日本生物医学与健康科学研究生院肌肉骨骼功能研究与再生系
日本广岛大学医学院健康科学研究所理疗科
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日本生物医学与健康科学研究生院肌肉骨骼功能研究与再生系
日本广岛大学医学院健康科学研究所理疗科
DOI: 10.15761 / BRCP.1000109
最近有关高压氧治疗的研究结果表明，高压氧治疗在提高患有体重性骨关节炎和下腰痛的肥胖个体的线粒体功能和数量方面具有潜在的作用。因此，如果高压氧能够增强骨骼肌线粒体的代谢功能，那么它可能是一种替代运动来减少肥胖的方法。本研究旨在探讨轻度高压氧对骨骼肌线粒体含量和生物发生的影响。将8周龄雄性Wistar大鼠随机分为高压氧组和非高压氧组(对照组)。高压氧组和对照组大鼠分别暴露于1.25个大气压的绝对大气压和正常大气压下，均为正常空气。暴露于轻度高压氧1小时后，移除指长伸肌和比目鱼肌并进行分析。在两组肌肉中，无论肌肉细胞类型，柠檬酸合酶和琥珀酸脱氢酶的活性均未因暴露于轻度高压氧而改变。此外，过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α (PGC-1α)蛋白表达水平保持不变;而PGC-1α的mRNA水平在高压氧组明显高于对照组。这些结果表明，尽管温和的高压氧不会显著提高线粒体含量，但定期治疗可能会随着时间的推移导致线粒体生物生成。
代谢功能，轻度高压氧，线粒体，骨骼肌
体重指数≥30 kg/m者2被归为肥胖。肥胖被认为是糖尿病、心力衰竭和中风等慢性疾病的主要危险因素[1-3]。肥胖个体以皮下和腹部脂肪的形式过多地储存脂肪组织，要减少肥胖需要加强脂质代谢。在脂质代谢过程中，脂肪细胞中的三酰甘油被脂肪酶水解为甘油和脂肪酸，并释放到血液中[4]。脂肪酸部分被运输到线粒体，并经历β-氧化，并被用于线粒体呼吸。由于脂质的利用主要发生在线粒体中，增强线粒体呼吸可以有效地减少多余的脂肪。为了减少肥胖，建议进行跑步和骑自行车等有氧运动，因为这些运动可以促进脂肪细胞释放脂肪酸，提高骨骼肌细胞[5]线粒体中的脂肪酸利用率。除了促进葡萄糖和脂肪酸的吸收，运动还能诱导肌细胞[6]的线粒体生物生成。里拉et al。[7]讨论了有规律的运动增加线粒体体积和肌细胞的活性，并导致脂质代谢增加。有规律的运动通过在运动中诱导急性脂质氧化和增强心肌细胞中线粒体的生物生成来有效地减少肥胖。线粒体生物生成受过氧化物酶体增殖体激活受体γ共激活因子1α (PGC-1α)的调控，该信号可通过定期运动激活，在肌肉功能和胰岛素敏感性方面已在[7]中进行了综述。PGC-1α在饮食诱导肥胖的肌肉中可由不完全β氧化转变为完全β氧化。虽然PGC-1α可以调节肌细胞的脂质代谢，有利于减少肥胖，但由于体重诱导的骨关节炎和腰背痛，肥胖个体很难保持有规律的运动计划。
高压氧会引起多个组织的高氧，最近已被公认为一种促进骨折[9]、关节软骨损伤[10]和骨骼肌损伤[11]愈合的补充治疗。高压氧治疗可以很容易地应用于肥胖者治疗肥胖。此前，我们曾报道过在正常空气中使用1.25个大气压(ATA)的轻度高压氧可以防止肥胖大鼠[12]的脂肪细胞肥大。坤脱罗等．据报道，含95%氧气的高压氧治疗可增加脂肪细胞甘油的释放在体外[13]。除了增加甘油的释放，他们还证明高氧会增加活性氧(ROS)的产生。高压氧处理引起的氧分压升高增加了各种组织中ROS的产生[14]。ROS是线粒体生物发生的重要信号分子，ROS产量的增加激活了一些导致线粒体生物发生的通路[7,15,16]。然而，高压氧处理产生ROS对骨骼肌线粒体生物发生的影响尚不清楚。如果高压氧通过肌肉-线粒体生物生成促进脂质代谢，它可能是肥胖个体锻炼的一个有用的替代方案。本研究的目的是探讨轻度高压氧对骨骼肌线粒体生物发生的早期影响。
本研究由广岛大学动物护理和使用机构委员会(A13-132)批准，并根据广岛大学动物实验条例进行。所有实验均按照国家卫生研究所(NIH)《实验动物护理和使用指南》进行(国家研究委员会，1996年)。
