-α[34,35]。既往研究报道慢性轻度应激可使大鼠体内TNF-α循环水平升高，心理应激程度较大的教师体内TNF-α水平较高[36,37]。除本研究外，多项研究结果表明，抗tnf -α治疗可改善各种病理生理条件下的内皮功能障碍[38,39]。这些发现与我们的结果是一致的。我们发现ccs诱导gydF4y2BaNos3gydF4y2BamRNA的下调伴随着主动脉的上调gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-αgydF4y2Ba，gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba,gydF4y2BaNfkb1gydF4y2Ba信使rna表达。因此，CCS激活HPA轴导致肾上腺和主动脉中NR3C1的产生增加，增加主动脉促炎介质(本研究中为TNF-α)，并导致在CCS中观察到的内皮功能障碍。gydF4y2Ba

主动脉壁上白细胞过多堆积有助于动脉粥样硬化的进展。我们的结果显示，ccs诱导的内皮功能障碍(图4)与主动脉壁白细胞过度积聚(图3A和3E)有关。内皮功能障碍和随后的炎症反应诱导粘附分子如PECAM-1的产生和免疫细胞如白细胞的募集，这反过来又延续了白细胞浸润、动脉粥样硬化斑块形成和不良血栓事件的恶性循环。白细胞迁移的过程始于炎症介质(如TNF-α)的产生和内皮细胞粘附分子的上调。这些支持了白细胞最初附着在内皮细胞上，并通过血管壁中相邻内皮细胞之间的连接进行迁移，以及包括PECAM-1在内的众多内皮细胞连接分子水平的变化[见文献20综述]。NF -gydF4y2Ba_КgydF4y2BaB信号转导通路在动脉内皮细胞中引发动脉粥样硬化病变的形成，pecam -1缺失小鼠未检测到NF-的激活gydF4y2Ba_КgydF4y2BaB或血流紊乱区域下游炎症基因的证据[40,41]。氧化LDL在内皮连接处上调PECAM-1和下调VE-cadherin，然后通过加强与单核细胞PECAM-1的同嗜性结合和破坏连接屏障分别促进单核细胞的进入，[42]。此外，既往研究表明，高胰岛素血症通过增加内皮细胞PECAM-1表达直接促进中性粒细胞向内皮细胞迁移，从而加速动脉粥样硬化[43,44]。体外研究表明，雷帕霉素可抑制人脐静脉内皮细胞氧化性LDL积累，降低其磷酸化的机制靶点，进而抑制NF-κB激活和抑制LOX-1，从而降低人脐静脉内皮细胞氧化性LDL摄取[45]。本研究表明，ccs诱导gydF4y2BaPecam1gydF4y2BamRNA的上调伴随着gydF4y2BaOlr1gydF4y2Ba(氧化LDL的受体)mRNA在小鼠主动脉中上调。结合之前的研究，主动脉上调gydF4y2BaPecam1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOlr1gydF4y2Ba在动脉粥样硬化过程中，mRNA的表达可能至少在一定程度上与CCS中观察到的主动脉壁白细胞堆积有关。gydF4y2Ba

致动脉粥样硬化的饮食也是导致动脉粥样硬化的原因gydF4y2Ba

在一项男性研究中gydF4y2BaApoEgydF4y2Ba^-/-gydF4y2Ba与西方饮食(43%碳水化合物，42%脂肪，15%蛋白质，0.15%胆固醇)相比，饮食中含有12%碳水化合物，43%脂肪，15%蛋白质，0.15%胆固醇)的小鼠动脉粥样硬化的进展更广泛，尽管饮食中脂肪和胆固醇含量相似，体重增加减少[13]。主动脉瓣水平动脉粥样硬化明显增多，斑块横截面积增大，证实了这一结论。在本研究中，野生型小鼠(C57BL/6j)饲喂12%碳水化合物、52%蛋白质、21%脂肪的AD后，动脉粥样硬化的进展也更为广泛，表现为max IMT和低回声斑块形成、主动脉平均面积、主动脉max Oil-Red-O含量和主动脉甘油三酯水平升高(图2和图3)，并且四组中，饲喂AD的CCS小鼠的max IMT、低回声斑块形成、Oil-Red-O含量和甘油三酯水平均最高。我们的结果表明，CCS和AD之间的协同作用可能与小鼠动脉粥样硬化的发展有关。然而，主动脉的变化gydF4y2BaPecam1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOlr1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba，gydF4y2BaThbdgydF4y2Ba，gydF4y2BaSdc1,gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-αgydF4y2Ba在信息水平上的研究还不足以完全阐明CCS与AD的协同作用导致动脉粥样硬化的发展，有必要进一步研究其潜在机制。gydF4y2Ba

限制gydF4y2Ba

本研究中使用的慢性复杂应激(CCS)小鼠模型仅在野生型小鼠中诱导轻度动脉粥样硬化病变。在最近的一项研究中，慢性固定应激(每天在固定应激管中4小时，持续12周)增强了血管内皮细胞的衰老和动脉粥样硬化斑块的生长gydF4y2BaApoEgydF4y2Ba^-/-gydF4y2Ba老鼠[46]。为了进一步研究CCS和AD对动脉粥样硬化的影响，我们建立了一种基于CCS和AD的动脉粥样硬化小鼠模型gydF4y2BaApoEgydF4y2Ba^-/-gydF4y2Ba而且gydF4y2BaLdlrgydF4y2Ba^-/-gydF4y2Ba老鼠是必要的。gydF4y2Ba

本研究采用降主动脉和腹主动脉;但与主动脉根部相比，降主动脉和腹主动脉较不易发生动脉硬化。这一局限性可能至少部分原因在于，与其他结果相比，CCS小鼠HE染色图像评估的平均主动脉壁区域变化不明显，如最大IMT(图2A和2C)和整个主动脉中CD45+细胞的百分比(图3A和3E)。然而，为了研究CCS和AD在动脉粥样硬化中的全部细节，包括主动脉根部、流出道在内的所有主动脉部分都是必不可少的，甚至使用了通用的无创超声生物显微镜和流式细胞术方法。gydF4y2Ba

在本研究中，我们评估了基因表型与ccs加速动脉粥样硬化发展之间的关系。然而，CCS加速小鼠动脉粥样硬化的过程不仅仅是基因表型的原因。对主动脉中动脉粥样硬化相关细胞的进一步分子生物学研究是必要的。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

