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摘要

背景。有些皮肤黑色素瘤是由痣引起的，可以是先天性的，也可以是常见的。

摘要目的:我们的目的是比较:i)小/中型先天性痣和普通痣的基因组图谱，ii)探索这两组之间在发展为黑色素瘤的过程中是否获得了不同的突变模式。

方法:我们分析了微解剖黑素细胞痣上的BRAF、NRAS和TERT启动子状态，并对42例配对黑素瘤患者进行了大规模并行测序，其中一半来自先天性黑素瘤，一半来自普通类型黑素瘤。

结果:普通和小/中型先天性痣均以BRAF V600E突变为主，突变率相近。在黑色素瘤进展过程中，两组患者都获得了复发的第二击TERT启动子突变。在进展过程中，影响致癌途径的其他基因组改变也在积累，但没有特定的模式。

结论:小/中型先天性痣和普通痣具有相同的突变景观，在向黑色素瘤发展过程中没有表现出任何差异。

关键字

BRAF，先天性黑色素瘤，痣转化，TERT

简介

黑色素瘤是一种由黑色素细胞转化引起的恶性肿瘤。黑素细胞瘤的良性对应物，即黑素细胞痣，可以是先天性的，也可以是通常获得的，即分别在出生时出现或在生命的前几十年出现[1,2]。这两种良性实体之间的区别是基于经典的临床病史和表现。先天性痣往往疣状多毛。它们还显示出一些特定的组织病理学特征，如在真皮下层三分之二处存在痣细胞、附件结构的侵犯、血管周围定位和胶原束之间的分散。先天性痣通常分为两组，其发展为恶性黑色素瘤的风险不同:大痣和巨大痣的风险增加，而较小病变的恶性进展似乎较低[3-6]。

黑素细胞肿瘤通常与丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路的早期驱动体突变有关，主要在BRAF V600和NRAS Q61热点上。NRAS突变在较大的先天性痣中比在较小的先天性痣或普通痣中更容易复发。大规模并行测序(MPS)和RNA测序确定了皮肤黑色素瘤的不同分子亚型，有助于更好地理解从良性到恶性和侵袭性黑色素细胞病变的进展[7-10]。在原发性黑色素瘤的进化过程中，体细胞改变依次诱导MAPK通路激活、TERT启动子突变导致端粒酶上调、表观遗传调控因子调节、细胞周期检查点覆盖、p53通路中断和PI3K通路[9]激活。

在这里，我们比较了先天性痣和普通痣的突变景观，并探讨这两组在发展为黑色素瘤的过程中是否获得了不同的突变模式。

方法

患者选择

我们回顾性选择了42例由先天性或普通痣引起的黑色素瘤患者，并于2009年至2013年在法国里昂高等医院(Hospices Civils de Lyon, France)的肿瘤皮肤科接受治疗。在此期间，我们从数据库中最初发现的637例由痣引起的恶性黑色素瘤中，我们首先选择了114例Breslow指数高于0.7 mm的病例(17.9%)。两名病理学专家(BB, OH)分别对痣和相关恶性黑色素瘤的组织学和免疫组化诊断进行了评估。根据临床资料和组织学标准，共选取21例(18.4%)发生于“先天性痣型”(Cg)痣上的恶性黑色素瘤[2,3]。对照组为21例根据年龄、性别相匹配的“常见痣型”(Cm)恶性黑色素瘤。在获得知情同意后，收集样本进行标准护理，并存放在里昂文明临终关怀生物银行。我们从医学图表中收集了大小、位置、微测量布莱斯洛指数、组织病理学亚型和诊断时的年龄。

突变分析

在Leica DM6000B仪器(Leica Microsystems, Germany)上对痣和恶性黑色素瘤隔室进行激光显微解剖后，对石蜡包埋福尔马林固定(FFPE)标本进行测序(图S1)。平均为1009,480 μm²肿瘤细胞和267,061 μm²为每个病例收集痣细胞。使用QIAamp DNA微试剂盒(Qiagen, France)从混合的多个微解剖组织中提取DNA，并在Qubit仪器(Life Technologies, UK)上进行量化。使用内部引物扩增BRAF外显子15和NRAS外显子3，并在ABI PRISM 3730xl仪器上测序(Applied Biosystems, USA)。使用内部嵌套PCR扩增TERT启动子区，扩增子序列如上所述。我们在Ion Torrent PGM仪器(Thermo Fischer, UK)上对微解剖的黑色素瘤进行了内部AmpliSeq靶癌基因(表S1)的大规模并行测序。值得注意的是，在黑素瘤中经常突变的CDKN2A、ARID2/ARID1A和TP53基因不包括在这组[9]中。