本研究使用8周龄雄性Wistar大鼠(n = 12)。所有大鼠随机分为高压氧(HB, n = 6)组和非高压氧对照组(Cont, n = 6)组。HB组大鼠暴露于1.25 ATA (1266.59 hPa)和正常空气中1 h。对照组大鼠将笼子置于常压(1013.27 hPa)的高压氧室中。所有动物被安置在恒温22±2℃的受控环境中。提供了食物和水随意．大鼠暴露于轻度高压氧后1分钟用过量戊巴比妥钠牺牲。立即取出指长伸肌和比目鱼肌，冷冻在液氮冷却的异戊烷中，保存在−80°C，待进一步分析。
肌肉样本在含有10 mM HEPES (pH 7.3)、11.5%蔗糖、0.1% Triton™X-100、1 mM二硫苏糖醇和5%蛋白酶抑制剂鸡尾酒(25955-11,Nacalai Tesque，日本京都)的冰冷均质缓冲液中均质。在1500度离心后×g在4℃下静置10分钟，收集上清液。将稀释后的匀浆加入到含有1mm 5,5 ' -二硫代-(2-硝基苯甲酸)溶液和10mm乙酰辅酶a溶液的反应混合物中，置于比色皿中。25℃孵育10 min后，在比色皿中加入10 mM的草酰乙酸溶液，用分光光度法测定反应溶液的光密度。
用低温冷冻仪从肌肉样品中部获得厚度为10 μm的连续横切面，并将其安装在玻片上。切片进行肌原纤维腺苷三磷酸酶(atp酶)和琥珀酸脱氢酶(SDH)染色。为了进行atp酶染色，切片在室温下在pH 4.2的醋酸巴比妥缓冲液中预孵育5分钟。用含0.18 M氯化钙的0.1 M巴比妥缓冲液洗涤2(pH 9.4) 30 s，切片在0.1 M巴比妥缓冲液含0.18 M氯化钙中孵育24 mM ATP (pH 9.4)室温45分钟。然后在1%的氯化钙中清洗切片2和2% CoCl2最后，用0.01 M的巴比妥钠。用蒸馏水冲洗后，用1%的硫化铵显示切片。对于SDH染色，切片在含有0.05%硝基蓝四唑和50 mM琥珀酸钠的50 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中孵育45分钟，在37℃。对切片进行分析，并在显微镜上获得图像(BZ-9000, Keyence, Japan Osaka)。利用atp酶和SDH染色的连续切片图像，根据先前的研究[17]，将肌细胞分为I型、IIA型或IIB型。SDH染色切片的组织化学图像数字化为灰度图像，SDH染色强度用光密度值表示。SDH染色强度为每块肌肉5个野进行量化。对每种肌肉细胞类型至少100个随机选择的SDH活性值进行分析。所有测量均使用ImageJ软件(NIH)进行。
肌肉样品在含有50 mM Tris-HCl (pH 7.8)、0.15 M NaCl和1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Nacalai tesque)的缓冲液中均质，4℃，离心去除碎片，收集上清液。测定总蛋白浓度后，将匀浆溶解在含有0.5 M Tris-HCl (pH 6.8)、2%十二烷基硫酸钠、10%甘油、5% β-巯基乙醇和0.005%溴酚蓝的缓冲液中，在80°C下煮沸10分钟。60微克蛋白质样品在40毫安时加载在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳上，并在200毫安时转移到聚偏氟乙烯膜上。转移后，用阻塞试剂(blocking one, Nacalai Tesque)阻塞细胞膜60分钟，并用anti-PGC-1α (1:200, sc-13067;Santa Cruz Biotechnology, TX, USA) 4°C抗体。孵育一夜后，膜在室温下与抗兔(1:10 000,sc-2370;圣克鲁斯生物技术公司)结合辣根过氧化物酶的抗体。使用化学发光检测器(ECL Prime, GE Healthcare, NJ, USA)检测信号，并使用图像阅读器(Versa Doc 5000, BioRad)进行分析。
