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摘要

最近克隆和培养基态肠干细胞(ISC)的技术进步为我们提供了一个准确评估年龄对高增殖肠干细胞功能影响的机会。我们无限而有力地扩展单一干细胞衍生谱系的能力在体外使我们能够在克隆水平上研究肠干细胞。有趣的是，从所有捐赠者的1mm内窥镜活检中获得了相当数量的ISC克隆，尽管年龄不同。他们通过在体外随着系谱的发展，在大约60天内扩展到10亿个细胞，没有克隆性和多能性的干细胞变化。因此，我们的研究表明，来自不同年龄的ISCs可以被克隆并扩展到无限数量在体外具有相似的效率和稳定性。这些患者来源的ISCs具有内在的不朽性，是自体移植的理想选择，支持成人干细胞为基础的个性化医疗的前景。

简介

使用野生型或转基因表皮干细胞的自体移植已被证明在严重烧伤、慢性创伤和结节性大疱性表皮松解症患者中极为成功[1-3]。可以想象的是，在患有严重短肠综合征(SBS)[4]、先天性[5]障碍或炎症性肠病(IBD)患者的自体移植后，来自其他再生组织(如肠道)的成体干细胞可用于恢复肠上皮功能[6,7]。

然而，当这些患者来源的成体干细胞用于自体移植时，需要谨慎。尽管有大量有趣的证据表明驻留在老年人肠道组织中的干细胞仍然相当有能力，但尚不清楚他们的干细胞行为是否与取自年轻人的干细胞相似。因此，衰老的干细胞是否天生功能失调是一个与基于自体移植的干细胞治疗的实际发展有相当大相关性的问题，适用于所有年龄的人。

由于我们无法从柱状上皮组织中克隆干细胞并保持其不成熟状态，克隆、筛选和扩展ISCs一直是具有挑战性的在体外扩张。因此，ISCs必须作为再生的、分化的“类器官”进行，克隆细胞的百分比非常低，这限制了它们繁殖的动力学以及它们在探索单质干细胞方面的效用[8-10]。

最近，一项新的技术被开发来支持克隆处于高度不成熟的克隆状态的基态ISCs。这些培养的基态ISCs在基因组和表观遗传承诺程序中表现出显著的稳定性，保持克隆原性和无限复制扩展，表明它们在个性化再生医学方面具有巨大潜力[11,12]。

在本研究中，我们利用基态干细胞克隆技术对来自不同年龄供体的肠干细胞进行了研究。我们发现，从旧细胞环境中取出的ISCs与从年轻个体中取出的ISCs的行为完全相同。它们都可以稳健而稳定地传递在体外，表明ISCs的内在不朽与年龄无关。

结果

基态ISCs来自不同年龄的患者

为了了解基态肠干细胞(ISC^GS)能够成功克隆和培养于所有年龄的患者，我们选择了10 - 20岁的10名患者，30 - 50岁的10名患者和50 - 80岁的10名患者(补充表1)。这些患者的肠道上皮1mm活组织切片被酶解，并在包括3T3J2饲料和专门培养基[11]的系统中进行种子培养。我们检测到大约100个菌落可以从所有30名患者中提取。从一个ISC开始^GS殖民地，十亿ISC^GS在大约60到80天内，所有30名患者都可以独立于年龄产生细胞(图1A)。私立学校委员会^GS所有时代的衍生物都表现出难以区分的形态(图1B)。为了检验其多能分化能力，对ISC进行了谱系系分析^GS16岁、42岁和76岁的患者在气液界面(ALI)培养中分化10天。所有的ISC^GS形成高度均匀的三维蛇形图案(图1C)。这些分化的ISC的组织学切片^GS显示绒毛样结构的柱状上皮(图1D和1E)，由杯状细胞(粘蛋白2+)、内分泌细胞(嗜铬粒蛋白a +)和Paneth细胞(防御素α 6+)标记(图1，补充表2)，表明单个ISC的后代^GS从广泛的患者(10 -76岁)可以产生所有上皮系典型发现于肠。

