瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡医学院临床免疫和过敏科
瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡医学院临床免疫和过敏科
电子邮件:冈纳。nilsson@ki.se
瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡医学院临床免疫和过敏科
DOI: 10.15761 / ICST.1000153
摘要罕见的骨髓增生性疾病，全身性肥大细胞增多症，其特征是无性肥大细胞在一个或多个器官中异常生长、存活并随之累积。在大多数这些患者中，肿瘤肥大细胞携带D816V Kit突变，使其对大多数药物产生耐药性，而且它们还过度表达促生存Bcl-2家族成员，延长细胞生存。在这里，我们研究了ABT-737和Roscovitine对HMC-1.2细胞(一种具有D816V KIT突变的人肥大细胞系)存活的联合效应。ABT-737是一种bh3模拟物，抑制Bcl-2, Bcl-Xl和Bcl-w，而Roscovitine是cdk抑制剂，也下调Mcl-1的表达。1mm ABT-737单独诱导80%的细胞死亡，而30mm Roscovitine单独诱导70%的细胞死亡。0.05µM ABT-737联合10µM Roscovitine可导致细胞明显死亡，并使促生存Mcl-1蛋白水平大幅降低，促凋亡Bim水平上调埃尔．使用siRNA抑制HMC-1.2细胞中Mcl-1的表达，使这些细胞对ABT-737敏感。如此低剂量的ABT-737与Roscovitine联合诱导凋亡的能力可能会增加疗效，同时降低副作用，甚至可能在治疗携带D816V KIT突变的肥大细胞时克服耐药性。
ABT-737, Roscovitine, Mcl-1，肥大细胞，凋亡
骨髓增生性疾病全身性肥大细胞增多症的特征是异常肥大细胞过度积聚，特别是在皮肤和骨髓，但有时也在其他组织中[1，2］.这些症状是由肥大细胞释放介质和/或由这些细胞聚集导致器官衰竭引起的。肥大细胞的发育、扩张和存活依赖于干细胞因子(SCF)，它与其表面的KIT酪氨酸受体结合，激活细胞内信号级联。超过80%的全身性肥大细胞增多症患者携带KIT中D816Vpoint突变[1，3.]，以及KIT的其他突变[4，以及其他基因[5]在这些病人身上发现了这种病毒。D816V突变即使在没有SCF的情况下也会导致KIT的自动激活，从而促进受影响肥大细胞的生长和存活[6］.目前，对可能导致全身性肥大细胞增多症发展的其他机制知之甚少。
支持肥大细胞存活的主要因素是SCF，它通过调节Bcl-2家族成员的表达，特别是下调促凋亡蛋白Bim的表达[7，它在肿瘤肥大细胞中也起肿瘤抑制因子的作用[8］.具有D816V KIT突变的肥大细胞表现出几种促进生存的蛋白水平升高，如Bcl-2、Bcl-XL和mcll -1 [9 - 11］.由于这些Bcl-2家族成员的解除管制可能在全身性肥大细胞增多症的发病机制中发挥重要作用，一些尝试通过D816V KIT突变来改变肥大细胞中这些蛋白的表达和功能[11 - 13］.
