看看最近的文章

摘要

血液采集协议是一个关键的分析前变量，必须在开发任何可复制的生物标志物测定过程中仔细定义。在收集和保存血浆样品时，必须限制内源性蛋白水解，使其处于下游分析相适应的状态。这项研究测试了从健康个体收集的匹配血浆样本的蛋白质组和肽穹的稳定性。每组样本同时捐献，并使用三种不同类型的血液收集管进行相同的存储/处理;(i)喷雾干燥的EDTA (ii)用聚合物凝胶的EDTA，和(iii)含有蛋白酶抑制剂专用鸡尾酒的EDTA管(P100^TM)．所有样品采用蛋白质组学和肽组学方法进行研究，包括2D凝胶电泳(2D DIGE)和固相萃取(SPE)，然后是ESI-MS/MS(电喷雾电离)分析。二维DIGE的结果显示，不同的抗凝管对二维DIGE观察到的血浆蛋白水平没有显著影响，尽管在每个个体中观察到一个蛋白质的微小变化，这在统计上似乎是随机发生的。相比之下，肽组分析结果显示内源性肽的数量较低，这表明用蛋白酶抑制剂鸡尾酒处理过的血浆中保留了一些蛋白质。然而，分析的每个血浆样本都显示从6种蛋白质(即纤维蛋白原α链，补体C4-A，补体C4-B， α -2-抗纤溶蛋白，补体C3和载脂蛋白E)中获得的内源性多肽，与收集所用的抗凝剂无关。这些数据应该有助于研究人员选择理想的抗凝剂进行血浆蛋白质组和肽球研究。

简介

临床蛋白质组学旨在发现、验证和验证可用于诊断、预后或治疗目的的疾病特异性蛋白质生物标志物[1 - 4］．血液是蛋白质组学分析中最常用的生物样本，可用于识别生物标志物[5］．生物标志物可以存在于各种不同的分子和细胞形态中，如蛋白质、DNA、循环肿瘤细胞。生物标志物检测和分析验证的开发是一个复杂的过程，需要考虑许多潜在因素(分析变量、生物学变量和队列组成)和应用的性质(例如，检测的侵入性、隐私、患者依从性和成本)[6］．为了准确识别和量化生物标志物，并确保候选生物标志物的临床成功，它们必须在样本收集、制备和纯化过程中保持稳定，并且必须以可检测的浓度存在。因此，分析前和储存条件[7，8]需要仔细建立，以防止在样品处理、加工、转移或储存过程中发生任何降解[9］．血浆分析是蛋白质组学研究的重要组成部分，它结合了蛋白质分离和表征技术[10 - 12］．经过几个工业和临床蛋白质组学/肽组学研究小组的个别尝试，HUPO血浆蛋白质组学项目[13 - 15]成立于2002年，目标是全面表征人类血浆中的蛋白质成分。该项目涉及全球35个实验室，初步鉴定出3020种血浆蛋白[16的高严格度(两个或更多肽)。大多数实验室都只专注于血浆蛋白质，并致力于其中一个主要目标，即创建血浆蛋白质组目录。尽管越来越多的人意识到，如果忽略样本之间的可变性，就会影响再现性，但证实这些变量对血浆蛋白质组学实验结果的影响所需的数据量并非微不足道[17］．2005年，HUPO的血浆蛋白质组计划[17样品收集和处理委员会发布了一份血浆收集和处理过程中需要考虑的变量清单(样品类型、收集系统、处理问题，如稳定性、处理存储和添加剂的潜在影响)[18，19］．许多血浆蛋白质组学研究报告称，许多观察到的肽是通过内源性蛋白酶的活性产生的[20.](例如氨基肽酶[21]和羧基肽酶[22])。蛋白质水解通常作为一种依赖时间的降解过程发生，可显著影响血液样本之间的比较分析[20.，23，24］．因此，样品收集过程中的并发症和缺乏一致性可能阻碍血浆中蛋白质生物标志物的发现和准确测量[25］．因此，很明显，一个标准化的血液样本收集策略是必要的，以限制的产生体外文物(26]，这不仅涉及适当的收集过程，还包括将样本保存在适合下游分析的稳定状态[27］．因此，引入了含有蛋白酶抑制剂的血液收集管的想法，通过最小化蛋白质水解来控制样品降解[28］．然而，采血方案的其他方面(即在采血管中使用抗凝血剂、离心速度、离心时间)已经引起了研究界的注意[29-31]，并会在为下游数据处理获取优质数据方面发挥重要作用[32］．