使用TRIzol®试剂(15596-026,Invitrogen, Tokyo, Japan)从每块肌肉中分离总RNA，并使用高容量cDNA反转录试剂盒(4374966,Applied Biosystems, CA, USA)进行cDNA合成。使用CFX96™实时PCR检测系统(BioRad)中的TaqMan®基因表达测定法定量PGC-1α mRNA (Rn00580241_m1, Applied Biosystems)和归一化基因18S (Rn03928990_g1)的表达水平。
数据以均数±标准误差表示。两组间差异的显著性用独立量表进行评估t以及,P< 0.05为有统计学意义。
暴露于轻度高压氧1小时后，按方法分析骨骼肌。
Cont组和HB组之间，指长伸肌(图1A)和比目鱼肌(图1B)的CS活动均无显著差异。
图1所示。指长伸肌(A)和比目鱼肌(B)的柠檬酸合成酶(CS)活性。数值表示平均值±标准误差(SE)。所有组N = 6。图1-3中使用以下缩写。续:非高压氧控制;HB:高压氧。
atp酶和sdh染色显示指长伸肌由I型、IIA型和IIB型细胞组成(图2A-2D)，比目鱼肌由I型和IIA型细胞组成(图2H-2K)。在两个伸指上无论细胞类型如何，Cont组和HB组SDH活性均无显著差异。
图2。指长伸肌(A-D)和比目鱼肌(H-K)中肌细胞的琥珀酸脱氢酶(SDH)活性。Cont (A, B, H, I)和HB (C, D, J, K)组中有代表性的肌细胞横断面染色为三磷酸腺苷酶(atp酶)(A, C, H, J)和SDH (B, D, I, K)。1: I型细胞;2: IIA型电池;3: IIB型电池。比例尺= 100 μm。指长伸肌中I型(E)、IIA (F)、IIB (G)细胞和比目鱼肌中I型(L)、IIA (M)细胞的SDH活性。值表示均值±SE。对于每种肌肉细胞类型，测量了超过100个肌肉细胞。
Cont组和HB组在指长伸肌(图3A)和比目鱼肌(图3B)中PGC-1α蛋白表达水平无明显差异。然而，HB组指长伸肌(图3C)中PGC-1α mRNA的表达量约为Cont组的两倍，比目鱼肌(图3D)中PGC-1α mRNA的表达量明显高于Cont组。
图3。过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α (PGC-1α)蛋白(A, B)和mRNA (C, D)在指长伸肌(A, C)和比目鱼(B, D)和代表性western blot图像中的表达水平。计算值为Cont组相对指长伸肌的折叠变化，并表示均值±SE。*与Cont组显著不同，P< 0.05。所有组N = 6。
轻度高压氧对骨骼肌组织中CS和SDH活性无明显影响。CS定位于线粒体基质，在三羧酸循环[18]中起关键作用。CS催化乙酰辅酶A和草酰乙酸生成柠檬酸。SDH也被称为琥珀酸-泛素氧化还原酶，定位于线粒体内膜[19]。SDH氧化三羧酸循环中的琥珀酸，减少电子传递链中的泛素。利用这些酶活性作为线粒体代谢功能的指标，本研究表明，1h轻度高压氧与正常空气接触对线粒体代谢无影响。随着运动强度的增加，氧气的吸收和消耗都会增加，从而促进新陈代谢和产生能量[20]。运动中增加的摄氧量被用来再生运动中消耗的ATP。氧摄入量的增加也会激活单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)通路[7,15,16]。然而，在目前的研究中，AMPK通路可能没有被高压氧激活，因为动物在高压氧室暴露期间保持静止。 Similarly, Kurtet al。[21]报道了高压氧增加骨骼肌组织中的ATP和降低AMP浓度，表明高氧并不改变AMPK通路。
