看看最近的文章

摘要

黄嘌呤氧化还原酶(XOR)抑制剂、别嘌呤醇、非布索他和托吡洛索他是高尿酸血症和痛风的治疗药物，它们本应是相同的。然而，在最近的临床和动物研究中，这可能是不同的影响。别嘌呤醇的活性是其代谢物奥西嘌呤醇的活性，其他活性是其自身的活性。这些异or抑制剂在异or抑制中有不同的作用模式。评价XOR在添加或不添加人血清白蛋白(HSA)和HSA结合试验中的抑制活性，并根据scatchard和Klotz图分析计算其常数。此外，基于重复剂量研究的药代动力学模拟血浆XOR抑制活性。模型中的异或活性随着S9分数的增加而增加。集成电路₅₀奥嘌呤醇、非布索他和托吡洛索他的浓度分别为244±50 nM、20.5±2.8 nM和1.26±0.25 nM。非布司他剂量依赖性地减弱了HSA对异or的抑制活性，而奥西嘌呤醇和托替洛司他对HSA的影响很小。另外，非布司他和托吡洛司他与HSA的结合常数(K)为8.07×10⁴米^－1和1.38×10⁴米^－1两种药物与HSA的结合方式均非特异性。此外，最低水平的非布索他(20mg, 1次/日)和托吡洛索他(80mg, 2次/日)的异or抑制活性估计分别为61.4%和86.8%，这表明一天两次的剂量是连续抑制血液中异or活性的理想剂量。白蛋白对非布索他血浆XOR活性的影响，对托吡洛索他无影响。因此，托吡洛司他与XOR结合高效，是血浆XOR最强的抑制剂。

缩写

CV:变异系数;LC:液相色谱;定量下限;定量下限;SD:标准差;再保险;相对误差;TQMS:三重四极杆质谱法;UA:尿酸;XDH:黄嘌呤脱氢酶;XO:黄嘌呤氧化酶; XOR: Xanthine Oxidoreductase; PK/PD: Pharmacokinetics/Pharmacodynamics; ALT: Alanine Transaminase; AST: Aspartate Transaminase; eGFR: estimated Glomerular Filtration Rate; HSA: Human Serum Albumin

关键字

黄嘌呤氧化还原酶，托吡洛索他，非布索他，别嘌醇，人血清白蛋白，克洛茨图

简介

黄嘌呤氧化还原酶(XOR)是由三个结构域、两个不相同的2Fe-2S中心、一个FAD辅助因子和一个钼嘌呤辅助因子组成的分子质量为150 KDa的同型二聚体，在人体嘌呤代谢的最后两个步骤中催化次黄嘌呤氧化为黄嘌呤和黄嘌呤氧化为尿酸(UA)[1,2]。目前，别嘌呤醇、非布索他和托吡洛索他作为XOR抑制剂(XOR- i)被用于治疗高尿酸血症和痛风。这些XOR-Is不仅具有降低尿酸的作用，而且在慢性肾脏疾病或伴有高尿酸血症的糖尿病患者和动物研究中也显示出衰减白蛋白尿和估计GFR (eGFR)下降的作用[3-9,10-12]。

有趣的是，xor - i之间似乎有一些差异。例如，Sezai等报道非布索他在降低尿酸和抗氧化方面优于托吡洛索他，而保护肾脏和抗炎作用相似，Terawaki等报道将非布索他的干预切换到托吡洛索他可以减少高尿酸血症患者的蛋白尿[13,14]。此外，在动物实验中，尽管托吡洛索他的血浆浓度低于非布索他，但其在血浆中的抑制活性最强，提示其抑制活性[12]与白蛋白有关。由于只有游离药物才能发挥药理作用，因此检测血清白蛋白与药物[15]的结合亲和力非常重要。此外，利用纯化的异or酶对异or - is进行了一些生物学表征。然而，使用生物样本(如血液或器官)的检查对于研究XOR-Is的行为也是必不可少的在活的有机体内．

本研究以人血浆模型和人血清白蛋白(HSA)为实验对象，通过体外实验验证了白蛋白可能干扰XOR抑制活性的假说，并评价了HSA与非布索他或托iroxostat的结合亲和力。此外，通过对托吡洛司他在健康人体内的药代动力学研究，为了解血浆XOR抑制活性提供了依据。