血浆制备方法中的常见添加剂包括抗凝剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸钠、肝素和华法林[28］．但由于各种原因，枸橼酸、肝素和华法林不适合用于下游蛋白质组学分析[到三十五］．柠檬酸作为一种液体试剂，包含在抽血管中，通常稀释血浆样本，在进一步研究时需要考虑到这一点[36］．此外，柠檬酸可以结合钙，导致多种分析物的免疫分析测量读数错误降低[19］．肝素是一种聚合氨基葡萄糖聚糖，在质谱中作为一种特有的重复构建块聚合物出现，掩盖来自蛋白质和肽成分的信号，使下游质谱分析具有挑战性[36］．一种更常用且与质谱兼容的添加剂是EDTA，这是一种聚质子酸，含有四个羧酸基团和两个带有孤对电子的胺基，可螯合钙和其他几种金属离子[37，38］．尽管EDTA抑制了凝血途径并防止凝块的形成，但它并不能阻止酶的第一步的激活，这是可能的结果体外多肽的生成仍然存在[38］．为了避免在采血过程中和采血后的蛋白酶活性，并解决上述缺点，设计了含有蛋白酶抑制剂(PI)的试管，目的是在采血的前15分钟内稳定血液蛋白质组。到目前为止，据我们所知，还没有进行全面的研究来调查不同的采血管在低丰度蛋白质或内源性/非胰蛋白酶肽水平上的功效。

我们目前的研究旨在帮助蛋白质组学研究人员建立一个具有成本效益和标准化的收集方案，将血浆样本保存在下游分析的最佳条件下。目前市面上有三种主要的含EDTA的管:EDTA仅作为抗凝剂(' E ': BD Vacutainers EDTA Tube)，一种相关的含EDTA的管有一个致密的聚合物凝胶基层，在离心后，将细胞体分割成凝胶(' G ': BD Vacutainers血浆制备管PPTTM)和一种含EDTA的管，含有蛋白酶抑制剂(PIs)的专有鸡尾酒(' P ': BD P100)^TM血浆蛋白分析用血液收集及保存系统)[39］．G管中的致密凝胶在离心过程中形成了血浆和血细胞之间的物理屏障。“P”管声称可以减少内源性蛋白酶对样品的降解。然而，它需要连接到一个专门设计的血液收集套件，以防止血液回流，并避免患者因蛋白酶抑制剂污染而产生不良反应。此外，还需要一个机械分离器，以便在离心过程中在等离子体和细胞物质之间提供坚实的屏障。带有完整血液收集套件的P管售价30.00美元，而含有EDTA的管(E管和G管)要便宜得多(分别为0.04-0.08美元和0.04-0.1美元)。据称，P管能够稳定蛋白质，并尽量减少在采集和处理血液标本过程中的蛋白质水解降解。一些研究使用靶向蛋白质组学方法，例如选择性/多重反应监测(SRM或MRM)，对P管中收集的血液与常规收集管中收集的血液进行了评估[26，40］．我们的研究旨在通过2D DIGE(二维差分凝胶电泳)和固相萃取(SPE)对低丰度蛋白和内源性多肽进行差异比较，评估在三种常用的管道- EDTA, Gel EDTA和P100中收集的血浆样品的固有蛋白酶活性。二维DIGE技术是在二维凝胶电泳之前基于蛋白质混合物的荧光预标记，在本研究中专门用于研究低丰度蛋白质[41］．这项技术结合了蛋白质在二维凝胶上分离的好处，以及在单一凝胶上可视化两个不同的样品[42］．我们之前的研究表明，在技术复制中，商业SPE容器提供了从EDTA血浆中最可重复的肽回收[43］．因此，我们采用SPE技术来检测三种不同血浆制剂之间内源多肽的差异。本研究将评估血浆样本的蛋白质组学和肽组学特征，并评估含有EDTA管的蛋白酶抑制剂与用于下游蛋白质组学和肽组学分析的标准EDTA管的效果。