图1所示。克隆ISC^GS来自不同年龄的患者
一个。离开了,直方图描述了本研究纳入患者的年龄。对的,描述单个ISC所需天数的直方图^GS从每个患者分裂到10亿个ISCGS。B.来自16岁、42岁和76岁患者活检的典型菌落的相位对比图像。酒吧,100µm。C. ALI培养物表面视图。d .组织学部分
通过苏木精-伊红染色进行ALI培养。E.分泌细胞标记物Mucin 2抗体的ALI培养切片的免疫荧光，
嗜铬粒素A和防御素A6。酒吧,100µm。

补充表1。本研究纳入的患者名单

病人没有。	年龄
PT1	10
PT2	11
PT3	12
PT4	12
PT5	15
PT6	16
PT7	16
PT8	18
PT9	19
PT10	20.
PT11	34
PT12	35
PT13	37
PT14	39
PT15	40
PT16	41
PT17	41
PT18	42
PT19	44
PT20	48
PT21	52
PT22	53
PT23	54
PT24	55
PT25	55
PT26	58
PT27	58
PT28	60
PT29	66
PT30	76

基态sic的长期培养

我们接下来想要研究这30名患者(10年-76年)的ISCs的自我更新能力。我们首先展示了ISC^GS本研究纳入的所有患者都是高度克隆的。在患者中观察到大约70%的克隆原性(图2A)。由于这种高克隆原性，单细胞衍生的菌落可以迅速扩展到单细胞衍生的谱系(图2B)。我们接下来检查了ISC的功能稳定性^GS在文化谱系。我们比较了ISC^GS在早代(P1)和晚代(P10)。每一段都包括培养在体外10天，大约有17个细胞分裂。尽管有传代数量，但在ALI培养体系中，干细胞仍能分化成肠样结构，并表达杯状细胞标记物(Muc2+)等分化标记物(图2C)。此外,这些ISC^GS尽管长期培养，仍保持较高的克隆能力(>60%)(图2D)。这一结果与我们在人类胎儿ISC中观察到的结果一致^GS在在体外扩张[13]。因此，稳定和稳健的ISC培养^GS这些细胞为个性化再生医学提供可靠的干细胞来源。

图2。ISC的长期稳定性^GS
一个。上,克隆性试验显示，在播种1000 ISC后20天，罗丹明红染色菌落生长^GS细胞。规模的酒吧,10毫米。较低的，在指定年龄范围内窥镜活检的基态干细胞克隆原性的量化。误差条，s.d.。单个菌落从池中取样，并在隔离中作为单独的线生长。C。上，野生型ISC传代早期和晚期典型无性系的相位对比图^GS．中间，通过苏木精-伊红染色ALI培养的组织学切片。较低的分泌细胞标记物Mucin 2抗体的ALI培养切片的免疫荧光。D. ISC早期和晚期传代克隆性测定^GS结果显示，在播种2000个传代ISC 10天后，罗丹明红染色的菌落数量几乎不变^GS．

讨论

基于干细胞的自体移植可以改善胃肠道疾病患者的预后，这些疾病的特征是黏膜屏障功能受损，包括IBD、坏死性小肠结肠炎、瘘管、非甾体抗炎药诱导的损伤或胃十二指肠出血[5,14]。与老年患者相关的关键和未回答的问题，如ISC是否^GS从这些老年个体中提取的细胞能够忠实而迅速地扩展到足够的数量，从而有功能地再生肠上皮细胞。

再生医学目前的发展方向是利用患者自身的干细胞进行自体移植。如果衰老的干细胞天生功能失调，那将极大地限制对老年人使用这类疗法的能力。然而，如果老的干细胞仍然保持完整的茎性，换句话说，如果ISC的内在不朽^GS如果与年龄无关，那么这种治疗与年龄相关疾病的再生医学方法将非常有前途。我们在这里展示了ISC^GS可从10岁至76岁的广泛患者身上克隆。我们没有发现任何与年龄相关的自我更新或分化能力的丧失。在大约60到80天，一个单一的ISC^GS在本研究纳入的30例患者中，可扩展到约10亿个细胞，提示它们可能是为肠道疾病患者量身定制的自体移植的理想干细胞来源。