小分子抑制剂ABT-737是一种仅bh3的拟合物，拟合促凋亡Bad，选择性地、高亲和力地抑制Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-w，从而诱导细胞凋亡[14];而生存依赖于Mcl-1和Bfl-1的细胞受到的影响较小。然而，我们之前已经证明ABT-737可以促进肥大细胞凋亡[15］.在这里，我们表明，当它与Roscovitine(一种周期蛋白依赖激酶(CDK)的抑制剂)联合使用时，这些带有突变KIT的细胞可以进一步对该抑制剂敏感。Roscovitine是一种周期蛋白依赖激酶(CDK)的抑制剂，在其他影响中，Roscovitine抑制编码促生存的Mcl-1基因的转录[16］.特别值得注意的是，低剂量的ABT-737与Roscovitine联合，可诱导携带D816V KIT突变的肥大细胞凋亡。
从捐赠者获得知情同意后,人类脐带血用于开发肥大细胞通过培养8 - 10周的单核细胞群RPMI 1640介质(西格玛化工有限公司、圣路易斯、钼)补充10% FCS (Gibco、佩斯利、苏格兰),50 ng / ml自洽场(Biosource国际公司。Camarillo, CA)和10 ng/ml IL-6 (PeproTech，伦敦，英格兰);或将cd34选择的细胞培养在含有30 ng/ml IL-3(仅第一周)、50 ng/ml SCF和10 ng/ml IL-6的无血清StemPro培养基(Gibco)中。通过对胰蛋白酶(一种只由肥大细胞表达的丝氨酸蛋白酶)的染色来评价发育[17］.实验所用的肥大细胞培养物纯度超过95%。卡罗林斯卡学院伦理委员会批准了cbmc的使用(Dnr 01-374)。所有参与者都被告知并提供了他们参与的书面知情同意。
在IMDM (Sigma)中添加10% FCS、2 mM l -谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素/链霉素和1.2 mM单硫甘油酸(Sigma)，维持人柱状细胞系HMC-1.1和HMC-1.2 [18，每周通过两次。人类肥大细胞系lad2 [19)(由博士提供。A. Kirshenbaum和D. Metcalfe, NIH, Bethesda, MD, USA)维持在含有100 ng/ml hSCF的StemPro-34 SFM培养基中。
治疗后0.05µM abt - 737(雅培,方丈公园,IL)和/或10µM Roscovitine(σ)的时间表明,细胞细胞溶解在SDS裂解缓冲(62.5毫米Tris-HCl, pH值6.8,2% w / v SDS、10%甘油,50 mM德勤,0.01% w / v溴酚蓝),然后用冰。使用NuPAGE bistris western凝胶(NOVEX, Life Technologies, CA, USA)进行western免疫印迹法测定各种感兴趣蛋白的磷酸化程度和/或总量。电泳后，这些蛋白被电印迹到硝化纤维素膜上(Hybond ECL, GE Healthcare, Uppsala, Sweden)，然后这些膜在含有5% w/v脱脂奶粉和0.1% Tween 20的tris缓冲盐水中阻塞;与合适的一抗在4°C孵育过夜;然后在室温下与酶标二抗接触一小时。最后，使用增强化学发光(ECL)系统(LumiGLO, New England Biolabs)对蛋白质进行可视化，并通过暴露于Hybond ECL薄膜(GE Healthcare)记录条带。使用了以下抗体:anti-Bim (Cell Signaling, Technology, Beverly, MA)， anti-actin (Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA)， anti-Mcl-1 (Stressgene)， anti-caspase-3, anti-Bcl-2和anti-Bcl-XL (Cell Signaling)。
为了监测细胞凋亡，首先用碘化丙啶(PI, 2µg/ml)和fitc标记的Annexin V(0.3µg/ml)对HMC-1.2细胞进行染色，然后用FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA)进行分析。治疗24 ~ 48小时后，采用FACScan方法统计存活的细胞数量。