材料和方法

从健康志愿者(n=3)中收集血液(10ml)，加入EDTA作为抗凝剂(' E ': BD Vacutainer®EDTA管，目录编号:366643)，一种相关的EDTA含有密集聚合物凝胶基层的管，离心后将细胞体分隔到凝胶中(' G ': BD Vacutainer®血浆制备管PPT™，目录编号:362788)，以及一种含有蛋白酶抑制剂专用混合物(' P ':BD P100™血浆蛋白分析血液收集和保存系统，目录编号:366456)。血浆样本来自年龄在25至35岁之间的男女混合个体，没有明显的慢性疾病(炎症、高血压、糖尿病等)证据。每组样品同时捐献，收集后30分钟内在2500×g室温下离心20分钟。血液采集获得了麦考瑞大学人类伦理委员会(Ref: 5201100388)的批准。血浆被回收，alias并储存在- 140°C。这些血浆样本被采集并批准用于一系列蛋白质组学研究。这些样本也被用于一项基于mrm的独立研究[26)(图1)。

图1所示。比较三种不同类型采血管中健康人血浆样品蛋白质组和肽穹稳定性的实验流程(i)喷雾干燥的EDTA (E) (ii)用聚合物凝胶的EDTA (G)和(iii)含有蛋白酶抑制剂专用鸡尾酒的EDTA管(P)

蛋白质组学分析

火星14 Immunodepletion

使用多重亲和去除系统(MARS-14)免疫消耗柱(美国安捷伦，CA)去除血浆样本中最高14个高丰度蛋白(白蛋白，IgG，转铁蛋白，hapgloin， α 1-抗胰蛋白酶，IgA，纤维蛋白原，α 2巨球蛋白，α 1酸性糖蛋白，IgM，载脂蛋白AI，载脂蛋白AII，补体C3和转甲状腺素)[44根据制造商的说明。简单地说，从三个个体(样品1、2和3)收集的三份重复血浆样品(管E、G和P)被解冻，并将130 μL注入到MARS-14亲和柱上。结合部分(BF) (4 ml)和流过部分(FT) (2.5 ml)分别被高丰度和低丰度的血浆蛋白富集。收集FT组分，然后使用5000 Da名义分子量切断过滤器(Amicon ultra - 2ml离心过滤器(MC, Millipore))将缓冲液交换为2D凝胶缓冲液。缓冲交换样品的最终体积为200 ul，浓度在2.08 ~ 2.56 ug/ul之间。根据生产商的说明，使用布拉德福德测定法(Sigma)计算BF和FT中的蛋白质浓度。

1D SDS PAGE分析

通过单层SDS-PAGE凝胶电泳(NuPAGE™Novex™4-12% bi - tris蛋白凝胶，1.0 mm, 10孔，标准:Precision Plus蛋白™万花筒™预染色蛋白标准，价值包1610395)分析高丰度蛋白耗损的效率。对于每个BF和FT, 2.5和5µg的总蛋白被分离在两个4-15% Criterion™TGX™预制凝胶((4-15%)双三联预制梯度凝胶)上，MOPS运行缓冲液(Invitrogen)在200电压下运行50分钟。在这两个凝胶中，Precision Plus protein™Unstained standard被用作分子量标记。然后将凝胶固定，用Sypro Ruby (Invitrogen)染色过夜，并在Typhoon Trio可变模式激光成形仪(GE Healthcare)上成像。

2D DIGE凝胶分析:

利用二维DIGE凝胶电泳分析和比较FT中每个低丰度蛋白富集组分(1E,1G, 1P, 2E, 2G, 2P, 3E, 3G和3P)。

二维DIGE凝胶用cydye(最少，3色cydye)标记蛋白质:

根据试剂盒提供的说明进行标签(GE Healthcare)。简单地说，每个蛋白样品的50µg用400 pmol所选cydye标记，在黑暗中冰培养30分钟。然后加入赖氨酸淬火cydye标记，然后在冰上进一步孵育10分钟。本研究共使用了6种DIGE凝胶。每个DIGE凝胶包含三种cydye(即Cy2, Cy3和Cy5)，允许两个样品的相对比较。样品用Cy3和Cy5标记，混合样品用Cy2标记作为内标。凝胶1比较1E和1G，凝胶2比较1G和1P，凝胶3比较2E和2G，凝胶4比较2G和2P，凝胶5比较3E和3G，凝胶6比较3G和3P。

第一维-等电聚焦(IEF)

使用Ettan IPGphor 2 (GE Healthcare)将CyDye标记的蛋白质样本集中在18 cm 4-7线性IPG条带上，并进行以下配置:300伏持续4小时，8小时内从300伏线性增加到8000伏，最后保持在8000伏直到累积约120 kVh。在整个聚焦过程中，电流极限设置为50 μA/条，温度设置为20℃。

二次元- SDS PAGE和成像

聚焦IPG条带在平衡缓冲液(6m尿素，3% SDS, 20%甘油，1x Tris-HCl缓冲液)中平衡约2 x 15分钟，然后使用8-18%梯度凝胶在二次元中运行。凝胶在4℃下以7 mA/凝胶运行一夜，然后以35 mA/凝胶运行，直到溴酚蓝染料前端刚刚从凝胶底部跑掉。测试结束后，立即使用Typhoon Trio可变模式激光成像仪扫描二维CyDye标记的DIGE凝胶，分辨率为100 um，光电倍增管设置为550 V。

图像分析与统计

利用Progenesis PG240软件(v2006，非线性动力学)对图像进行基于蛋白斑体积的定量分析。斑点检测采用自动斑点检测方法，必要时再进行手动校正。DIGE实验的Progenesis“比率”方法被用于数据的归一化，在定量分析之前，使用Progenesis背景减法从图像中减去背景[45-47］．利用Progenesis 2006版本软件，根据各组平均斑点体积(n = 3)进行图像比较，确定差异表达的斑点。>的相对丰度变化蛋白为1.5倍，当三种凝胶中至少有两种蛋白斑点表达差异为1.5倍时，视为差异表达蛋白斑点。蓝色点为蛋白下调点，红色点为蛋白上调点(图2)。

图2。1Db SDS - PAGE分析(A)高(BF)和(B)低丰度(FT)的MARS-14耗尽馏分。使用Precision Plus Protein™未染色标准作为分子标记(MM)。

Peptidomic分析

固相萃取

多肽分析使用样品1、2和3的等分。根据使用的抗凝血收集管的类型(E、G和P)将血浆样本汇集在一起。这是为了获得更大的容量(>1 ml)，以便向固相萃取筒中注入足够的样本。然后，根据制造商的说明，将样品通过固相萃取墨盒(Oasis HLB 1 cc Vac墨盒(目录编号:186005125,Waters Corp.， MA, USA)。具体来说，用1毫升甲醇和1毫升水调节药筒。然后将1 ml血浆样品加载到固相萃取夹上。随后用1毫升5%甲醇水冲洗药筒。最后，用2%甲酸甲醇和5% nhh洗脱多肽₄甲醇中的OH(1毫升)。然后将洗脱物在SpeedVac浓缩器中干燥，并在1%三氟乙酸中重悬。

MS分析

Eksigent UPLC系统(AB SCIEX)由一个nanoLC 425 UPLC泵和一个nanoLC 400自动进样器组成，用于流动相的输送和样品的注入。MS数据收集在配备PicoView 550纳米鱼源(新目标)的Orbitrap Elite (Thermo Fisher Scientific)质谱仪上。陷阱柱和分析柱分别为100 μ m × 3.5 cm和100 μ m × 20 cm，内部填充Halo®2.7 μ m 160 Å e - c18 (Advanced Materials Technology)。加载溶剂为0.1%甲酸/(FA) 2%乙腈(ACN)，分析溶剂A和B分别为0.1% FA/5%二甲基亚砜(DMSO)和0.1% FA/5% DMSO/94.9% ACN。