心理应激可导致不良动脉粥样硬化;然而，其机制还没有得到很好的理解。神经和体液系统在应激源的类型和强度的变化中被激活，这表明了创建慢性复杂应激动物模型的重要性。本研究中使用的CCS可能构成了一种更好的模型，用于研究人类生活中发生的意外压力刺激。CCS，特别是当与致动脉粥样硬化饮食结合时，尽管小鼠血液TCHO降低，但通过内皮功能障碍和白细胞过度积累，加速了动脉粥样硬化的过程。肾上腺功能亢进、主动脉促炎基因共同上调(gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-αgydF4y2Ba，gydF4y2BaPecam1gydF4y2Ba,gydF4y2BaOlr1gydF4y2Ba),gydF4y2BaNfkb1gydF4y2BamRNA的表达可能参与内皮功能障碍和主动脉炎症反应的激活。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

作者要感谢Kenichi Sasamoto (Miltenyibiotec Tokyo)， Ihoko Fujimoto(山口大学)，Yuki Tanaka(山口大学)和Fuka Haruse(山口大学)的技术援助。gydF4y2Ba

资助及补助金gydF4y2Ba

本研究由日本科学促进会科学研究资助基金(no. 1)资助。25460869接刘金耀。17K09265发给Jinyao Liu)进行数据收集和分析。gydF4y2Ba

利益冲突gydF4y2Ba

不是declaredAbstractgydF4y2Ba

应激对动脉粥样硬化的影响是复杂的。在这里，我们讨论慢性复杂应激(CCS)与致动脉粥样硬化饮食(AD)结合时，如何导致小鼠动脉粥样硬化的发展。CCS小鼠模型由不同类型和强度的物理和心理压力源组成，以随机顺序呈现。87只小鼠分为标准饲料组(n=44)和AD组(n=43)，饲养4个月。两组均被细分为未接受CCS治疗组和接受CCS治疗组。CCS在研究的最后一个月进行。采用超声生物显微镜、组织病理学和荧光免疫组化检查、ELISA、PCR和流式细胞术。我们发现CCS联合致动脉粥样硬化饮食可加速动脉粥样硬化的过程，通过超声生物显微镜观察最大内膜中膜厚度和低回声斑块形成，苏木精和伊红染色观察平均主动脉孔面积，Oil Red-O染色观察最大Oil-Red-O含量，以及主动脉甘油三酯水平。这些变化伴有内皮功能障碍和基于主动脉下调的过度炎症gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba主动脉syndecan-1 mRNA表达上调(gydF4y2BaSdc1gydF4y2Ba)和血栓调节蛋白(gydF4y2BaThbdgydF4y2BamRNA的表达，以及主动脉中cd45阳性细胞的百分比增加。应激小鼠主动脉肿瘤坏死因子α上调(gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-αgydF4y2Ba）gydF4y2Ba主动脉核受体亚家族3 (C组，成员1)的基因表达、共同上调(gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba),gydF4y2BaNfkbgydF4y2Ba1gydF4y2Ba基于PNMT和nr3c1阳性细胞增加的mRNA表达和肾上腺功能亢进gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPnmtgydF4y2Ba肾上腺mRNA的表达。这些观察结果可能表明，CCS通过肾上腺和主动脉促炎细胞因子(gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-αgydF4y2Ba)相关的主动脉联合上调gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNfkbgydF4y2Ba1gydF4y2Ba基因表达加速了小鼠动脉粥样硬化的发展，特别是与致动脉粥样硬化饮食结合时。gydF4y2Ba

关键字gydF4y2Ba

肾上腺功能，主动脉促炎细胞因子，致动脉粥样硬化饮食，动脉粥样硬化，慢性复杂应激gydF4y2Ba

简介gydF4y2Ba

心血管疾病死亡率逐渐下降;然而，心血管疾病仍然是导致死亡的主要原因。动脉粥样硬化是一种影响大动脉和中动脉的慢性炎症性疾病，被认为是心血管疾病[2]的主要潜在原因。除了传统的危险因素(高血压、高脂血症、糖尿病)外，应激也与动脉粥样硬化的发病机制有关[3-6]。当然，压力和心血管疾病之间存在联系;然而，潜在的机制是复杂的，与人类相似的压力动物模型仍然需要发展。gydF4y2Ba

自主神经系统和下丘脑-垂体-肾上腺轴的激活是应激反应的主要特征，应激反应影响包括心血管系统[6]在内的其他器官的功能。当HPA轴被激活时，糖皮质激素(GCs)从肾上腺皮质释放出来。GCs是重要的类固醇激素，调节多种生理过程，包括发育、凋亡、代谢和稳态。糖皮质激素受体(GR)是一种属于核受体超家族的转录因子(核受体亚家族3,C组，成员1;NR3C1)。激活的GR转运到细胞核，调节其靶基因的转录，包括核因子(NF)-κB[7-9]。NF-κB是一种转录调节因子，影响细胞生长、增殖、发育以及炎症和免疫反应等许多生物学过程[10,11]。gydF4y2Ba

炎症被认为是动脉粥样硬化进展背后的驱动力。肿瘤坏死因子-α (TNF-α)激活的NF-κB在调节促炎细胞因子和内皮细胞连接分子如血小板内皮细胞粘附分子(PECAM)-1的表达中发挥重要作用。过多或不适当的白细胞在组织中积累有助于许多病理条件，如动脉粥样硬化和心肌梗死[6]。白细胞迁移的过程始于趋化因子、细胞因子等炎症介质的产生和内皮细胞粘附分子PECAM-1的上调，PECAM-1在白细胞迁移过程中起着重要作用。gydF4y2Ba

动脉粥样硬化的发展之前是内皮功能障碍。一氧化氮(NO)是内皮细胞产生的一种潜在的血管扩张剂，可抑制单核细胞粘附、血小板聚集和血管平滑肌细胞增殖，对动脉粥样硬化过程具有抑制作用。内皮屏障功能受损和随后的炎症反应诱导粘连分子的产生和免疫细胞的募集，这反过来又延续了巨噬细胞浸润、动脉粥样硬化斑块形成和不良血栓事件的恶性循环，导致动脉粥样硬化加速[12]。gydF4y2Ba

