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摘要

表皮细胞与免疫系统的不同分子一起促进牛皮癣，但关于这种疾病早期阶段的一些数据仍然缺乏。本研究利用正常人体皮肤的有机培养评估了牛皮癣的早期形态特征。通过间接免疫荧光分析暴露于严格重现银屑病环境的细胞因子混合物的正常人类皮肤活检中的细胞增殖、toll样受体(TLR) 7和9以及角蛋白17的表达。混合培养后，检测到细胞增殖早期和渐进性下降。TLR9在混合样品的颗粒层中表达，而TLR7在整个表皮隔室中表达。混合暴露后K17表达明显。总之，我们的研究结果证明，银屑病微环境能够诱导我们皮肤模型中的关键形态变化，这有力地表明，早期表皮“银屑病开关”可以用于研究表皮稳态和先天免疫反应。

关键字

适应性免疫，toll样受体，角蛋白17，角化细胞增殖，间接免疫荧光

简介

牛皮癣是一种常见的慢性炎症性皮肤病，具有重大的社会经济影响，并对患者的生活质量产生负面影响。遗传因素和许多外部刺激的相互作用，如皮肤损伤、环境影响和微生物感染[1]可引发或恶化疾病。这种疾病的特点是涉及免疫系统和细胞类型[2]的复杂致病机制。角质形成细胞是先天免疫的关键细胞，因为它们具有向皮肤招募T细胞的特殊能力，并且它们在表皮皮肤屏障中的独特作用。角质形成细胞在触发信号后，能够产生许多抗菌肽，如cathelecidin LL-37、许多防御素和S100蛋白[3,4]。它们也表现为分泌细胞，因为它们可以产生高水平的趋化剂CCL20，能够进一步将t细胞招募到皮肤[5]。最后，但重要的是，角质形成细胞表达Toll样受体(TLRs)，允许特异性地应对环境微生物挑战[6]。有许多临床和实验证据表明tlr介导的炎症在银屑病中的重要性，并开发了负向调节TLRs信号通路的治疗方法;银屑病发病机制的相关作用是非常需要的[7]。

到目前为止，大多数资料都是在银屑病晚期获得的，此时皮损已经巩固，表皮银屑病斑块多为角化过度，真皮层有不同类型细胞浸润。因此，为了更好地了解这种疾病的发病机制的早期阶段，必须建立尽可能接近这种疾病并可用于开发新疗法的模型。为了帮助定义疾病的早期阶段，在过去十年中，我们使用了一种简单但标准化的三维有机培养模型，在不同的相关性中暴露于关键的促炎性银屑病细胞因子后，对正常人类皮肤活检进行了研究[8-11]。

由于这个坚实的背景，我们现在可以使用我们的3D模型来研究所有这些细胞因子如何共同影响银屑病表型，并确定它们对角质形成细胞的影响。特别地，我们将注意力集中在由含有TNF-alfa、IL-17、IL-22和IL-23的细胞因子混合所代表的银屑病微环境所引起的表皮腔室中TLR表达、K17诱导和角质形成细胞增殖的分析上。

方法

Organotypic文化

经书面知情同意后，从健康的年轻不吸烟女性美容手术后获得正常人体皮肤的活组织切片(n=7)。这些程序符合人体实验机构委员会的道德标准和《赫尔辛基宣言》。手术后，样本在Transwell系统(Costar, Corning, NY, USA)的气液界面表皮侧朝上进行过夜培养，以减少先前报道的急性机械应力[8-11]。样品在含有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle 's培养基(Euroclone, Milan, Italy)中培养;Invitrogen, Life Technologies Ltd, Paisley，英国)补充青霉素/链霉素、两性霉素B和谷氨酰胺(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)。没有添加氢化可的松以避免消炎活性。过夜孵育后，将片段暴露于TNF-alpha 100 ng/ml、IL-17 50 ng/ml、IL-22 100 ng/ml和IL-23 50 ng/ml的混合物中，分别孵育24 (T24)、48 (T48)或72 (T72)小时。所有细胞因子均来自PeproTech公司(London, UK)。平行样品在没有任何细胞因子的培养基中孵育，代表我们的内部控制。每个患者在所有实验点和所有组中都有代表。 In order to evaluate epidermal cell proliferation, all bioptic samples were incubated for 3 h with 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU), a non-radioactive thymidine analogue selectively incorporated in DNA of S-phase cells. Samples (5x5 mm) were then formalin-fixed, paraffin-embedded, and cut by a microtome obtaining serial section of 5 µm thickness.