在C18 Zip Tip (merk - millipore)上浓缩和纯化后，样品在0.1%的FA(10µl)中重悬，以2.5µl/min的流速加载到捕集柱上，持续10 min。肽段在溶剂B(2.5 - 12.2%)的线性梯度下洗脱到分析柱上，持续5 min，然后(12.5 -80.1%)洗脱到分析柱上，持续75 min。流速为450 nL/min，柱温为60℃。每个制备的样品分析三次(n=3)，并分别获取技术重复的LC-MS数据(n=3)。

LC淋洗液通过液体结连接施加3.5 KV的电喷雾电位电离。肽前体扫描范围为300 ~ 2400 m/z，分辨率为240 k, AGC靶点为1E6，最大注射时间为200 ms。串联质谱对前一次调查扫描中检测到的最强的8个离子进行了CID和HCD碎片。动态排除持续时间设置为40秒，包含2次重复计数和20秒持续时间。启用提前过期。只对电荷状态为2或2以上的前体进行MS/MS分析。通过以下设置获得CID碎片谱:质量范围:正常，扫描率:正常，最小阈值信号(计数):500，隔离宽度:2Th，归一化碰撞能量:35%，激活q: 0.250，激活时间:10 ms，使用质量范围:350-1400。通过以下设置获得HCD碎片谱:质量范围:正常，分辨率:15K，最小阈值信号(计数):500，归一化碰撞能量:35%，隔离宽度:2Th，激活时间:0.1 ms，使用质量范围:350-1400。

肽识别

来自Thermo Xcalibur (Thermo Scientific)的原始数据文件被导入到Proteome Discoverer 1.3版本(Thermo Fisher Scientific, West Palm Beach, FL, USA，)。数据处理采用Mascot v.2.4.0 (Matrix Science, London, UK)，标准如下:蛋白质数据库:Swissprot，带有诱饵数据库。酶:没有。分类:智人．最大漏切位点:9个。前体质量公差:10ppm。碎片质量公差:0.5 Da。固定修饰:氧化(M)，乙酰(蛋白质- N术语)，氨基化(蛋白质c术语)，磷(ST)，磷(Y)，氧化(HW)。前驱体选择:使用MS1前驱体。前驱体质量范围:700-7000 Da。总强度阈值:50。最小峰值计数:5。目标FDR(严格):0.01。 Target FDR (Relaxed): 0.05, Query cover= 100%, Identity= 100%.

手工分析了每次检索的高置信度肽的列表，表1总结了技术重复的常见肽。出现在EDTA, Gel EDTA和P100管中的常见肽列在表2中。

表1。在E、G和P采血管采集的血浆样本(生物三副本)中发现常见内源性多肽。

肽序列	描述	UniProt ID
ADSGEGDFLAEGGGVR	纤维蛋白原α链	P02671
GLEEELQFSLGSK	补充C4-A	P0C0L4
DSGEGDFLAEGGGVR	纤维蛋白原α链	P02671
NGFKSHALQLNNR	补充C4-A	P0C0L4
ADSGEGDFLAEGGGVRGP	纤维蛋白原α链	P02671
NQEQVSPLTLLKLGN	Alpha-2-antiplasmin	P08697
PGSSGTGGTATWKPGSSGP	纤维蛋白原α链	P02671
SEETKENEGFTVTAEGK	补体C3	P01024
MEPLGRQLTSGP	Alpha-2-antiplasmin	P08697
KVEQAVETEPEPELR	载脂蛋白E	P02649
GSTGNRNPGSSGTGGTATWKPGSSGP	纤维蛋白原α链	P02671

结果

MARS 14免疫衰竭

通过Mars 14亲和柱进行免疫消耗，130 ul (conc。注射59-61 mg/ ml的血浆样品(总蛋白量7700- 7920 ug)，同时收集100 ul的流动组分(富集低丰度蛋白)。3.51-4.28 mg/ ml，总蛋白量726-856 ug)，说明注射的蛋白质几乎消耗了89-90%(消耗前后的完整蛋白质浓度表请参考补充表1)。血浆样品(1E, 1G, 1P, 2E, 2G, 2P, 3E, 3G和3P)的耗尽色谱图(补充图1)也显示了分别在结合部和流动部高效分离高丰度和低丰度蛋白。