以前，致动脉粥样硬化饮食(AD)被证明可以加速动脉粥样硬化的过程gydF4y2BaApoEgydF4y2Ba^-/-gydF4y2Ba与标准饮食或西方饮食[13]相比这些结果表明动脉粥样硬化可以通过改变营养来调节。gydF4y2Ba

在本研究中，我们讨论了慢性复杂应激(CCS)如何导致小鼠动脉粥样硬化的发展，特别是当与致动脉粥样硬化饮食结合时。该小鼠模型由5种不同强度的压力源(物理和心理压力源)组成，以随机顺序呈现，类似于人类生活中发展的压力源。我们假设肾上腺的过度活跃和主动脉促炎细胞因子和NF-κB的共同激活介导了内皮功能障碍，过度的主动脉炎症反应是ccs加速小鼠动脉粥样硬化过程的潜在机制，特别是当与致动脉粥样硬化饮食结合时。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

动物的准备gydF4y2Ba

本研究是按照美国国立卫生研究院的《实验动物护理和使用指南》中的建议进行的。该方案得到了gydF4y2Ba山口大学动物保育及使用委员会gydF4y2Ba(许可证编号:gydF4y2Ba13 - 013gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba在异氟醚氧麻醉下进行超声生物显微镜检查gydF4y2Ba，并尽一切努力尽量减少痛苦。gydF4y2Ba

成年(12周)雄性C57BL/6j小鼠，来自日本Charles River株式会社(Tokyo, Japan)。这些小鼠分别被放置在12小时光照/12小时黑暗周期中，并以标准饮食(SCD, 56%碳水化合物，23%蛋白质，5%脂肪的饮食)或致动脉粥样硬化饮食(AD, 12%碳水化合物，52%蛋白质，21%脂肪的饮食，#7685-130119,Oriental Bio Service Inc.)喂养。日本京都，参考先前的研究，在基线腹主动脉超声成像后16周记录[13]。在研究开始时和之后每周对小鼠称重。每周计算食物摄入量。研究人群一开始有87只老鼠。将小鼠随机分为SCD组(n= 44)和AD组(n=43);然后将这些组随机分为未接受CCS治疗组和接受CCS治疗组;最后采用23只无CCS的SCD小鼠、21只有CCS的SCD小鼠、22只无CCS的AD小鼠和21只有CCS的AD小鼠进行本研究。gydF4y2Ba

有意识小鼠的CCS协议gydF4y2Ba

CCS在研究的最后一个月进行。它由5种不同压力暴露水平的压力源(物理压力源和心理压力源)随机排列而成，类似于人类产生的压力源，参考前人的研究[14,15]。简而言之，这些包括gydF4y2Ba约束应力(gydF4y2Ba物理压力):gydF4y2Ba小鼠被放置在单独的通风有机玻璃限制器中一段时间，不限制尾部运动;gydF4y2Ba同向照射(gydF4y2Ba心理压力源):gydF4y2Ba两只老鼠(分别来自不同的笼子)被放在一个新的笼子里，笼子里有干净的被褥，没有先前建立的优势信号(即尿液气味);gydF4y2Ba避免喝水(不可预测的轻微压力):gydF4y2Ba一个干净的空笼子用0.3 cm深的冷水(20-22°C)浸泡，并提供一个1 cm高，3 cm直径的平台作为干燥环境;gydF4y2Ba潮湿的被褥(不可预测的轻微压力):gydF4y2Ba一个干净的空笼子被0.3厘米深的冷水(20-22°C)浸泡，老鼠在应激期间呆在笼子里;gydF4y2Ba笼倾斜gydF4y2Ba(不可预测的轻微压力):gydF4y2Ba笼子倾斜20度，老鼠在压力下呆在那里。为了避免习惯化，压力源被随机分配，每天一个压力源，每个压力源持续6小时，从上午08:30(-10:00)到下午14:30(-16:00)，连续5天(从周一到周五)，然后在研究的最后一个月休息2天(周六和周日)。除了CCS，在同一时间段内，对没有CCS的小鼠进行了相同的程序，包括水和食物剥夺。gydF4y2Ba

血液和组织采集gydF4y2Ba

在研究结束时，用0.5 - 1%的异氟醚氧麻醉小鼠，然后从左心室采集血液样本;经左心室全身灌注等渗生理盐水后，采集肾上腺和主动脉(主动脉弓至髂分叉处)。一侧肾上腺和部分腹主动脉组织片完全淹没在含有RNA的收集血管中，该收集血管中含有后来的RNA稳定试剂(Qiagen, Tokyo, Japan);该组织在4℃下孵卵过夜，然后从试剂中取出，转移到-80℃保存，直到实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析，并测量主动脉蛋白浓度和甘油三酯水平。剩余的肾上腺和主动脉组织固定在4%多聚甲醛0.1 m磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，然后在15%蔗糖中洗涤，最后在4°C保存，直到进一步分析。血液样本采集于含肝素的试管中，离心15000倍gydF4y2BaggydF4y2Ba采集后立即在4°C下保存20分钟，以获得血浆，然后在-80°C保存，直到进一步分析。gydF4y2Ba

主动脉蛋白和甘油三酯水平测量gydF4y2Ba

主动脉样本用裂解缓冲液(Cell Signal Technology Inc.， Danvers, MA)均质，并以10,000 rpm (9,170 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba)在4°C下放置10分钟。由此产生的上清液被用作主动脉总蛋白，用于测量主动脉蛋白浓度和主动脉甘油三酯水平。用Bradford方法测定蛋白质浓度，用自动分析仪(FDC4000;富士医疗系统，东京，日本)。gydF4y2Ba

组织病理学和荧光免疫组化检查gydF4y2Ba

取3 μm厚的小鼠主动脉切片(降主动脉2段和腹主动脉2段)进行苏木精-伊红(HE)染色，取8 μm厚的小鼠主动脉冷冻切片(降主动脉2段和腹主动脉2段)进行油红O染色，利用计算机化显微镜系统(BZ-II VIEWER和BZ-II ANALYZER 2007;日本大阪Keyence公司)10倍放大。gydF4y2Ba