免疫荧光分析

在所有实验中，石蜡切片都经过脱蜡，在乙醇浓度下降的条件下再水化，在用特异性一抗和二抗孵育前进行抗原去掩和非特异性结合位点饱和处理。兔抗人TLR7和小鼠抗人tlr9抗体购自Novus Bio公司，小鼠抗人K17抗体购自Cell Signaling Technology公司。TLR7和TLR9的抗原揭膜分别在高压釜中进行，Tris HCl缓冲液pH 0.05M 8.5，时间为20′，温度98℃，或柠檬酸缓冲液pH 0.01M 6，时间为9′，温度120℃。在非特异性位点用1:10的山羊血清在PBS 0.1M和2% BSA / 30 ' RT饱和后，TLR7抗体在PBS 0.1M和2% BSA中稀释为1:300,tlr9在PBS 0.1M中稀释为1:10。然后将载玻片在4°C下孵育过夜。作为二抗，TLR7为山羊抗兔(Alexa Fluor 488)，在0.1M PBS中稀释1:100,BSA 2%/1h RT, TLR9为山羊抗小鼠fitc偶联(Jackson免疫研究)，在PBS 0,1 m /1h RT中稀释1:200。K17免疫荧光分析与TLR9方案相似，在PBS/BSA 1%中稀释1:500。每张玻片上的一个切片作为技术阴性对照，因此省略一抗，用0.1 M的磷酸盐缓冲盐水(PBS)代替，pH为7.4。核用4 '，6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐反染色(DAPI 1:5万稀释双蒸馏水;所有组织学和免疫荧光分析均使用Nikon Eclipse E600和Nikon数码相机DXM1200 (Nikon, Tokyo, Japan)进行。

表皮增殖的定量分析

BrdU掺入使用单克隆抗体抗BrdU (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX;1:200, 60分钟)，用2N HCl变性DNA(30分钟)，用Na缓冲₂B₄O₇(10分钟)，3%牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)在PBS中饱和非特异性结合位点(20分钟)，0.05%胃蛋白酶在20 mmol L中消化^－1盐酸(25分钟)。fitc标记马抗小鼠IgG (Vector Laboratories, Burlingame;1:200, 60 min)作为二抗。除胃蛋白酶孵育在37℃外，所有步骤均在室温(RT)下进行。对于细胞增殖的分析，每个样品至少进行三次实验，每个样品两张载玻片，每张载玻片上有两个切片。每一节都作为一个样本单元进行统计分析。两名独立的双盲研究人员计数了brdu阳性细胞。结果以每mm中brdu阳性细胞的平均值+标准差(SD)表示²含有有核细胞的表皮。计算相邻苏木精和伊红染色切片上的表皮面积，不包括角质层。软件Image Pro-Plus(版本4.5.019;Media Cybernetics, Silver Spring, MD)用于测量[13]。

结果

TLR7表达式

在暴露于细胞因子混合物的样品中，从T24开始，TLR7在所有时间点在整个表皮隔室均匀表达，在基底层也存在TLR7阳性细胞(图1A和1B)。T72的免疫阳性表现弱于早期时间点(图1C)，尤其局限于低分化层。在健康皮肤(对照组)中，如前所述[11]，TLR7在基础单分子层中从未表达，在分化程度较高的表皮层中，TLR7向表皮表面的分布略有增加。

图1所示。(A-C) TLR7和(D-F) tlr9对含有TNF-alpha, IL-17, IL-22和IL-23的培养基培养的样品的石蜡皮肤切片进行免疫染色。(a, d): t24;(b, e): t48;(c, f): t72。TLR7: toll样受体7;TLR9: toll样受体9。T24:过夜孵育24小时后采集的样品;T48:过夜孵育48小时后采集的样品;T72:过夜孵育72小时后采集的样品。白点线为基底膜; white arrows indicate TLR9 localization in the uppermost granular layer. Bars: 50 µm

TLR9识别表达式

TLR9免疫阳性仅在混合样品的颗粒层T24开始出现(图1D中白色箭头)。混合样品在T48和T72的颗粒层免疫染色越来越明显(白色箭头图1E和1F)。正如预期的那样，TLR9从未在对照样本中表达(数据未显示)。

K17表达式

对照样品中K17免疫染色始终为阴性(图2A)，这与我们和其他实验室先前的数据[10]一致。T24时，与细胞因子混合物孵育后，表皮隔室下层角质形成细胞的细胞质中K17的表达明显渐进式增加(图2B)。在T48时，K17的免疫反应主要出现在棘上层(图2C)。T72时，除基底层外，整个表皮隔室均为k17阳性(图2D)。

图2。皮肤石蜡切片K17免疫染色。A:正常皮肤;B-D:样品在T24、T48和T72时用含有TNF-alpha、IL-17、IL-22和IL-23的培养基培养。K17:角蛋白17。T24:过夜孵育24小时后采集的样品;T48:过夜孵育48小时后采集的样品;T72:过夜孵育72小时后采集的样品。白点线表示基底膜。棒:50µm

表皮增殖的定量分析

根据我们之前的数据[8]，我们观察到对照样本中角质形成细胞增殖的渐进式下降(图3，白色条)。与细胞因子混合孵育24小时后，细胞增殖受到强烈抑制(图3，黑条)。对照和混合样品在T48和T72处差异有统计学意义(p<0.05)。