材料和方法

化学物质，标准物和空白等离子体

黄嘌呤，次黄嘌呤和NAD⁺从Sigma-Aldrich日本(东京，日本)购买。奥西嘌呤醇、尿酸和磷酸盐缓冲盐水(PBS)来自Wako纯化学工业有限公司(日本大阪)。所有使用的其他材料都可以在市场上买到。Topiroxostat, (¹³C,¹⁵N] topiroxostat, febuxostat， [²H₆] febuxostat, [¹³C₂，¹⁵N₂]黄嘌呤,¹³C₂，¹⁵N₂UA, (¹³C_3.，¹⁵N_3.UA在我们的实验室合成[16]。正常人血浆(EDTA-2K)和个人血浆(EDTA-2K)分别从Funakoshi(东京，日本)和Tennessee Blood Services (TN，美国)购买。30%白蛋白，人血清(HSA)水溶液购自Merck Millipore (MA, usa)。人肝匀浆中的S9馏分购自Sekisui Medical(日本东京)。

人血浆和S9的制备

所有人血浆样本和S9隔室均保存在−80°C，直到每次检测结束，并在使用前使用Sephadex G25色谱柱(PD-10或PD MultiTrap G25)进行纯化。为了制备具有高XOR活性的血浆模型，将S9和人血浆按1:99 (1% S9/人血浆)的比例混合，在37℃下孵育20分钟。然后，将混合物用于后续各试验。

高异or活性等离子体模型的建立

建立在体外高异or活性血浆模型，S9室作为异or酶的来源。将S9室与正常人血浆以不同浓度(血浆中0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0和5.0% S9, v/v)混合，并按下节所述测量XOR活性。

XOR活性测定

采用稳定同位素标记黄嘌呤/液相色谱-三重四极杆质谱(LC-TQMS)[17]法测定异或活性或异或抑制活性。简而言之，样品与含有[的PBS混合¹³C₂，¹⁵N₂黄嘌呤,河畔⁺, (¹³C_3.，¹⁵N_3.]UA, 37℃孵育90 min。然后加入300 μ L甲醇，4℃3,000×g离心15 min。随后，上清液被转移到新的管中，并使用离心蒸发器干燥。用150μL蒸馏水重组残渣，通过超滤膜过滤，使用LC-TQMS进行测量，该LC-TQMS由Nano Space SI-2 LC系统(资生堂，东京，日本)和配备电喷雾电离界面的TSQ-Quantum TQMS (Thermo Fisher Scientific GmbH，不来梅，德国)组成。校正标准样本[¹³C₂，¹⁵N₂也测量了UA和[¹³C₂，¹⁵N₂UA产量(pmol)由校准曲线定量。XOR活性表示为[¹³C₂，¹⁵N₂UA在pmol/h/mL血浆中。XOR抑制活性(%)由下式计算

(在哪里一个_XORi]和[一个_续]分别是有XOR- is和没有XOR- is的XOR活动。集成电路₅₀使用Phoenix®WinNonlin®6.4软件(A Certara^TM公司)。

电泳和Western Blot分析

血浆和S9隔室样品在Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA, usa)中在95°C下煮沸5分钟，并将15μg蛋白质加载到凝胶(micro - protean TGX凝胶4-20%，#456-1095,Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA, usa)上的每个孔中。用BCA蛋白检测试剂盒(日本东京赛默飞世尔科学公司)测定蛋白质浓度。然后，进行western blotting和SDS-PAGE，用Trans-BLOT TURBO (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA, usa)将蛋白转移到PVDF膜(Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA, usa)。人XOR抗体(ab109235;Abcam, Cambridge UK)和抗兔IgG, HRP (Cat# NA934V, GE Healthcare UK Ltd，)分别在1:1000和1:5000与2%脱脂牛奶中使用。使用ECL Prime Western Blotting检测试剂RPN2232 (GE Healthcare UK Ltd.， Little Chalfont，白金汉郡，英国)，ChemiDock XRS Plus (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA, usa)捕获膜10 - 30秒。

奥西嘌呤醇、非布索他和托吡洛索他的XOR抑制活性测定

XOR抑制活性试验采用奥西嘌呤醇、非布索他和托吡洛索他作为XOR- i。将100µL的1% S9/人血浆与各XOR- is中不同浓度的10µL混合，在室温下孵育60 min。随后，如上节所述，测定XOR活性。为此，制备了一组血浆样本和三组血浆样本，进行了四次重复分析。