免疫荧光染色:用低温恒温器(Leica CM1850)将8 μm厚的小鼠肾上腺冷冻切片，用4%多聚甲醛包埋在0.1 m PBS中，然后用NR3C1一抗(H-300，兔多克隆;苯基乙醇胺甲基转移酶(PNMT, ab167427，兔单克隆;Abcam，剑桥，英国)，并进一步用cy3标记的抗兔IgG (AP182C, Chemicon)按1:10 00稀释。细胞核用TO-PRO染色gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba-3碘化物(分子探针，卡尔斯巴德，CA)。最后在共聚焦激光扫描显微镜下观察切片(LSM5 Pascal/Version 3.2;卡尔蔡司微缩成像有限公司，蔡司，德国)。在20倍放大的共聚焦显微镜下，连续10个区计数细胞总数(细胞核数)和免疫阳性细胞总数(包括细胞核在内的免疫荧光表达细胞)。每个值的比值以免疫反应阳性细胞的百分比计算。gydF4y2Ba

超声生物显微技术gydF4y2Ba

超声生物显微镜在visualsonic Vevo 660上进行gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba微超声系统(多伦多，加拿大)，换能器频率为55 MHz，在基线和研究结束时使用异氟醚氧麻醉。在先前对小鼠的研究中，对最大内膜中膜厚度(max IMT)和斑块进行了评估[16]。在长轴和短轴视图下观察腹主动脉病变，并用b型和m型超声记录。根据先前对人类[17]的研究，斑块被定义为高回声或低回声斑块，与它们的外膜相比，它们表现出更高或更低的回声。低回声斑块不稳定，炎性浸润明显，脂质含量高，易破裂，而高回声斑块稳定，纤维组织和钙含量丰富[见文献17综述]。使用Visual sonic Vevo 660内置软件离线测量b型和m型图像的cine loop和max IMTgydF4y2Ba^TMgydF4y2BaMicro-Ultrasound系统。gydF4y2Ba

等离子体分析gydF4y2Ba

血浆分析采用自动分析仪(FDC4000i;使用去甲肾上腺素研究ELISA试剂盒(BA E-5200, LDN, Nordhorn, Germany)根据制造商说明书检测血液中去甲肾上腺素水平。gydF4y2Ba

实时逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)gydF4y2Ba

使用RNeasy从腹主动脉组织中提取总RNAgydF4y2Ba^®gydF4y2Ba纤维组织Mini Kit (Qiagen, Tokyo, Japan)和肾上腺使用RNeasy Mini Kit (Qiagen, Tokyo, Japan)。ReverTra王牌gydF4y2Ba^®gydF4y2BaqPCR RT Master Mix with gDNA Remover用于去除gDNA，并根据制造商的说明合成cDNA。RT-PCR使用Applied Biosystems StepOne™系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)对mRNA表达进行定量评估。基因表达检测包括氧化低密度脂蛋白(凝集素样)受体1 (ID: Mm00454588_g1, NCBI参考序列:NM_138648.2, NM_001301094.1和NM_001301096.1;基因符号:gydF4y2BaOlr1gydF4y2Ba)，一氧化氮合酶3，内皮细胞(ID: Mm00435204_m1, NCBI参考序列:NM_008713.4;基因符号:gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba)， syndecan1 (ID: Mm00448920_g1, NCBI参考序列:NM_011519.2;基因符号:gydF4y2BaSdc1gydF4y2Ba)，凝血调节蛋白(ID: Mm00437014_s1, NCBI参考序列:NM_009378.3，基因符号:gydF4y2BaThbdgydF4y2Ba)，肿瘤坏死因子(ID: Mm99999068_m1, NCBI参考序列:NM_013693.3;基因符号:gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-gydF4y2BaαgydF4y2Ba)， B细胞1 kappa轻多肽基因增强子核因子p105 (ID: Mm00476361_m1, NCBI参考序列:NM_008689.2;基因符号:gydF4y2BaNfkb1gydF4y2Ba)，核受体亚家族3,C组，成员1 (ID: Mm00433832_m1, NCBI参考序列:NM_008173.3;基因符号:gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba)，苯基乙醇胺- n -甲基转移酶(ID: Mm00476993_m1, NCBI参考序列:NM_008890.1，基因符号:gydF4y2BaPnmtgydF4y2Ba)，血小板/内皮细胞粘附分子1 (ID: Mm01246167_m1, GenBank: BC085502.1和BC008519.1;基因符号:gydF4y2BaPecam1gydF4y2Ba）;都是从应用生物系统公司购买的。的相对表达式gydF4y2BaOlr1gydF4y2Ba，gydF4y2BaSdc1, Thbd, Nos3, Nr3c1, Pnmt, Nfkb1, Tnf-α和Pecam1gydF4y2Ba将mrna归一化至甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ID: Mm99999915_g1, NCBI参考序列:NM_001289726.1和NM_008084.3;基因符号:gydF4y2BaGapdhgydF4y2Ba)相同cDNA样本中的mRNA，使用制造商推荐的比较定量方法;相对表达量表示为与不含CCS的SCD值相比的倍数变化。gydF4y2BaNos3, Sdc1gydF4y2Ba,gydF4y2BaThbdgydF4y2Ba参照前人研究方法作为内皮损伤的标志物[18,19]。gydF4y2Ba

小鼠主动脉内白细胞堆积的流式细胞术分析gydF4y2Ba

在研究结束时，用0.5 - 1%的异氟醚氧麻醉部分小鼠，并在经左心室全身灌注汉克斯平衡盐溶液(HBSS)后采集整个主动脉(从主动脉弓到髂分叉)。脂肪组织和腹主动脉旁淋巴结被仔细地从主动脉上剥离。将分离的主动脉与HBSS一起置于收集管中。gydF4y2Ba

单细胞悬液的制备gydF4y2Ba

主动脉解离酶原液(ADESS)使用小鼠肿瘤解离试剂盒(1300-096-730,Miltenyi Biotec Gmbh Inc.)制备。Bergisch Glabdach，德国)。简单地说，100 μL酶D、50 μL酶R和12.5 μL酶A在gentleMACS中以1% BSA-10 mM HEPES-HBSS缓冲液设置为1.5 mLgydF4y2Ba^TMgydF4y2BaC管(130-093-237,Miltenyi Biotec Gmbh Inc.)Bergisch Glabdach, Germany)，主动脉在37℃孵育。整个主动脉从HBSS移至绅士macsgydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba装有制备好的ADESS的C管。主动脉被切成小块，使用gentleMACS™Dissociator (Miltenyi Biotec Gmbh Inc.)进行粉碎均质。Bergisch Glabdach, Germany)在37°C下与ADESS孵育30分钟后。这个过程一共重复了三次;然后，10毫升autoMACSgydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba(130-091-221, Miltenyi Biotec Gmbh Inc.)加入Bergisch Glabdach, Germany)，匀浆通过70 μm预分离过滤器(130-095-823,Miltenyi Biotec Gmbh Inc.)。Bergisch Glabdach，德国)制成15毫升的试管。细胞经离心(300 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba， 10分钟，4°C)制备来自总主动脉的单细胞悬液。gydF4y2Ba