抑制…的表达mcl1基因，HMC-1细胞转染100nm的mcl-1或对照siRNA(人mcl-1 siGENOME SMART库siRNA和非靶向库siRNA (Dharmacon inc.， Lafayette, CO, USA))，使用Nucleoporator和原代哺乳动物成纤维细胞基本核因子试剂盒(VPI-1002);程序X-001 (Amaxa AG，科隆，德国)，按照制造商的说明。转染24小时后，使用MACS死细胞去除试剂盒富集活细胞(德国的Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach，同样根据制造商的协议);0.05µM ABT-737处理24小时;计算;然后裂解制备蛋白质印迹。
使用Student进行统计分析t-检验，其中P值* P<0.05、** P<0.01、*** P< 0.001为差异有统计学意义。
Bcl-2家族促生存成员的稳态表达
在肥大细胞株HMC-1.1、HMC-1.2和lad2中检测Bcl-2家族前生存蛋白Bcl-2、Mcl-1和Bcl-XL的稳态表达;在脐带血来源的原代肥大细胞(CBMCs)中，显示出不同的表达模式。这些细胞系表达所有检测到的蛋白，而CBMCs表达Mcl-1和Bcl-Xl，而不是Bcl-2(图1)。
图1．静止肥大细胞表达Bcl-2家族成员．以肌动蛋白作为负载对照，采用western blotting检测CBMC和lad2、HMC-1.1和HMC-1.2细胞中Mcl-1、Bcl-2和Bcl-XL的稳态水平。图中是3人的一个代表性实验。
ABT-737(0.02 ~ 1µM)处理HMC-1.2细胞24、48小时;图2A)和Roscovitine(1 ~ 30µM;图2B)，然后用流式细胞术测定其活力。最高剂量的药物治疗48小时后可诱导70-80%的细胞死亡。30µM Roscovistine对Mcl-1的表达有一定的抑制作用，0.5µM ABT-737在消除Mcl-1蛋白表达时增强了这种抑制作用(图2 C)。也就是说,在暴露24或48小时后，选择对HMC-1.2细胞存活影响很小或很低的最高剂量(图2A和B)进行进一步研究。
图2。ABT-737和Roscovitine降低肥大细胞存活和Mcl-1表达的剂量反应效应用不同剂量的(A) ABT-737或(B) Roscovitine处理HMC-1.2细胞24和48小时，然后用流式细胞术检测细胞活力。(C)高剂量ABT-737 (0.5 mM)和/或Roscovitine (30 mM)可降低HMC-1.2细胞表达的Mcl-1蛋白水平。所示值为平均值±标准差;n = 3。* * * p < 0.001。
当hmc - 1.2细胞被对待Roscovitine和/或abt - 737和可行性然后由流式细胞术24和48小时后(图3),0.05µM abt - 737和10µM Roscovitine单独影响很小,但是这两个的组合显著降低细胞生存能力在两个时间点(图3)。
图3。低剂量ABT-737与罗斯科维汀在诱导肥大细胞死亡方面表现出协同效应。用0.05µMABT-737和/或10µM Roscovitine处理24和48小时后测定HMC-1.2细胞的存活率。所示值为平均值±标准差;n = 3。
由于我们看到了russcovitine与ABT-737联合使用时的协同效应，我们接下来研究了这种效应是由于特定的Mcl-1抑制，还是russcovitine的其他效应。孵育24和48小时后，0.05µM ABT-737对转染对照siRNA的HMC-1.2细胞的存活无影响，而显著降低了转染Mcl-1 siRNA的细胞的存活(图4A)。此外，在转染了Mcl-1 siRNA的细胞中，ABT-737降低了Mcl-1的表达，添加Roscovitine增强了这种降低(图4B)。
图4。用siRNA抑制Mcl-1表达可使细胞对ABT-737诱导的凋亡敏感．转染Mcl-1或对照siRNA后，检测0.05µM ABT-737和/或10µM Roscovitine孵育后(A) Mcl-1细胞的存活率和(B) HMC-1.2细胞的Mcl-1蛋白表达。所示值为平均值±标准差;n = 3。* p < 0.05。
我们之前已经证实，SCF通过调节BH3-only蛋白Bim的表达来促进肥大细胞的存活埃尔在经蛋白酶体抑制剂MG132处理的HMC-1.2细胞中上调并诱导凋亡[12，20.］.在这里，我们检测到Bim的显著上调埃尔在HMC-1.2细胞中，0.05µM ABT-737和10µM Roscovitine共同处理，但没有单独使用任何一种药物(图5)。