HSA对异or抑制活性的影响

为了评估HSA对XOR抑制活性的影响，将不同浓度的HSA (PBS中0、0.4、2.0和4.0%)与S9按99:1的比例制备，然后将1% S9中的HSA与各种XOR- is混合。混合物在室温下孵育60分钟。随后，如上节所述测定异or活性。这些试验是重复进行的。

非布司他和托吡洛司他对HSA的体外结合亲和力

用超滤法评价HSA与托吡索司他或非布索司他的结合亲和力。将含有0,500,1,000,2,000,5,000,10,000和20,000 ng/mL非布索他或托吡洛索他的0.4% HSA混合物在室温下孵育5分钟。然后，将样品加入超滤膜离心装置(Centrifree®，Merk Millipore, MA, usa)，在25℃下离心20分钟，收集超滤液。随后，将超滤液与[²H₆非布索他或[¹³C,¹⁵采用LC-TQMS (Nano Space SI-2/TSQ-Quantum)法测定。测定托吡索司他或非布索司他的标准溶液，根据标准曲线计算超滤液的药物浓度。这些试验是重复进行的。非布索他或托吡洛索他与HSA的结合参数由scatchard图和双重倒数图(Klotz图)[18]估计，

而且

在哪里铜是非结合药物的浓度，r结合药物与HSA摩尔浓度之比，n一个蛋白质分子上的结合位点的数量K分别是关联常数。

非布司他和托吡洛司他给药后人血浆XOR活性的模拟

估计的XOR抑制活动等离子febuxostat或topiroxostat剂量后,药效学分析使用药物浓度进行药代动力学研究的基础上重复剂量研究当tmx - 67 (febuxostat)口头管理在剂量20毫克剂量(1)7天在正常肾功能科目或topiroxostat口头注射剂量80毫克剂量(2)后7天的早上和晚上吃饭健康受试者,分别(19、20)。采用Emax模型公式[21]计算给药后各时间点药物异or抑制活性(E);

在哪里E_马克斯非布司他和托吡洛司他的最大效果是电子商务₅₀(集成电路₅₀）为非布司他和托吡洛司他的浓度(ng/mL)，观察到其最大效果的50%。C为各时间点非布索他和托吡索他的血药浓度(ng/mL)。

统计分析

数据用均值±标准差表示。统计分析采用统计分析软件(SAS) 8.0程序(SAS Institute, Cary, NC, USA)，对模型中对照组混合血浆和S9混合液进行非配对t检验。采用多元回归分析考察各药物和HSA浓度对XOR抑制活性的影响。p值小于0.05为有统计学意义。

结果

高异或活性模型在体外分析

与混合对照血浆相比，S9的含量在0.025 - 5%的范围内，异or活性增加(图1a)。在接下来的试验中，该模型中的混合物选择1% S9作为异or抑制活性。模型血浆中谷丙转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)显著高于对照组血浆(ALT;23.8±0.5 U/L vs. 350±0.5 U/L (n=4)， p < 0.001;12±1.4 U/L vs. 140±1.4 U/L (n = 4)， p < 0.001)。此外，通过western blotting对S9隔室中的XOR蛋白进行了确认(图1b)。

图1所示。(a) XOR活性与人肝S9间室的线性关系。异or活性(pmol/h/mL)数据用均值±SD表示(n=3)， (b) S9室和血浆中异or的蛋白分析。Lane 1:分子标准，Lane 2:人血浆15μg, Lane 3:人血浆和1% S9室15μg, Lane4:抗人XOR抗体细胞膜上S9室15μg

本模型显示XOR-Is的抑制作用

在没有抑制剂的情况下，血浆XOR活性为2240±183 pmol/h/mL (n=4)，各XOR抑制剂的抑制曲线呈乙形(图2)₅₀oxpurinol、febuxostat和topiroxostat的值和95%置信区间(CI)分别为244±50 nM [95% CI: 202-286]、20.5±2.8 nM [95% CI: 18.1-22.9]和1.26±0.25 nM [95% CI: 1.05-1.47] (n=4)(图2)。

图2。西嘌呤醇(菱形)、非布索他(三角形)和托吡洛索他(圆形)对人血浆和肝脏S9混合物中异or活性的抑制曲线。抑制率%用平均值±标准差表示(n = 4)