用CD45-PerCP抗体染色主动脉细胞悬液gydF4y2Ba

最多10个gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba45 μL autoMACS悬浮有核细胞gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba加入运行缓冲液和5 μL CD45-PerCP抗体(常见白细胞抗原标记物)，充分混合，4℃暗处孵育10分钟。加入1 mL autoMACS清洗细胞gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba运行缓冲液，300倍离心gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。完全吸出上清液。用适量(0.5 mL) autoMACS重悬细胞颗粒gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba运行Buffer和5 μL PI(活/死细胞活力染色)。样品在流式细胞仪(Cytomics FC500, Beckman Coulter, CA)上运行。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

连续数据以均数±标准差(SDs)表示。极端值被Smirnov-Grubbs检验排除。每组的样本量(小鼠数量)已在研究前的实验设计中确定。但是，各组中每次分析引入的小鼠数量还包括Smirnov-Grubbs试验剔除的小鼠数量、CCS过程中因猝死而丢弃的小鼠数量，以及用于重复性实验的小鼠数量，最终导致各组小鼠数量不尽相同。各组间分别采用联列表(m × n)卡方检验和Bonferroni事后检验评价腹主动脉斑块形成情况，仅采用联列表(2x2)卡方检验评价无CCS组和有CCS组小鼠腹主动脉低回声斑块形成情况的差异。两组之间(CCS前和CCS中)的连续变量比较采用成对检验gydF4y2BatgydF4y2Ba四组间连续变量比较采用单因素方差分析(ANOVA)进行检验。当方差分析发现f值显著时，采用Bonferroni/Dunn事后检验进行多次比较。使用Statcel2 for Windows软件(OMS Publishing, Inc.， Saitama, Japan)进行统计分析。的价值gydF4y2BaP < 0.05gydF4y2Ba被认为有统计学意义。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

血浆TCHO，体重，营养和热量的消耗gydF4y2Ba

在CCS过程中，因小鼠猝死(3只SCD, 2只AD)和运动障碍(1只SCD)而丢弃;最终，本研究分析了40只SCD小鼠(23只无CCS小鼠，17只有CCS小鼠)和41只AD小鼠(22只无CCS小鼠，19只有CCS小鼠)。我们使用的致动脉粥样硬化饮食(AD)含有12%的碳水化合物、52%的蛋白质、21%的脂肪(445千卡/100克饮食)，或标准饮食(SCD)含有56%的碳水化合物、23%的蛋白质、5%的脂肪(362千卡/100克饮食)。gydF4y2Ba

在研究结束时，喂食不含CCS的AD的小鼠血浆TCHO(图1A)显著增加，而CCS抑制了喂食相同AD的小鼠的这种增加(图1A)。gydF4y2Ba

在CCS之前(SCD或AD育种3个月后)，与喂食SCD(没有和有CCS小鼠)的小鼠相比，喂食AD(没有和有CCS小鼠)的小鼠BW显著增加(图1B)。在研究结束时，与喂食SCD(不喂食CCS小鼠和不喂食CCS小鼠)的小鼠相比，喂食AD(不喂食CCS小鼠和喂食CCS小鼠)的小鼠BW(图1B)也显著增加，但CCS抑制了喂食CCS AD的小鼠AD诱导的BW增加。相比之下，CCS对喂食SCD小鼠的BW没有显著影响。这些结果伴随着蛋白质(图1C)、脂肪(图1D)和卡路里(图1F)的高消耗，而与喂食SCD的小鼠(没有和有CCS的小鼠)相比，喂食AD的小鼠(没有和有CCS的小鼠)在CCS之前和期间的碳水化合物消耗(图1E)都很低。但与CCS前相比，喂食CCS的AD小鼠显示出蛋白质、脂肪、碳水化合物和卡路里消耗的抑制趋势(统计分析没有发现差异，gydF4y2BaP = 0.0567gydF4y2Ba在所有);与此相反，喂食CCS的SCD小鼠对CCS的消耗增加(图1C-1F)。gydF4y2BaP < 0.05gydF4y2Ba在所有)。gydF4y2Ba

结果表明，AD饮食引起高脂血症和较大的体重增加;然而，接受CCS的AD小鼠在研究结束时体重下降，并抑制了血液TCHO的升高，这是由于在应激治疗期间全面抑制了营养物质和卡路里的消耗。gydF4y2Ba

最大IMT与腹主动脉斑块形成gydF4y2Ba

与没有CCS的SCD小鼠相比，有CCS的SCD、无CCS的AD和有CCS的AD组小鼠的最大IMT(图2A和2C)和斑块形成(图2B)均有所增加，应激小鼠喂食AD时最大IMT和高回声斑块形成最高。高回声形成分别为4.5%(无CCS的SCD)、73%(有CCS的SCD)、38%(无CCS的AD)和100%(有CCS的AD)。此外，低回声斑块，即不稳定斑块，仅出现在喂食AD饮食的小鼠中，CCS增加了这种低回声斑块的形成(14只CCS小鼠中有8只(57%)，而21只没有CCS的小鼠中有2只(10%)，χgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 9.3,gydF4y2BaP < 0.05gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

动脉粥样硬化的病理表型基于平均主动脉壁面积、主动脉最大Oil-Red-O含量和主动脉甘油三酯水平gydF4y2BaPecam1gydF4y2Ba- - -gydF4y2BaOlr1gydF4y2Ba-介导的白细胞在整个主动脉细胞悬液中堆积gydF4y2Ba

每组处理5只小鼠HE染色，但由于组织切片制备不成功，1只无CCS的SCD和1只无CCS的AD被丢弃;通过HE染色，与无CCS的SCD小鼠相比，AD和CCS均诱导平均主动脉壁面积增加(图3A和3B)。gydF4y2Ba