图3。角质细胞表皮增生。皮肤角质形成细胞表皮增生与含有tnf - α， IL-17, IL-22和IL-23的培养基孵育(混合)。T24:过夜孵育24小时后采集的样品;T48:过夜孵育48小时后采集的样品;T72:过夜孵育72小时后采集的样品

讨论

银屑病发病机制的分子机制已经明确，但更具体的是在疾病的晚期。关于该病的极早期致病阶段仍然缺乏许多信息。为了研究银屑病的发病，3D模型代表了一种有用的方法，它占据了细胞培养和动物模型之间的中间位置，从而克服了每个提出的体内模型[12]存在的多重限制。我们实验室标准化的3D模型的主要优势是重现皮肤的生理状态，因为皮肤是在空气-液体界面的Transwell系统中培养的，表皮暴露在空气中，真皮浸泡在培养基中。由于通常不向培养基中添加生长因子，因此可以研究表皮对银屑病微环境的直接和迅速反应[8-11]。

在本研究中，我们证明了暴露于细胞因子混合物的样品具有银屑病皮肤的一些关键形态特征，主要是关于K17和TLR的表达。这种相似性严格依赖于暴露于银屑病微环境的时间，强烈表明不同的银屑病事件与表皮细胞与外源性促炎银屑病细胞因子之间特异性相互作用的持续时间相关。有两个主要的观察结果值得注意。

首先，细胞因子混合物能够诱导TLR7在所有表皮层内的表达，再次强调，如果与健康皮肤相比，在表皮层诱导的快速银屑病变化，在健康皮肤中，TLR7的免疫反应性在基底层不明显，仅存在于基底上层。我们实验室在相同的实验环境下进行的未发表的实验表明，单个细胞因子在任何时间点都不能成功诱导TLR7的表达。因此，在模拟银屑病环境的促炎条件下，皮肤角质形成细胞可能对免疫病原体产生强烈反应，主要是为了避免表皮炎症。文献中也报道了类似的观察结果;self-RNA-LL-37能够通过TLR7激活浆细胞样树突状细胞，产生大量增强mDC活性的ifn - α[14,15]。TLR-7/核因子κB (NF-κB)通路的激活已被证明可以增加几种促炎介质的产生，从而放大炎症[16]。一种合成TLR-7激动剂Imiquimod (IMQ)最近被用于临床，据报道，I)诱发银屑病，II)在控制良好的银屑病患者中加重病情。在实验研究中，IMQ外用已被证明可以通过TLR-7激活，在皮肤中引起红斑和炎症细胞浸润，从而诱导银屑病样皮肤炎症[17,18]。

根据文献[19]，TLR9在对照样品中从未表达，这支持了在没有促炎刺激的情况下，表皮实际上是静止的假设。从T24开始，分散的颗粒状角质形成细胞中，混合样品的颗粒层中TLR9表达明显。文献报道了TLR9在银屑病病变皮肤中的过表达，但作者没有具体描述表皮层，因为他们更感兴趣的是显示TLR9的存在，而不是受体表达与角质形成细胞分层[19]之间的相关性。

第二个相关发现与K17的早期诱导表达有关，K17是一种重要而特异的银屑病标记物。有趣的是，在最长的实验时间点，即T72, K17在细胞因子混合样品表皮隔室中的分布模式与文献[20,21]中描述的银屑病皮肤的特征非常相似。这一观察表明，正常的表皮已经准备好对银屑病微环境做出早期反应，从而导致银屑病的快速转移，但刺激必须持续一段时间，因此尽可能严格地再现促炎银屑病细胞因子参与的病理状态。

定量分析细胞增殖后得到的结果需要更复杂的解释，因为我们都知道，牛皮癣的典型特征是过度增殖，而我们在本研究中报告了暴露于细胞因子混合物后角质形成细胞增殖的抑制。如前所述，在我们的实验条件下，细胞增殖的减少可以解释为在银屑病斑块[8]中发现的快速表皮反应导致随后的修复性增殖反应。在我们的研究中，构成这种混合物的每一个细胞因子，即白介素(IL-) 17,22,23和肿瘤坏死(TNF-) α，都能迅速诱导具有高特异性的“银屑病开关”[8-11]。特别是，每一种都对众所周知的牛皮癣标记物角蛋白17[20]的表达产生内在和特定的影响。

结论

总之，我们的研究结果证明，银屑病微环境能够诱导表皮腔室的关键形态变化，特别是在我们的3D模型中改变TLR7、TLR9和K17的表达。它还提供了更多关于这两种受体的特定定位的细节，这可能是许多针对TLRs治疗慢性炎症性皮肤病(尤其是牛皮癣)的新小分子的重要细节。

利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突。

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