1D SDS PAGE分析

用1D凝胶电泳分析了安捷伦MARS-14免疫亲和柱的结合和流动组分(分别富集高丰度和低丰度蛋白)。图2为凝胶图像的一维分析结果，从图中可以看出，在每个生物重复中，每个样品的蛋白质丰度高低没有太大差异。低丰度蛋白的富集可以通过凝胶条带上的分离模式看到。

2 d消化分析

通过二维DIGE分析生物三拷贝体的低丰度组分来评价抗凝剂的效果。目测结果显示，三种抗凝剂处理在每个重复的凝胶点分布大致相似。在样本1中，共识别出1152个斑点。样品1G和1P之间只有2个差异丰度点，而样品1E和1P之间只有一个差异丰度点(图3A)。样品2的二维DIGE分析共检测到1513个斑点，其中11个斑点在样品2E和2G之间差异丰富。相比之下，样品2E和2P之间有6个点是不同的(图3B)。最后，对样品3进行二维DIGE分析，共识别出1592个不同的蛋白点，其中样品3E与3G差异丰度点为3个，样品3G与3P差异丰度点为4个，样品3E与3P差异丰度点为10个(图3C)。

图3。用EDTA三种不同品种的血浆收集管(E、G、P)在6种不同凝胶(样品1、2、3分别在凝胶1、2、2、4和凝胶5、6上分析过)处理的生物三重复(样品1、2、3)中(低丰度富集蛋白)的MARS-14免疫枯竭血浆样品(样品1、2、3)的二维DIGE分析。用红色或蓝色圈出的点表示同一凝胶上两个样品差异表达的蛋白质(红色和蓝色表示上调和下调)，文本表示差异表达值。

Peptidomic分析

MS结果(肽组分析的补充图2中的MS色谱图)在所有血浆样品中共识别出212个内源性肽，与52个蛋白质相匹配(补充表2)。完全独立分析EDTA、凝胶EDTA和P100样品，识别出99、134和60个内源性肽序列，分别与每组34、34和20个蛋白质相匹配。

对EDTA重复的进一步分析显示，在所有三个重复中只识别出55个肽，与14个特定的蛋白质匹配(补充表3)。同样，在与15个蛋白质匹配的凝胶EDTA三复制中检测到35个肽(补充表4)，其中11个蛋白质是常见的(补体C3、胰岛素样生长因子II、载脂蛋白E、纤维蛋白原α和β链、α -2- hs -糖蛋白、载脂蛋白A-IV、α -2-抗纤溶蛋白、补体C4-A、α -胰蛋白酶间抑制剂重链H4和grb2相关和MAPK蛋白样OS的调控因子)。在P100三副本中，鉴定出18个肽段，仅与8个蛋白质相匹配(补充表5)。当所有结果进行比较时，仅鉴定出11个肽段，与6个蛋白质相匹配(纤维蛋白原α链、补体C4-A、补体C4-B、α -2-抗纤溶蛋白、补体C3和载脂蛋白E)。

讨论

为了评估使用抗凝剂将血浆保存在适合下游分析的状态，已经进行了许多研究。兰德尔等．采用选择性反应监测(SRM)策略，监测从EDTA、凝胶EDTA和P100管中收集的7个不同个体的血浆蛋白的定量变异性[26］．该研究表明，血液处理的方案只会导致完整血浆蛋白水平的微小差异，这些血浆蛋白是根据它们与纤维蛋白溶解、凝血、炎症或癌症的已知联系来选择的。本研究只研究了高丰度的蛋白质，如转甲状腺素，激肽原I和载脂蛋白A-I。在另一项研究中，Aguilar-Mahecha等．研究了不同处理方案以及管处理延迟对55种中丰度和高丰度血浆蛋白水平的影响，使用MRM-MS测定，以及使用商业可获得的多聚珠免疫测定27种低丰度细胞因子水平的影响。他们发现含有蛋白酶抑制剂的P100管只对4种细胞因子具有蛋白水解保护作用。尽管MRM测定的中丰度和高丰度蛋白在血浆中高度稳定，且未处理长达6小时，尽管血小板活化也会影响这些蛋白的水平[48］．奥尼尔等．对24名受试者进行了初步研究，并对105种分析物的血清、血浆和EDTA血浆与蛋白酶抑制剂进行了比较。尽管血清和血浆在可检测性和可测量性上存在显著差异，但EDTA血浆和P100血浆对大多数分析物表现出类似的性能，只有8种分析物在P100血浆中CV略有增加[27］．