HSA对异or抑制活性的影响

对XOR抑制活性变化的影响因素进行多元回归分析，结果显示，所有药物中药物浓度均与XOR抑制活性相关(p<0.0001)，非布索他的HSA浓度与XOR抑制活性呈依赖相关(p=0.019)，而奥嘌呤醇和托吡洛索他与XOR抑制活性独立相关(p=0.537和p=0.491)。因此，当HSA浓度上升0% ~ 4%时，非布索他的抑制曲线显著向右侧移动，而外源性HSA浓度下，奥西嘌醇和托吡洛索他的抑制曲线不显著(图3a-c)。的集成电路₅₀西嘌呤醇、非布索他和托吡洛索他在0%、0.4%、2%和4%浓度下的值和95% CI见图3d。

图3。不同HSA浓度下，奥嘌呤醇(a)、非布索他(b)和托吡洛索他(c)对人肝S9中XOR活性的抑制曲线(d) IC汇总表₅₀每种药物的值。抑制曲线0%(菱形)，0.4%(三角形)，2%(正方形)和4%(圆形)HSA。横轴表示HSA/S9混合物中XOR抑制剂的最终浓度。集成电路的值₅₀95%置信区间(CI)分别用均值±SD和括号内表示

非布司他和托吡洛司他的HSA结合试验

为了评估非布司他或托吡洛司他的结合方式和与HSA的亲和力，结合参数通过scatchard和klotz图分析进行估计(图4a)。scatchard和klotz图分析显示，r/Cu几乎随r的增加而恒定。在双倒数图分析中，非布索他的斜率和y截距分别为6.10和0.492，托吡洛索他的参数分别为99.9和1.38。因此，非布司他和托吡洛司他与HSA的结合常数(K)为8.07×10⁴米^－1和1.38×10⁴米^－1，每个蛋白质分子的结合位点数分别为2.03和0.72(图4b)。由于奥西嘌呤醇不与白蛋白结合，所以不能确定其结合参数。

图4。XOR抑制剂非布索他(钻石)和托吡洛索他(圆形)对HSA亲和力的Scatachard图(a)和Klotz图(b)分析

非布司他和托吡洛司他给药后人血浆XOR活性的模拟

hosoy等报道了非布司他给药后的药代动力学研究结果(图S1)，也显示了托吡洛司他给药后的药代动力学研究结果(图6a)[19,20]。Emax和电子商务₅₀由体外模型的抑菌曲线计算非布索他和托吡洛索他的抑菌值如图2所示，分别为101.1%和6.47 ng/mL和96.2%和0.312 ng/mL。非布索他给药后24小时血浆XOR抑制活性(10、20、40 mg组)和托吡索他给药后12小时血浆XOR抑制活性(40、80、120 mg组)分别为44.1%、61.4%、76.4%和79.1%、86.8%、89.7%(图6b、6c)。

讨论

本研究建立了模拟血管内条件下高血浆异or活性的体外测定模型。最近Murase等报道，正常人血浆中XOR活性较低，为89.1±55.1 pmol/h/mL (n=20)，太低，无法准确测定血浆XOR抑制活性[17]。当肝细胞翻转时，肝脏加工的XOR蛋白被释放到血流中，并被血流中的蛋白酶[22]修饰。这种异or活性使我们得出结论，商用正常人血浆和外源性人肝S9腔室的混合物是异or抑制活性的理想实验模型。重要的是，该试验模型是使用肝脏匀浆，而不是纯化酶，作为XOR酶更接近体内环境。

混合物中S9室的浓度选择为1%，足以评估XOR的抑制活性(图1a)。与以往报道的正常血浆相比，XOR活性约为25倍，也覆盖了队列研究的一般人群和糖尿病和慢性心力衰竭患者的血浆XOR活性[17,23-25]。然而，混合物中的XOR蛋白没有检测到(图1b)。这可能是因为XOR蛋白非常敏感，立即转化为XO或被蛋白水解[26]分解。

别嘌呤醇和托吡洛索他表现出时间依赖性的抑制作用，如既往报道[27,28]所述。在初步研究中，IC₅₀随着预孵育时间的延长，奥西嘌呤醇和托吡洛司他的值逐渐降低;然而，非布索他没有改变(图S2)。这是因为每种药物都需要时间来达到混合物中结合条件的平衡。因此，在本研究中，抑制活性测定选择了60min的预培养时间。