每组5只小鼠进行油红O染色，但由于组织切片制备不成功，1只无CCS的SCD、1只有CCS的SCD和1只有CCS的AD被丢弃;与无CCS的SCD小鼠相比，AD和CCS均诱导主动脉最大Oil-Red-O含量增加，特别是在有CCS的AD小鼠中(图3A和3C)。gydF4y2Ba

与无CCS的SCD小鼠相比，有CCS的AD小鼠的主动脉甘油三酯水平升高(图3D)，在有CCS的SCD小鼠和无CCS的AD小鼠中呈上升趋势(无显著统计学差异)。gydF4y2Ba

本研究采用CD45染色联合活/死活性染料(碘化丙啶染色)流式细胞术分析小鼠主动脉内的白细胞。每组处理6只小鼠进行流式细胞术研究，但在统计分析过程中，2只无CCS的SCD和1只无CCS的AD因极值而被丢弃。仅在SCD和ad喂养的CCS小鼠中，整个主动脉细胞悬液中主动脉白细胞的百分比(CD45+白细胞的浸润)增加(图3A和3E)。gydF4y2Ba

PECAM-1通过其介导白细胞浸润的能力参与动脉粥样硬化的发病机制，氧化LDL已被证明可以通过细胞因子刺激的内皮细胞促进单核细胞迁移gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba通过涉及内皮细胞PECAM-1上调的机制[见文献[20]的综述]。在本研究中，CCS，而不是ad诱导的高脂血症，诱导了显著的上调gydF4y2BaPecam1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOrl1gydF4y2Ba(氧化LDL受体)mRNA的表达(图3F和3G)。gydF4y2Ba

内皮功能障碍gydF4y2Ba

在本研究中，基于主动脉基因表达的改变，ccs诱导的白细胞浸润伴有内皮功能障碍gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba(图4),gydF4y2BaThbdgydF4y2Ba(图4B)，以及gydF4y2BaSdc1gydF4y2Ba(图4C)在应激小鼠中的作用，其表现为下调gydF4y2BaNos3gydF4y2BamRNA表达上调gydF4y2BaThbdgydF4y2Ba和/或gydF4y2BaSdc1gydF4y2Ba与喂食无CCS的SCD的小鼠相比，CCS小鼠的mRNA表达。gydF4y2Ba

肿瘤坏死因子-gydF4y2BaαgydF4y2Ba相关的主动脉联合上调gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNfkb1gydF4y2BamRNA表达伴白细胞浸润和内皮功能障碍gydF4y2Ba

CCS可引起白细胞浸润和内皮功能障碍，特别是与致动脉粥样硬化饮食联合使用时。这些变化均伴有主动脉瓣明显的上调或升高趋势(无统计学差异)gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba(图5),gydF4y2BaNfkb1gydF4y2Ba(图5B)，以及gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba-gydF4y2BaαgydF4y2Ba(图5C) CCS小鼠的mRNA表达。结果表明，gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba-gydF4y2BaαgydF4y2Ba相关的主动脉联合上调gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNfkbgydF4y2Ba1gydF4y2BamRNA表达可能在CCS过程中部分介导主动脉炎症反应和内皮功能障碍，尤其是在CCS的AD小鼠中。gydF4y2Ba

应激引起的肾上腺过度激活gydF4y2Ba

压力导致应激器官的激活，首先是皮质醇和肾上腺素释放到循环中。因此，我们测定了ccs诱导的肾上腺功能变化。如图6所示，CCS，特别是在联合致动脉粥样硬化饮食的小鼠中，激活肾上腺功能，表现为增加gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPnmgydF4y2BatgydF4y2BamRNA表达(图6A和6B)， NR3C1-和pnmt阳性细胞的百分比(图6C-6E)。CSS诱导标准饲料喂养的小鼠血液去甲肾上腺素浓度升高(图6F);而在有CCS的AD小鼠中，仅呈上升趋势(无显著统计学差异)。这些结果表明CCS可能通过激活肾上腺素gydF4y2BaPnmtgydF4y2Ba基因，该基因受糖皮质激素调控，至少部分类似于重复固定应激的结果[21,22]。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

本研究采用一种新的复杂慢性精神应激(CCS)小鼠模型。该小鼠模型由不同类型和强度的生理和心理压力源组成，以类似于人类压力源的随机顺序呈现。我们的数据表明，在喂食标准饮食和致动脉粥样硬化饮食时，CCS可以控制动脉粥样硬化的过程。CCS与致动脉粥样硬化饮食之间的协同作用也可能加速小鼠动脉粥样硬化的发展。CCS可引起小鼠主动脉壁内皮功能障碍和白细胞过度堆积，导致动脉粥样硬化过程。这些影响可能部分由ccs诱导的肾上腺亢进和促炎细胞因子(gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-gydF4y2BaαgydF4y2Ba)相关的主动脉联合上调gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNfkb1gydF4y2Ba基因表达。gydF4y2Ba

动脉粥样硬化动物应激模型研究gydF4y2Ba

通过对动物的研究，可以深入了解压力和动脉粥样硬化疾病之间的联系。动物应激模型通常分为生理应激模型和心理应激模型。对于动物模型来说，模拟人类疾病的自然过程和应激反应是很重要的;不幸的是，人类的压力是复杂的，以往研究中使用的动物压力模型的复杂性非常有限[见文献6综述]。本研究参考前人研究方法，采用慢性复杂应激小鼠模型[6,14]。该小鼠模型由不同类型和强度的生理和心理压力源组成，以随机顺序呈现，类似于人类的体验。gydF4y2Ba约束应力gydF4y2Ba是应力诱导的一种物理方法。先前的一项研究报道，抑制应激(120分钟/天，14天)通过氧化应激[23]诱导内皮功能障碍。gydF4y2Ba同种的接触gydF4y2Ba是一种社会心理压力，可以减少社会互动，增加焦虑衍生的行为，类似于人类的压力诱导的精神病理学。在大鼠研究中，社会挫败测试与交感神经亢进和快速心律失常相关[见文献24综述]。在一项小鼠研究中，由于出现了更多的微观瘢痕[25]，纤维化的体积分数比对照动物大6倍。gydF4y2Ba不可预测的慢性轻度压力:gydF4y2Ba在一项研究中gydF4y2BaApoEgydF4y2Ba^-/-gydF4y2Ba小鼠不可预测的慢性轻度应激促进了斑块特征，与易损病变相关，导致人类[26]心肌梗死和中风。本研究采用三种不可预测的慢性轻度应激(避水、潮湿被褥和笼侧倾斜)。我们的慢性复杂应激小鼠模型以随机顺序应用各种应激模块，在研究的最后一个月，每天一个应激源，每个应激源持续6小时，连续5天(从周一到周五)，然后休息2天(周六和周日)。CCS被证明可以加速动脉粥样硬化的过程，这表明这种慢性复杂应激小鼠模型可能有助于深入了解人类压力和动脉粥样硬化之间的联系。gydF4y2Ba