结果

由先天性和常见痣引起的黑色素瘤的临床和组织病理学表现

本研究共分析42例，每组21例(见方法部分)。所有痣均为中小型痣。在我们的队列中没有大痣或巨大痣，因为这些病变罕见。两组在诊断黑色素瘤时的微测量Breslow厚度指数、AJCC分期、临床大小、男女比例和年龄相似(表1)。我们没有观察到先天性组和普通组在黑色素瘤位置上的差异。关于预后，先天性组的PFS(无进展生存期)为31.3个月，而普通黑色素瘤组为29.1个月(p=ns)。同样，两组间OS(总生存期)无显著差异(34.6 vs 35.1个月)。

表1。黑素瘤的临床和组织学特征

	先天性痣组	常见痣组	假定值
	(n = 21)	(n = 21)
年龄(年)	41 (26 - 79)	50 (27 - 80)	ns1
性别比例(男/女)	11/10	13/8	ns2
临床尺寸(毫米)	13.5(速率)	11 [4]	ns1
布莱斯洛指数(mm)	2.06 (0.9 - -5.5)	1.88 (0.8 - 5)	ns1
与分期
1	14 (66.7)	16 (76.1)	ns3.
2	3 (14.3)	1 (4.8)
3.	2 (9.5)	1 (4.8)
4	2 (9.5)	3 (14.3)
位置
树干	10 (47.6)	11 (52.4)	ns3.
肢体	7 (33.3)	10 (47.6)
肢端的	1 (4.8)	0 (0.0)
脸	3 (14.3)	0 (0.0)
生存
PFS(个月)	31.3±24.0	29.1±18.7	Ns4
操作系统(个月)	34.6±20.7	35.1±14.3	Ns4

ns:非标准;¹:配对学生t检验;²:麦克内马尔检验;^3.: Chi-2检验;PFS:无进展生存期;OS:总生存期;⁴OS和PFS以平均生存期±标准差表示，年龄、临床大小和布莱斯洛指数为中位数[范围]，AJCC分期和部位为n(%)。

因此，在我们的队列中，小/中型先天性痣和普通型痣引起的黑色素瘤具有相同的临床和组织病理学特征和相似的预后。

BRAF、NRAS和TERT热点突变的模式

我们成功获得34例痣(81%，34/42)和38例恶性黑色素瘤(90.5%，38/42)的BRAF和NRAS状态(表S2)。失败主要是由于DNA质量不足，突出了回顾性分析旧FFPE样品的困难。

BRAF V600E突变分别发生在70.6%(12/17)的先天性痣和64.7%(11/17)的普通痣(p=ns)。先天性组NRAS Q61在痣中突变的频率为28.6%(4/14)，而普通组为25.0% (4/16)(p=ns)。3个痣(Cg组2个，Cm组1个)同时存在NRAS和BRAF突变。双BRAF/NRAS阴性痣少见:Cg组2例，Cm组3例。

tert启动子测序发现，在先天性痣(5/ 10,50%)或普通痣(6/ 9,66.7%)引起的黑色素瘤中，C250T或C228T都有复发性突变。重要的是，没有配对痣发生TERT突变(表S2)。普通组与先天性组TERT突变频率差异无统计学意义。有趣的是，我们观察到在肿瘤进展到转移性黑色素瘤的过程中，TERT突变率有增加的趋势。

总之，这些结果表明，由先天性痣和常见痣引起的黑色素瘤以相似的速度携带BRAF、NRAS和TERT突变。他们还强调了端粒酶激活在进展过程中的潜在关键作用。

黑色素瘤的大规模平行测序

为了进一步了解由普通或小先天性痣引起的恶性黑色素瘤的动态分子景观，我们通过对泛癌MPS面板测序完成了这一初始突变筛选(见方法部分)。我们得到了17例患者的结果(图1和表S3)。失败的原因是显微解剖组织标本中完整的DNA数量较少。由于缺乏DNA材料，我们无法对成对的微解剖痣进行MPS。