在20世纪80年代，霍华德·格林和他的同事展示了第一个使用培养的成体干细胞进行细胞治疗的例子。他们发现，人体表皮可以在实验室中生长，并移植到烧伤患者身上，以重建具有功能的表皮[15,16]。从那时起，这种手术多次被证明挽救了严重烧伤患者的生命。此外，使用转基因表皮干细胞治疗严重皮肤起泡病大疱性表皮松解症的长期有效性和安全性已被临床证实。表皮干细胞的成功临床应用已经证明了与在手术中使用的能广泛自我更新的长寿干细胞的数量密切相关在体外而且在活的有机体内[1,3]。目前尚不清楚培养肠细胞的自体移植是否能在临床环境中取得同样的成功。虽然在实验性结肠炎的小鼠模型中，包括一小部分肠干细胞在内的类器官可以成功移植，这表明这些类器官附着并成为一类细胞，但极有可能类器官结构中数量极有限的干细胞无法支持人肠上皮的长期再生。

与类器官结构中不足1%的肠干细胞相比，基态ISC培养中包含超过60-70%的ISC^GS．根据我们之前通过临床使用培养的表皮干细胞所获得的经验教训，可以想象ISC的使用^GS将显著提高移植的疗效和成功率。当然，另一个具有挑战性的问题是，必须解决衰老或病变组织环境的影响，为患者建立有效的再生疗法。然而，随着我们了解到老年患者的干细胞与年轻患者的干细胞具有相似的生长和分化能力，以及我们培养它们的能力在体外我们坚定地预见到，成人干细胞为基础的再生方法对患有肠道疾病的患者具有广阔的前景。

方法

内窥镜活检细胞克隆

在与机构审查委员会协议一致的知情同意下招募患者参与本研究。所有活组织检查均来自患者的内窥镜检查。

将1mm内镜活检标本收集到含有2%胎牛血清的RPMI培养基(Gibco)中，随后用2mg/ml胶原酶A (Roche)在37°C下消化1.5小时。细胞在RPMI中离心洗涤，用0.5%胰蛋白酶(Gibco)消化10分钟，通过40um尼龙网(Falcon)，并在StemECHO膨胀培养基和StemECHO增强剂(MultiClonal Therapeutics, West Hartford, CT)中植入致命辐照的3T3-J2细胞喂养层。每两天更换一次培养基。细胞被0.25%胰蛋白酶消化，每7 ~ 10天传代一次。

干细胞分化

ISC的气液界面培养^GS按照描述[11,12]进行。简单地说，细胞培养在Transwell板(康宁)，StemECHO膨胀培养基培养基。在汇流处，插入物上的培养基通过仔细移液除去，并在收获前继续培养10-20天。StemECHO分化培养基(MCT)每2天更换一次。2周后收获分化组织。

组织学和免疫染色

采用标准技术进行组织学和免疫荧光检查。对于免疫荧光和免疫组化，将4%多聚甲醛固定，石蜡包埋的组织切片在95°C柠檬酸缓冲液(pH 6.0, Sigma-Aldrich, USA)中进行抗原提取20分钟，并用5%牛血清白蛋白(BSA, Sigma-Aldrich, USA)和0.01% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, USA)在磷酸盐缓冲盐水(PBS;Gibco, USA)室温1 h。本研究所用的主抗体及染色条件见补充表2。切片切片的所有图像均采用蔡司LSM 510共聚焦显微镜和LSM软件采集。明亮场细胞培养图像在Eclipse TS100显微镜(尼康)上获得，配有Digital Sight dsfi1相机(尼康)和NIS- Elements F3.0软件(尼康)。

补充表2。本研究中使用的抗体列表

抗原	公司	猫。不。	稀释
E-CAD	研发系统	AF648	1:400
MUC2	圣克鲁斯生物技术	sc - 515032	1:100
CHGA	Abcam	ab15160	1:100
DEFA6	Sigma-Aldrich	HPA019462	1:200

确认

这项研究得到了德克萨斯州癌症预防研究所(CPRIT;RR15014到WX和RR15088到FM)，国家卫生研究院(1R01DK115445-01A1到WX, U24CA228550到FM)，美国国防部(W81XWH-17-1-0123到WX)，德克萨斯大学总统奖(WX)，美国胃肠病学协会研究和发展技术试验奖(WX)和新加坡国家医学研究委员会(KYH和FM)。我们感谢贤麦基恩实验室所有成员的讨论和支持。

利益冲突陈述书

W.X, f.m.， M.D.和M.V.已经就本工作中使用的技术申请了一项专利。Xian和McKeon在MultiClonal Therapeutics Inc.有经济利益。

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