的集成电路₅₀另外，非布索他的XOR抑制活性是根据HSA浓度进行对抗的，而奥西嘌呤醇和托维索他的XOR抑制活性不显著(图3)。这些结果与之前在动物模型中的报道一致，说明血液中白蛋白是许多药物最丰富的转运蛋白，受到非布司他与XOR酶相互作用的干扰[12,29]。因此，我们评估了非布索他和托吡洛索他对HSA的结合方式和亲和力。

scatchard和klotz图分析结果显示，两种药物与HSA的结合方式均为非特异性结合(图4a)，非布索他的结合常数(K)是托吡洛索他的5.8倍(图4b)，每一个白蛋白分子与非布索他的结合数也比托吡洛索他高2.8个单位。因此,集成电路₅₀与托吡洛司他相比，值更高。这可能是由于托吡洛司他易于从白蛋白中释放，且非抗药具有生物有效性，且生物有效性残留在血浆中，导致托吡洛司他发挥了XOR的抑制活性。

这些XOR- is有不同的结合方式，与作为XOR活性位点的鳍氨酸钼中心结合。别嘌呤醇是嘌呤类似物，而非布索他和托吡索他是非嘌呤选择性抑制剂[28,30]。奥西嘌呤醇是别嘌呤醇的活性代谢物，通过共价键与XOR结合，非布索他在氢键、范德华力、疏水相互作用和离子结合等方面具有多重相互作用，托吡洛索他在机理上既具有多重相互作用又具有共价键结合(图5)[28,31,32]。在这里，别嘌呤醇不与白蛋白结合，所以没有评估对HSA的亲和力。因此，这一结果表明，托吡洛索他对血浆XOR活性的抑制作用可能比非布索他在更低的浓度下发挥作用，且具有较高的抑制作用。

抑制血浆XOR活性有什么生理意义?有人报道血浆XOR活性升高与人类肥胖、糖尿病、心血管和肝脏疾病有关，可与尿酸和玫瑰ROS一起产生超氧化物，导致心血管疾病和死亡器官损伤的风险增加[29,33-43]。此外，Spiekermann等报道，在冠状动脉疾病患者的肝素后血浆中，血浆XO活性也增加，导致游离XORs与血液内皮细胞上的糖胺多糖结合的组织或器官可能在局部区域[38]被XO诱导的超氧化物损伤。然而，这一过程尚不清楚。此外，Eugene et al.[44]报道了人类昼夜节律中UA和一氧化氮之间的时间倒数关系，提示抑制XOR活性可能是维持no介导的血管舒张和降低夜间UA水平的重要手段。因此，抑制血浆XOR活性可能是非常重要的。

根据每种药物的使用情况，进行PK/PD模拟，估计非布索他(20mg QD)和托吡索他(80mg BID)给药后血浆XOR活性，给药后24小时最低抑制活性(%)为61.4%，给药后12小时最低抑制活性(%)为86.8%(图6b、6c)。最近，Srinivasan B等报道非布索他对高尿酸血症和2型糖尿病肾病患者的干预并没有降低尿白蛋白，而尿白蛋白是血管内皮细胞损伤的标志物，而在随机临床研究中托吡洛索他却降低了尿白蛋白[7,45]。从血管保护的角度来看，继续抑制血液中额外异or诱导的ROS一天是很重要的。因此，在临床试验中，托吡洛索他可持续抑制血液中XOR活性，每日2次，从而抑制蛋白尿。

图5。对异or抑制剂别嘌呤醇、非布索他和托吡洛索他与异or的相互作用(异or与白蛋白的结合模式和平衡结合常数)进行了综述

图6。健康人重复口服80 mg (BID)托维索他7天后的血药浓度(a)。非布索他和托维索他的XOR抑制曲线如图2所示，计算E_马克斯和电子商务₅₀对E_马克斯模型分析。以非布索他20mg(1剂，循环)和托吡索他80mg(2剂，循环)给药7 d为重复剂量试验，根据PK数据模拟非布索他(b)和托吡索他(c)的异or抑制活性(0 ~ 12小时或24小时)。按比例计算非布索他10mg-剂量(1个剂量，菱形)和40mg-剂量(1个剂量，三角形)和托吡洛索他40mg-剂量(2个剂量，菱形)和120 mg-剂量(2个剂量，三角形)