图5。abt -737与Roscovitine联合处理可上调pro -凋亡Bim。将0.05µM ABT-737和/或10µM Roscovitine暴露于HMC-1.2细胞24和48小时，并与Bim水平进行比较埃尔蛋白质，然后用蛋白质印迹法测定。图中是3人的一个代表性实验。* p < 0.05;* * p < 0.01。
Bcl-2家族成员诱导的细胞凋亡最终导致效应物半胱天冬酶（包括半胱天冬酶-3）的激活，从而执行对细胞的实际杀伤。尽管ABT-737或Roscovitine单独诱导HMC-1中一定量的前半胱天冬酶-3裂解为活性半胱天冬酶-3，但这些药物的组合更有效在这方面（图6A）。向细胞培养基中添加半胱天冬酶抑制剂z-VAD-fmk可阻断半胱天冬酶-3的激活（图6A）。
图6。ABT-737和Roscovitine联合治疗激活caspase-3和细胞死亡。将HMC-1.2细胞暴露于ABT-737和/或Roscovitine 24小时后，用western blotting检测前caspase-3裂解为激活的caspase-3。通过Annexin V/ pi染色和流式细胞术检测，100µM z-VAD-fmk(一种caspase抑制剂)预处理可减弱caspase-3的激活(a)和细胞活力的降低(B)。结果具有三个独立实验的代表性。所示值为平均值±标准差;n = 3。
为了研究ABT-737和Roscovitine处理后的细胞死亡是否由caspase-3的激活引起，我们还将z-VAD-fmk纳入培养物中并测量细胞活力。暴露24和48小时后，单独使用Roscovitine和ABT-737都在一定程度上降低了HMC-1.2细胞的活力(图3)，但联合使用这种效果更加明显(图6B)。添加caspase抑制剂z- vad -fmk可消除0.05µM ABT-737和10µM Roscovitine诱导的细胞死亡(图6B)，表明对这些药物的凋亡至少部分依赖于caspase-3。
本研究表明，通过共同靶向ABT-737和Roscovitine亚浓度的促生存Bcl-2蛋白，可以在含有D816V KIT突变的HMC-1.2细胞中实现协同促进凋亡。这种细胞的死亡是由Mcl-1表达减少，抑制Bcl-2, Bcl-X介导的lBcl-w, Bim的高等级埃尔蛋白质;以及caspase-3的激活。
目前缺乏有效治疗系统性肥大细胞增多症的方法，因此迫切需要开发新的治疗策略，而不仅仅是缓解症状。由于治疗剂量相关的副作用，许多候选药物无法使用。以较低剂量联合两种药物可能会减少副作用，同时提高疗效，小分子抑制剂ABT-737被开发为促凋亡的BH3-only蛋白Bad的模拟物，已知可诱导凋亡并具有抗肿瘤特性[14，21，作为单一药物对多种人类癌症细胞系几乎没有作用，但与低剂量的其他化疗药物或辐射具有协同作用[22 - 24］.
我们之前报道过肥大细胞对ABT-737敏感[15］.然而，那些生存依赖于Mcl-1和/或Bfl-1的细胞对这种化合物不太敏感，这种化合物选择性地结合并与Bcl-2、Bcl-X具有高亲和力l和Bcl-w14］.系统性肥大细胞增多症中肥大细胞表达Mcl-1水平升高[11]，因此，为了增加它们对ABT-737的敏感性，我们将该药物与Mcl-1转录抑制剂Roscovitine联合应用[16]首先，用ABT-737或Roscovitine单独处理HMC-1.2细胞，以确定对肥大细胞存活几乎没有影响或没有影响的最高剂量。令人惊讶的是，这些剂量的0.05µM ABT-737和10µM Roscovitine协同降低了肥大细胞活力，其程度与单次高剂量的每种药物所获得的程度相当。与我们在HMC-1.2细胞中发现的类似，用30µM Roscovitine处理的多发性骨髓瘤细胞表现出对Mcl-1的强烈抑制[25］.0.05µM ABT-737与10µM Roscovitine结合，也有效降低了该蛋白在HMC-1.2细胞中的表达，同时诱导了促凋亡蛋白Bim的表达埃尔．
Bcl-2亲生存家族成员的缺失和Bcl-2亲凋亡家族成员的上调是降低肥大细胞存活的关键。我们之前观察到正常肥大细胞的培养在体外上调Bfl-1和Mcl-1以存活ige受体介导的激活[26］.促凋亡和抗凋亡Bcl-2蛋白之间的平衡决定了细胞是被从凋亡中拯救出来还是被判细胞死亡。然而，如果一个存活基因下调，其他基因可能会上调，以弥补这一损失并恢复平衡。