当痣中的BRAF或NRAS发生突变时，相应的黑色素瘤也存在同样的突变。与相关痣(13/17)相比，76.5%的黑色素瘤含有额外的突变，平均每个肿瘤有3个突变(52/17)。导致RAS/RAF/MAPK通路激活的突变总发生率为94.1%(16/17)，其余肿瘤(Cg3)为所有检测的热点肿瘤的野生型。其他发现的突变影响PI3K通路(PTEN丢失，AKT1或PIK3CA激活)，酪氨酸激酶受体信号(CKIT, EGFR, FGFR3, c-MET)和表观遗传调控(IDH1, H3F3A)。我们还观察到RAC1和FOXL2基因的致病性突变，RAC1只在braf突变的转移性黑素瘤中发生突变。在黑色素瘤发展过程中观察到突变事件的积累，AJCC1组为2,AJCC4组为5。我们观察到小/中型先天性组和普通组的分子改变模式相似。

图1所示。痣性黑素瘤的基因组进化。Cg，先天性组;Cm，普通组。AJCC1到AJCC4, AJCC皮肤黑色素瘤分期。绿条:TERT野生型(WT);红色条:TERT突变(+)。0，未发现突变;*，非规范BRAF/NRAS突变

讨论

恶性黑色素瘤在少数病例中源于痣。这项回顾性研究的目的是比较小的先天性痣和常见痣的临床、组织学和突变特征，以及恶性黑色素瘤发展过程中基因组改变的积累。

在我们的研究中，几乎所有的黑素细胞痣(81%)都含有导致MAPK通路激活的体细胞BRAF/NRAS突变。如前所述，该通路的激活足以诱导痣形成[11,12]。在这里，我们报告了小/中型先天性痣组和普通痣组具有相同的复发性BRAF/NRAS驱动突变，频率相似，其中BRAF V600E是最常见的。然而，之前的一些研究报道NRAS Q61是大型和巨型先天性黑素细胞痣[12]唯一的复发突变。这种差异可能是由于我们队列中病变的临床大小不同，BRAF V600E突变在较小的先天性痣中更常见[13,14]。在大型先天性痣中，具有干细胞特性的祖细胞携带体细胞NRAS Q61突变，保持痣大小为[15]。BRAF V600突变可能在小或中型痣中发挥类似的作用，无论是否先天性。这可能解释了为什么两组恶性肿瘤进展风险相同，且低于较大肿瘤[5,6]。

与痣相比，小/中型和常见痣引起的黑色素瘤含有一些额外的突变。这些改变影响了其他主要的致癌途径，如PI3K途径，受体酪氨酸激酶信号，逃避衰老或表观遗传控制。重要的是，观察到的平均突变数与侵袭性相关，转移性黑色素瘤是突变最多的。与以往的报道一致，有大量具有紫外线特征的突变，这意味着即使在组织标本或年轻患者中没有暴晒迹象，紫外线辐射是黑色素瘤的主要诱变原[9,16,17]。至于痣，在比较先天性组和普通组黑色素瘤的突变谱时，没有明显的区别。

有趣的是，在nras突变的黑色素瘤中未发现PIK3CA/AKT1突变，而在半数braf突变的黑色素瘤中也存在PI3K通路的额外激活突变。这种差异可能是因为NRAS同时激活MAPK和PI3K/AKT通路，而BRAF只激活MAPK通路。同样，RAC1突变只存在于braf突变的转移性黑色素瘤中。该途径与较高的增殖和对BRAF抑制剂[18]的耐药性有关。braf突变患者的这些额外突变可能解释了转向抗braf靶向治疗的原因，并强调了联合治疗的潜在好处。

我们观察到，TERT启动子突变在黑色素瘤中反复激活端粒酶，但在痣中没有，指出了TERT在恶性转化过程中的关键“第二击”作用。我们确实观察到从AJCC1病灶到转移性黑色素瘤的TERT突变率增加。Bastian等人此前将这种改变定性为黑色素瘤进展中的“发育不良痣”的早期事件，这是一种预后和治疗未知的非典型实体[19]。在这些病变中，他们发现了一些黑色素瘤中经常报道的其他突变，如CDKN2A失活、MAPK或PI3K激活，这表明其中一些病例可能是恶性黑色素瘤[9]。

结论

总之，我们在此报告由小/中型先天性痣和普通痣引起的黑色素瘤具有相似的突变格局。BRAF V600E是这些nevi的主要驱动。突变的TERT启动子激活端粒酶可能在黑色素瘤发展过程中作为“第二次打击”发挥重要作用。

利益冲突

没有宣布

作者贡献陈述

OH、GT、FD、BB、LD和PPB进行了研究;SD和JL设计了研究性研究;OH、BB、SD和JL对数据进行了分析;OH, JC, LT, SD和JL是论文的作者。

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