本研究存在一定的局限性。首先，异或形式复杂;黄嘌呤脱氢酶(XDH)使用NAD⁺黄嘌呤氧化酶(XO)利用氧生成超氧化物和H₂O₂[1, 46-48]。然后，根据原子与钼原子的结合，XOR是活性(Mo=S)或非活性(Mo=O)形式，前者是所谓的“脱硫”型，后者是所谓的“硫”型，并氧化(Mo(VI))或还原(Mo(VI))形式[26]。此外，它很容易通过冷冻、制备等方式交换构象，因此，异或与它在混合物和血液中的情况不同体内。然而，肝匀浆中的S9部分是在别嘌呤醇[49]存在的情况下制备的。因此，这表明异或的转换，特别是非活性形式可能是最小的。其次，本实验没有反映锚定XOR活性。最后，需要进行临床干预研究以确保模拟结果。

结论

建立了人血浆与肝脏S9腔室混合的高XOR活性模型。根据IC₅₀在XOR抑制曲线上，托乙索他是最强的抑制剂，白蛋白对托乙索他的反应影响不大。相比之下，非布索坦在HSA结合方面强于托吡洛索坦，因此XOR抑制活性可能较弱。因此，托吡洛司他在低浓度下可能具有XOR抑制活性。这意味着它是高效的。此外，根据模拟结果，topiroxostat (80mg，分2次)可以连续抑制血浆XOR活性一天。