CCS加速了动脉粥样硬化的发展gydF4y2Ba

压力和心血管疾病之间的联系还没有完全弄清楚。自主神经系统对慢性或意外压力的过度反应可产生心血管功能障碍。先前的研究表明，急性克制应激引起致命的心动过缓，与大鼠心脏交感迷走神经平衡向交感神经优势转移有关，重度抑郁症患者被证明具有异常高的交感神经活动，包括交感神经流向心脏[14,27]。在本研究中，CCS项目采用了5种压力情境，评估了CCS对心血管疾病主要潜在病因动脉粥样硬化进展的影响。我们的数据表明，CCS可能加速了小鼠动脉粥样硬化的进展(图2)以及白细胞过度反应(图3A和3E)和主动脉内皮功能障碍(图4)。这些结果与基于肾上腺PNMT分泌增加和血浆去甲肾上腺素浓度的自主神经系统过度反应有关(图6C, 6E和6F)， HPA轴的激活由肾上腺NR3C1分泌增加证明(图6C和6D)。我们的研究结果表明，HPA轴和自主神经系统是对压力情况的第一个反应，在ccs加速动脉粥样硬化的发展中发挥作用。gydF4y2Ba

CCS可通过gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-αgydF4y2Ba相关的合作上调gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNfkb1gydF4y2BamRNA表达可诱导主动脉壁内皮功能障碍和白细胞过度堆积，尤其是与致动脉粥样硬化饮食联合使用时gydF4y2Ba

血管内皮在动脉粥样硬化性疾病的发生和发展中起着重要作用。内皮的主要作用是通过产生NO来调节血管功能，降低血管阻力，抑制血小板粘附，降低血管平滑肌细胞增殖[28]。应激激活HPA轴，导致肾上腺GCs分泌增加[见文献12综述]，GCs的作用是通过糖皮质激素受体(GR)介导的，GR是核受体超家族(NR3C1)的转录因子。人内皮细胞与皮质醇的孵孵期使NOS3 mRNA和蛋白的表达水平降低到对照的60-70%，这些反应被糖皮质激素受体拮抗剂米非司酮[29]阻止。糖蛋白糖萼包裹血管内皮。血管内皮中糖萼的损伤导致内皮屏障功能受损，血管中血小板和白细胞粘附和剪切应力增加。在急性冠状动脉综合征期间观察到较高水平的syndecan-1 (Sdc-1，内皮糖萼损伤的生物标志物)，这表明内皮糖萼损伤可能参与了患者[31]的动脉粥样硬化斑块易损过程。血栓调节蛋白(thrombobomodulin)是一种内皮膜糖蛋白，是C蛋白抗凝途径的重要组成部分，在调节纤溶[32]中起作用。我们的结果与先前的研究一致，表明ccs诱导的上调gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba肾上腺和主动脉的mRNA表达均伴有主动脉的下调gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba信使rna表达。此外，ccs诱导的上调gydF4y2BaNr3c1gydF4y2BamRNA的表达也有上调gydF4y2BaSdc1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaThbdgydF4y2BamRNA表达，提示内皮屏障功能受损和thbd介导的纤溶调节。此外，激活的NR3C1与糖皮质激素反应元件结合并与NF-相互作用gydF4y2Ba_КgydF4y2BaB是糖皮质激素介导的转激活和反式抑制相关的主要调节机制[33]。gydF4y2Ba

NF -gydF4y2Ba_КgydF4y2BaB是一个组成型表达的转录因子家族，影响细胞的生长、增殖和发育以及炎症和免疫反应[见文献34综述]。NF -gydF4y2Ba_КgydF4y2Ba由于NF-的作用，B通路被认为是一种典型的促炎信号通路gydF4y2Ba_КgydF4y2BaB在促炎基因的表达，包括细胞因子，趋化因子和粘附分子。在不同的内部和外部压力的反应，NF-gydF4y2Ba_КgydF4y2BaB是对炎症刺激的反应，如促炎细胞因子TNF-α信号通路和活化的NF-gydF4y2Ba_КgydF4y2BaB还能促进促炎细胞因子、趋化因子、受体和粘附分子的产生，包括TNF-α[34,35]。既往研究报道慢性轻度应激可使大鼠体内TNF-α循环水平升高，心理应激程度较大的教师体内TNF-α水平较高[36,37]。除本研究外，多项研究结果表明，抗tnf -α治疗可改善各种病理生理条件下的内皮功能障碍[38,39]。这些发现与我们的结果是一致的。我们发现ccs诱导gydF4y2BaNos3gydF4y2BamRNA的下调伴随着主动脉的上调gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-αgydF4y2Ba，gydF4y2BaNr3c1gydF4y2Ba,gydF4y2BaNfkb1gydF4y2Ba信使rna表达。因此，CCS激活HPA轴导致肾上腺和主动脉中NR3C1的产生增加，增加主动脉促炎介质(本研究中为TNF-α)，并导致在CCS中观察到的内皮功能障碍。gydF4y2Ba