轻度高压氧与正常空气联合处理虽然没有改变PGC-1α蛋白的表达水平，但却提高了PGC-1α mRNA的表达水平。PGC-1α是一种转录辅激活因子，是参与线粒体生物发生[22]基因表达的主调控因子。尤其是在骨骼肌中，PGC-1α通过促进线粒体基因[23]的转录，调节线粒体生物发生的能量代谢。Matravadiaet al。[24]显示，单次运动仅在mRNA水平上增加PGC-1的表达水平。在他们的研究中，尽管一周的运动没有改变PGC-1α蛋白和其他线粒体含量标记物的表达水平，但四周的运动显著提高了这些标记物在蛋白质水平的表达水平。他们的研究结果表明，尽管单次或短期的运动不足以引起线粒体生物生成，但定期运动可诱导线粒体生物生成，增加PGC-1α蛋白。此外,Gutsaevaet al。[25]在海马区进行常规高压氧治疗后10天观察到线粒体的生物发生，但在治疗后5天没有观察到线粒体的生物发生，这表明线粒体的生物发生需要定期干预。PGC-1α可通过诱导ROS解毒酶[26]抑制大多数细胞中的ROS。如果高压氧在肌细胞中产生ROS，则ROS的产生将导致PGC-1α mRNA的表达增加和线粒体的生物发生。因此，本研究发现单次轻度高压氧配合正常空气可提高PGC-1α mRNA表达水平，由此我们推测，常规治疗可诱导心肌细胞线粒体生物发生，并上调PGC-1α蛋白的表达。
总之，虽然温和的高压氧和正常空气并没有显著提高骨骼肌线粒体酶活性，但治疗导致PGC-1α mRNA的增加，表明其有可能随着时间的推移诱导线粒体生物发生。线粒体的生物发生受PGC-1α调控，以及AMPK-和ros依赖的信号通路的激活[7,14,15]。然而，接触高压氧不太可能通过增加ATP的消耗来增加AMP。因此，单次轻度高压氧与正常空气结合诱导PGC-1α mRNA的升高可能与AMPK途径以外的机制有关。本研究提示轻度高压氧配合正常空气可促进肌肉线粒体生物发生。用高压氧治疗可以帮助肥胖者减肥。然而，这项研究也有一些局限性。我们还没有分析ROS和AMPK途径的下游分子。此外，实验模型仅限于研究治疗的急性效应。需要进一步的研究来确定轻度高压氧与正常空气在长时间内对心肌细胞线粒体生物发生的影响。
那种Nishizawa
军事大学
研究文章
收到:April13, 2016
录用日期:2016年4月22日
发表:April25, 2016
©2016 FujitaN。这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可协议(Creative Commons Attribution License)发布，该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
Fujita N, TomiokaT, Ono M, DeieM(2016)绝对压强为1.25个大气压的轻度高压氧对大鼠骨骼肌线粒体酶和PGC-1α mRNA水平的急性影响。生物医学文献ClinPrac 1: DOI: 10.15761/BRCP.1000109
广岛大学生物医学与健康科学研究生院肌肉骨骼功能研究与再生系，日本广岛南区1-2-3 Kasumi，电话:+81-82-257-5423，传真:+81-82-257-5423
图1所示。指长伸肌(A)和比目鱼肌(B)的柠檬酸合成酶(CS)活性。数值表示平均值±标准误差(SE)。所有组N = 6。图1-3中使用以下缩写。续:非高压氧控制;HB:高压氧。
图2。指长伸肌(A-D)和比目鱼肌(H-K)中肌细胞的琥珀酸脱氢酶(SDH)活性。Cont (A, B, H, I)和HB (C, D, J, K)组中有代表性的肌细胞横断面染色为三磷酸腺苷酶(atp酶)(A, C, H, J)和SDH (B, D, I, K)。1: I型细胞;2: IIA型电池;3: IIB型电池。比例尺= 100 μm。指长伸肌中I型(E)、IIA (F)、IIB (G)细胞和比目鱼肌中I型(L)、IIA (M)细胞的SDH活性。值表示均值±SE。对于每种肌肉细胞类型，测量了超过100个肌肉细胞。
图3。过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α (PGC-1α)蛋白(A, B)和mRNA (C, D)在指长伸肌(A, C)和比目鱼(B, D)和代表性western blot图像中的表达水平。计算值为Cont组相对指长伸肌的折叠变化，并表示均值±SE。*与Cont组显著不同，P< 0.05。所有组N = 6。