作者的贡献

TN和TM撰写了手稿。TN、TM、AM、NK和YN设计了研究。TM和ES进行了研究和收集数据。TM, AM和YN对数据进行了分析。NO和KA进行统计分析。

确认

感谢minami Inagaki女士、ai Matsushita女士和Hiromi Nishitani女士对样品测量的技术支持。

的利益冲突

所有作者均为三和佳乐健久株式会社员工。作者没有利益冲突需要披露。

资金

这项工作是我们自己的原创，没有任何来自其他公司或政府的资金和方法。

参考文献

1. Amaya Y, Yamazaki K, Sato M, Nada K, nisino T，等(1990)黄嘌呤脱氢酶从Nada依赖型向o2依赖型的蛋白水解转化。大鼠肝脏黄嘌呤脱氢酶的氨基酸序列及胰蛋白酶不可逆转化过程中酶蛋白裂解位点的鉴定。J临床生物化学265: 14170 - 14175。
2. Bray RC(1975)钼铁硫黄酮羟化酶和相关酶。《酶十二集》(Boyer PD, ed)， 300-419页，文献出版社，纽约，旧金山，伦敦。
3. 陈晓燕，陈晓燕，陈晓燕，等(2010)别嘌呤醇在慢性肾脏病进展和心血管风险中的作用。临床J Am Soc肾小球5: 1388 - 1393。(Crossref)
4. Kanbay M, Ozkara A, Selcoki Y, Isik B, Turgut F，等。(2007)别嘌呤醇治疗高尿酸血症对肾功能正常患者血压、肌酐清除率和蛋白尿的影响。Int Urol Nephrol39: 1227 - 1233。
5. Michael AB, H Ralph Schumacher(2010)非布司他治疗痛风高尿酸血症的降尿酸疗效和安全性:confirm试验。关节炎Res其他12: R63。
6. Whelton A, Macdonald PA, Zhao L, Hunt B, Gunawardhana L(2011)非布司他对痛风患者肾功能的长期影响。中国Rheumatol17: 7 - 13。(Crossref)
7. Hosoya T, Ohno I, Nomura S, Hisatome I, Uchida S，等(2014)托吡洛索他对伴有或不伴有痛风的高尿酸血症3期慢性肾病患者血清尿酸水平和尿白蛋白排泄的影响。中国Exp Nephrol18: 876 - 884。(Crossref)
8. Wada T, Hosoya T, Honda D, Sakamoto R, Narita K，等。(2018)选择性黄嘌呤氧化还原酶抑制剂托吡洛索他在糖尿病肾病和高尿酸血症患者中的降尿酸和肾保护作用:一项随机、双盲、安慰剂对照、平行组研究(up研究)。中国Exp Nephrol22日:860 - 870。(Crossref)
9. Mizukoshi T, Koto S, Ando M, Sobajima H, Ohashi N，等(2018)topiroxostat对高尿毒症合并明显糖尿病肾病患者的肾保护作用研究(ETUDE研究):一项前瞻性、随机、多中心临床试验。肾脏学23:1023 - 1030。
10. 小杉田，中山田，黑宁美，张磊，汤泽莹，等。(2009)降低尿酸对2型糖尿病db/db小鼠肾脏疾病的影响。Am J Physiol肾Physiol297: f481 - 488。(Crossref)
11. 李海杰，郑赫，金yg, Moon JY, Lee SH，等(2014)非布索坦改善链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型的糖尿病肾损伤。是J Nephrol40: 56 - 63。
12. Nakamura T, Murase T, Nampei M, Morimoto N, Ashizawa N，等(2016)托吡洛索他和非布索他对db/db小鼠尿白蛋白排泄和血浆黄嘌呤氧化还原酶活性的影响。欧元J杂志780: 224 - 231。
13. Sezai A, Obata K, Abe K, Kanno S, Sekino H(2017)非布索他和托吡洛索他治疗心血管疾病高尿酸血症的交叉试验(TROFEO试验)。中国保监会J81: 1707 - 1712。(Crossref)
14. Terawaki H, Hoshi H, Kazama JJ(2017)将黄嘌呤氧化还原酶抑制剂从非布索他切换到托吡洛索他对尿蛋白排泄的影响。中国Exp Nephrol21日:356 - 357。(Crossref)
15. Fasano M, Curry S, Terreno E, Galliano M, Fanali G，等(2005)人血清白蛋白的特殊配体结合特性。IUBMB生活57: 787 - 796。(Crossref)
16. Murase T, Nampei M, Oka M, Miyachi A, Nakamura T(2016)一种使用[13C2,15N2]黄嘌呤和液相色谱/三重四极杆质谱结合的高灵敏度黄嘌呤氧化还原酶活性测定方法。标记的放射性药品59:214-20。
17. Murase T, Nampei M, Oka M, Miyachi A, Nakamura T(2016)使用稳定的同位素标记黄嘌呤和LC/TQMS对人血浆黄嘌呤氧化还原酶活性进行高灵敏度测定。生物生物科学，色谱分析技术1039: 51-58。(Crossref)
18. 克洛茨·IM(1953)《蛋白质B部分》，文献出版社，纽约。
19. Hosoya T, Ohno I(2011)日本肾功能受损患者口服非布司他(TMX-67)的重复研究，TMX-67是黄嘌呤氧化酶的非嘌呤选择性抑制剂。中国Rheumatol4: S27。
20. topiroxostat, URIADEC®药物批准声明报告(英文)，临床药理学综述，I期重复剂量研究。
21. Upton RN, mold DR(2014)群体建模、仿真和基于模型的药物开发的基本概念:第3部分:药效学建模方法介绍。CPT药物计量学系统药典3: e88。(Crossref)
22. Battelli MG, Bolognesi A, Polito L(2014)循环黄嘌呤氧化还原酶的病理生理学:一种多任务酶的新角色。Biochim Biophys学报1842: 1502 - 1517。
23. Furuhashi M, Matsumoto M, Tanaka M, Moniwa N, Murasse T，等，(2018)普通人群血浆黄嘌呤氧化还原酶活性作为代谢障碍的一种新型生物标志物。中国保监会J82: 1892 - 1899。
24. Washino K, Kusunoki Y, Murase T, Nakamura T, Osugi K, et al.，(2017)年轻人中黄嘌呤氧化还原酶活性与胰岛素抵抗和亚临床炎症相关。新陈代谢70: 51-56。