主动脉壁上白细胞过多堆积有助于动脉粥样硬化的进展。我们的结果显示，ccs诱导的内皮功能障碍(图4)与主动脉壁白细胞过度积聚(图3A和3E)有关。内皮功能障碍和随后的炎症反应诱导粘附分子如PECAM-1的产生和免疫细胞如白细胞的募集，这反过来又延续了白细胞浸润、动脉粥样硬化斑块形成和不良血栓事件的恶性循环。白细胞迁移的过程始于炎症介质(如TNF-α)的产生和内皮细胞粘附分子的上调。这些支持了白细胞最初附着在内皮细胞上，并通过血管壁中相邻内皮细胞之间的连接进行迁移，以及包括PECAM-1在内的众多内皮细胞连接分子水平的变化[见文献20综述]。NF -gydF4y2Ba_КgydF4y2BaB信号转导通路在动脉内皮细胞中引发动脉粥样硬化病变的形成，pecam -1缺失小鼠未检测到NF-的激活gydF4y2Ba_КgydF4y2BaB或血流紊乱区域下游炎症基因的证据[40,41]。氧化LDL在内皮连接处上调PECAM-1和下调VE-cadherin，然后通过加强与单核细胞PECAM-1的同嗜性结合和破坏连接屏障分别促进单核细胞的进入，[42]。此外，既往研究表明，高胰岛素血症通过增加内皮细胞PECAM-1表达直接促进中性粒细胞向内皮细胞迁移，从而加速动脉粥样硬化[43,44]。体外研究表明，雷帕霉素可抑制人脐静脉内皮细胞氧化性LDL积累，降低其磷酸化的机制靶点，进而抑制NF-κB激活和抑制LOX-1，从而降低人脐静脉内皮细胞氧化性LDL摄取[45]。本研究表明，ccs诱导gydF4y2BaPecam1gydF4y2BamRNA的上调伴随着gydF4y2BaOlr1gydF4y2Ba(氧化LDL的受体)mRNA在小鼠主动脉中上调。结合之前的研究，主动脉上调gydF4y2BaPecam1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOlr1gydF4y2Ba在动脉粥样硬化过程中，mRNA的表达可能至少在一定程度上与CCS中观察到的主动脉壁白细胞堆积有关。gydF4y2Ba

致动脉粥样硬化的饮食也是导致动脉粥样硬化的原因gydF4y2Ba

在一项男性研究中gydF4y2BaApoEgydF4y2Ba^-/-gydF4y2Ba与西方饮食(43%碳水化合物，42%脂肪，15%蛋白质，0.15%胆固醇)相比，饮食中含有12%碳水化合物，43%脂肪，15%蛋白质，0.15%胆固醇)的小鼠动脉粥样硬化的进展更广泛，尽管饮食中脂肪和胆固醇含量相似，体重增加减少[13]。主动脉瓣水平动脉粥样硬化明显增多，斑块横截面积增大，证实了这一结论。在本研究中，野生型小鼠(C57BL/6j)饲喂12%碳水化合物、52%蛋白质、21%脂肪的AD后，动脉粥样硬化的进展也更为广泛，表现为max IMT和低回声斑块形成、主动脉平均面积、主动脉max Oil-Red-O含量和主动脉甘油三酯水平升高(图2和图3)，并且四组中，饲喂AD的CCS小鼠的max IMT、低回声斑块形成、Oil-Red-O含量和甘油三酯水平均最高。我们的结果表明，CCS和AD之间的协同作用可能与小鼠动脉粥样硬化的发展有关。然而，主动脉的变化gydF4y2BaPecam1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOlr1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba，gydF4y2BaThbdgydF4y2Ba，gydF4y2BaSdc1,gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-αgydF4y2Ba在信息水平上的研究还不足以完全阐明CCS与AD的协同作用导致动脉粥样硬化的发展，有必要进一步研究其潜在机制。gydF4y2Ba

限制gydF4y2Ba

本研究中使用的慢性复杂应激(CCS)小鼠模型仅在野生型小鼠中诱导轻度动脉粥样硬化病变。在最近的一项研究中，慢性固定应激(每天在固定应激管中4小时，持续12周)增强了血管内皮细胞的衰老和动脉粥样硬化斑块的生长gydF4y2BaApoEgydF4y2Ba^-/-gydF4y2Ba老鼠[46]。为了进一步研究CCS和AD对动脉粥样硬化的影响，我们建立了一种基于CCS和AD的动脉粥样硬化小鼠模型gydF4y2BaApoEgydF4y2Ba^-/-gydF4y2Ba而且gydF4y2BaLdlrgydF4y2Ba^-/-gydF4y2Ba老鼠是必要的。gydF4y2Ba

本研究采用降主动脉和腹主动脉;但与主动脉根部相比，降主动脉和腹主动脉较不易发生动脉硬化。这一局限性可能至少部分原因在于，与其他结果相比，CCS小鼠HE染色图像评估的平均主动脉壁区域变化不明显，如最大IMT(图2A和2C)和整个主动脉中CD45+细胞的百分比(图3A和3E)。然而，为了研究CCS和AD在动脉粥样硬化中的全部细节，包括主动脉根部、流出道在内的所有主动脉部分都是必不可少的，甚至使用了通用的无创超声生物显微镜和流式细胞术方法。gydF4y2Ba

在本研究中，我们评估了基因表型与ccs加速动脉粥样硬化发展之间的关系。然而，CCS加速小鼠动脉粥样硬化的过程不仅仅是基因表型的原因。对主动脉中动脉粥样硬化相关细胞的进一步分子生物学研究是必要的。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

心理应激可导致不良动脉粥样硬化;然而，其机制还没有得到很好的理解。神经和体液系统在应激源的类型和强度的变化中被激活，这表明了创建慢性复杂应激动物模型的重要性。本研究中使用的CCS可能构成了一种更好的模型，用于研究人类生活中发生的意外压力刺激。CCS，特别是当与致动脉粥样硬化饮食结合时，尽管小鼠血液TCHO降低，但通过内皮功能障碍和白细胞过度积累，加速了动脉粥样硬化的过程。肾上腺功能亢进、主动脉促炎基因共同上调(gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-αgydF4y2Ba，gydF4y2BaPecam1gydF4y2Ba,gydF4y2BaOlr1gydF4y2Ba),gydF4y2BaNfkb1gydF4y2BamRNA的表达可能参与内皮功能障碍和主动脉炎症反应的激活。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

作者要感谢Kenichi Sasamoto (Miltenyibiotec Tokyo)， Ihoko Fujimoto(山口大学)，Yuki Tanaka(山口大学)和Fuka Haruse(山口大学)的技术援助。gydF4y2Ba

资助及补助金gydF4y2Ba

本研究由日本科学促进会科学研究资助基金(no. 1)资助。25460869接刘金耀。17K09265发给Jinyao Liu)进行数据收集和分析。gydF4y2Ba

利益冲突gydF4y2Ba

不宣布gydF4y2Ba

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