在本研究中，我们使用了拟bh3的ABT-737。Obatoclax是另一种bh3模拟物，已被证明与多激酶抑制剂Sorafenib协同，以减少人急性髓系白血病细胞中Mcl-1的表达并促进细胞凋亡[27］.在HMC-1.2与ABT-737和Roscovitine共同处理后，我们还观察到Mcl-1的表达降低，同时促凋亡的Bim水平升高埃尔蛋白和caspase-3的激活，caspase-3是细胞死亡的执行者。用泛caspase启动因子z-VAD-fmk预处理细胞，既阻止了caspase-3的激活，也阻止了细胞的死亡，提示凋亡至少部分是由这种蛋白酶介导的。
为了进一步证实在D816V KIT突变的细胞中Mcl-1对肥大细胞的存活很重要，siRNA降低了该蛋白的水平，并与ABT-737结合，增强了细胞死亡。然而，这种细胞存活率的降低并不像ABT-737与Roscovitine联合应用时那么明显。这可能是由于Roscovitine比siRNA更有效地抑制了Mcl-1的表达，以及/或因为Roscovistine发挥了影响HMC-1.2细胞存活的其他作用。然而，我们目前的研究结果表明，亚最佳浓度的药物一起使用可导致携带D816V KIT突变的肥大细胞死亡。
我们要感谢Agnetha Beinhoff女士和Ulrika女士Edbäck在培养肥大细胞方面的出色技能。这项工作得到了瑞典癌症协会、瑞典医学和健康研究委员会、癌症和过敏基金会、Hanz von Kantzows基金会、Lars Hiertas纪念基金会、Magnus Bergvalls基金会和Karolinska研究所的支持。
音)山口
埃默里大学医学院
研究文章
收稿日期:2015年9月22日
录用日期:2015年10月13日
发布日期:2015年10月16日
©2015 Lyberg K.这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是原始作者和来源被注明。
Lyberg K，Nilsson G，Westerberg CM（2015）ABT-737和Roscovitine以协同方式诱导携带D816V KIT突变的肥大细胞凋亡。整合式癌症Sci治疗。2:DOI:10.15761/ICST.1000153
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电子邮件:冈纳。nilsson@ki.se
图1．静止肥大细胞表达Bcl-2家族成员．以肌动蛋白作为负载对照，采用western blotting检测CBMC和lad2、HMC-1.1和HMC-1.2细胞中Mcl-1、Bcl-2和Bcl-XL的稳态水平。图中是3人的一个代表性实验。
图2。ABT-737和Roscovitine降低肥大细胞存活和Mcl-1表达的剂量反应效应用不同剂量的(A) ABT-737或(B) Roscovitine处理HMC-1.2细胞24和48小时，然后用流式细胞术检测细胞活力。(C)高剂量ABT-737 (0.5 mM)和/或Roscovitine (30 mM)可降低HMC-1.2细胞表达的Mcl-1蛋白水平。所示值为平均值±标准差;n = 3。* * * p < 0.001。
图3。低剂量ABT-737与罗斯科维汀在诱导肥大细胞死亡方面表现出协同效应。用0.05µMABT-737和/或10µM Roscovitine处理24和48小时后测定HMC-1.2细胞的存活率。所示值为平均值±标准差;n = 3。
图4。用siRNA抑制Mcl-1表达可使细胞对ABT-737诱导的凋亡敏感．转染Mcl-1或对照siRNA后，检测0.05µM ABT-737和/或10µM Roscovitine孵育后(A) Mcl-1细胞的存活率和(B) HMC-1.2细胞的Mcl-1蛋白表达。所示值为平均值±标准差;n = 3。* p < 0.05。
图5。abt -737与Roscovitine联合处理可上调pro -凋亡Bim。将0.05µM ABT-737和/或10µM Roscovitine暴露于HMC-1.2细胞24和48小时，并与Bim水平进行比较埃尔蛋白质，然后用蛋白质印迹法测定。图中是3人的一个代表性实验。* p < 0.05;* * p < 0.01。
图6。ABT-737和Roscovitine联合治疗激活caspase-3和细胞死亡。将HMC-1.2细胞暴露于ABT-737和/或Roscovitine 24小时后，用western blotting检测前caspase-3裂解为激活的caspase-3。通过Annexin V/ pi染色和流式细胞术检测，100µM z-VAD-fmk(一种caspase抑制剂)预处理可减弱caspase-3的激活(a)和细胞活力的降低(B)。结果具有三个独立实验的代表性。所示值为平均值±标准差;n = 3。