25. 藤村勇，山内勇，Murase T, Nakamura T, Fujita SI等。(2017)心脏病患者血浆黄嘌呤氧化还原酶活性与左室射血分数和肥厚的关系。《公共科学图书馆•综合》12: e0182699。(Crossref)
26. 单个核钼酶。化学牧师96: 2757 - 2816。(Crossref)
27. Massey V, Komai H, Palmer G, Elion GB(1970)别嘌呤醇和其他吡唑啉[3,4-d]嘧啶灭活黄嘌呤氧化酶的机理。J临床生物化学245: 2837 - 2844。(Crossref)
28. 松本K1，冈本K, Ashizawa N, Nishino T (2011) FYX-051:一种新型的强效杂合型黄嘌呤氧化还原酶抑制剂。美国药典公司336: 95 - 103。(Crossref)
29. Vuignier K1, Schappler J, Veuthey JL, corruption PA, Martel S(2010)药物-蛋白质结合:分析工具的评论。肛门Bioanal化学398: 53 - 66。(Crossref)
30. Okamoto K, Eger BT, Nishino T, Kondo S, Pai EF，等(2003)一种极有效的黄嘌呤氧化还原酶抑制剂:酶-抑制剂复合物的晶体结构和抑制机制。J临床生物化学278: 1848 - 1855。
31. Nishino T, Okamoto K, Ege BT, Pai EF, Nishino T(2008)哺乳动物黄嘌呤氧化还原酶-黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶转变的机制。2月J275: 3278 - 3289。
32. Okamoto K, Matsumoto K, Hille R, Eger BT, Pai EF等，(2004)催化过程中黄嘌呤氧化还原酶的晶体结构:对反应机制和酶抑制的启示。美国国家科学院101: 7931 - 7936。
33. Tam HK, Kelly AS, Metzig AM, Steinberger J, Johnson LA(2014)肥胖儿童黄嘌呤氧化酶与心血管风险。孩子ob10: 175 - 180。(Crossref)
34. Tam HK(2016)体重减轻介导的重度肥胖青少年黄嘌呤氧化酶活性和尿酸清除的降低。孩子ob12: 286 - 291。
35. Desco MC, Asensi M, Marquez R, Martinez JV, Vento M等(2002)黄嘌呤氧化酶参与1型糖尿病患者自由基生成:别嘌呤醇的保护作用。糖尿病51: 1118 - 1124。
36. Kuppusamy UR, Indran M, Rokiah P(2005)马来西亚2型糖尿病患者的血糖控制与黄嘌呤氧化酶和抗氧化指标的关系。Diabet地中海22日:1343 - 1346。(Crossref)
37. Miric DJ, Kisic BM, Danic SF, Grbic R, Dragojevic I，等(2016)2型糖尿病患者伴或不伴糖尿病周围神经病变的黄嘌呤氧化酶活性。J糖尿病Res(Crossref)
38. Spiekermann S, Landmesser U, Dikalvo S, Bredt M, Gamez G，等。(2003)冠状动脉疾病患者血管黄嘌呤和NAD(P)H氧化酶活性的电子自旋共振表征:与内皮依赖性血管舒张的关系。循环107: 1383 - 1389。
39. Landmesser U, Spiekermann S, Dikalov S, Tatge H, Wilke R，等(2002)慢性心力衰竭患者血管氧化应激与内皮功能障碍:黄嘌呤氧化酶和细胞外超氧化物歧化酶的作用。循环106: 3073 - 3078。(Crossref)
40. Majkic-Singh N, Bogavac L, Kalimanovska V, Jelic X, Spasic S等，(1987)以2,2 ' -azino-二(3-乙基苯噻唑-6-磺酸盐)(ABTS)为显色剂的黄嘌呤氧化酶分光光度法测定。中国詹学报162: 29-36。
41. Shamma'a MH, Nasrallah SM, al-Khalidi UA(1973)血清黄嘌呤氧化酶。2000个病人的经历。Am J Dig Dis18:第15 - 22。(Crossref)
42. McHale A, Grimes H, Coughlan MP，(1979)人血清黄嘌呤氧化酶:荧光测定法适用于肝脏疾病的调查。Int J物化学10: 317 - 319。
43. 山本T, Moriwaki Y, Takahashi S, Tsutsumi Z, Yamakita J，等。(1996)高效液相色谱法测定人血浆黄嘌呤氧化酶活性。J Chromatogr B681: 395 - 400。
44. Kanabrocki EL, Third JL, Ryan MD, Nemchausky BA, Shirazi P，等(2000)血清尿酸与一氧化氮的昼夜关系。《美国医学会杂志》283: 2240 - 2241。(Crossref)
45. Srinivasan B, Rebecca F, Bin W, Gou W, Xiaorui C，等。，(2016) A Randomized controlled trial of the effects of febuxostat therapy on adipokaines and ....., Canadian journal of kidney health and disease, 3:1-11.
46. Della CE, Stirpe F(1968)大鼠肝脏黄嘌呤氧化酶的调节:蛋白水解酶的激活。2月列托人2: 83 - 84。
47. Stirpe F, Della CE(1969)大鼠肝脏黄嘌呤氧化酶的调节。脱氢酶(D型)向氧化酶(O型)活性的体外转化。J临床生物化学244: 3855 - 3863。
48. 西野T(1994)黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶的转化及其在再灌注损伤中的作用。J物化学116: 1 - 6。(Crossref)
49. Barr JT, Choughle KV, Nepal S, Wong T, Chaudhry AS, et al.(2014)为什么大多数人肝脏细胞质制剂缺乏黄嘌呤氧化酶活性?药物金属底座Dispos42: 695 - 699。