在这项研究中，我们旨在补充Randall的结果et al。通过分析低丰度蛋白和内源性多肽的差异表达。因此，我们的样本最初使用基于MARS-14亲和的系统进行免疫消耗[49，50]去除前14个高丰度蛋白(白蛋白、IgG、转铁蛋白、碰珠蛋白、α 1-抗胰蛋白酶、IgA、纤维蛋白原、α 2巨球蛋白、α 1酸性糖蛋白、IgM、载脂蛋白AI、载脂蛋白AII、补体C3和转甲状腺素)。消耗色谱图表明，BF中高丰度的蛋白质被高效和一致地去除，这进一步被BF和FT组分的单独1D凝胶电泳分析所证实。

FT分数表明蛋白质条带明显增加，证实了FT分数中高丰度蛋白质的有效消耗。免疫消耗使用MARS-14免疫消耗柱进行，该柱在市场上可用于高丰度蛋白质的消耗。该色谱柱被研究界广泛采用，以降低高丰度蛋白的浓度，并在高度复杂的血浆样品中富集低丰度蛋白组分。许多研究强烈表明，号称选择性消耗血浆中14种高丰度蛋白质的商用MARS-14抗体亲和柱提供了高效、特异性和可重复的消耗[49，50］．因此，我们决定主要关注那些富含低丰度蛋白质的血浆部分。在随后的实验中，利用2D DIGE研究三种不同抗凝剂预处理对低丰度蛋白表达的差异。EDTA、凝胶EDTA和P100预处理血浆在三个生物重复(样本1、2和3的1152个、1513个和1592个斑点中分别有3个、17个和17个)之间的恢复和表达模式变化很小，在三个不同抗凝处理中不一致。这些发现支持Randal的假设et al。无论在采血管中使用何种抗凝剂，均无证据显示低丰度蛋白表达I发生可重复的变化[26］．

在进行多肽研究时，重要的是内源性多肽在血浆中保持稳定，用于下游生物标志物分析。肽酶活性在肽生命周期的几个阶段(包括生物活性肽的生产、激活、失活和降解)中的作用不可忽视[51］．虽然有些肽-肽酶配对已经很清楚了，但仍然有大量的生物活性肽在活的有机体内肽酶的调节作用尚未完全阐明[51］．易et al。使用MALDI-MS检测了富集的内源性血浆肽的时间依赖性变化，并声称在采血管中加入蛋白酶抑制剂可以缓解肽酶相关的分析前变异性[52］．这一发现支持了先前的说法，即当样品长时间保持在次优温度下时，蛋白酶抑制可以稳定内源性血浆肽的存在[53］．

我们的肽组分析数据表明，P100处理的三份样本中内源肽的数量(n=18)比EDTA处理的三份样本中的肽的数量(n= 55)少了近33%，比Gel EDTA处理的三份样本中的肽的数量(n=35)少了50%。有趣的是，在所有的重复中都识别出了与6种蛋白质鉴定相匹配的11个肽段(即纤维蛋白原α链、补体C4-A、补体C4-B、α -2-抗纤溶蛋白、补体C3和载脂蛋白E)。因此，这表明上述6种蛋白质在血浆样本收集后，在储存过程中会在蛋白质水解过程中降解并释放内源性肽段，而与使用的抗凝剂无关。值得注意的是，尽管内源性多肽来自血清白蛋白(血浆蛋白质中含量最多的蛋白质约。(70%的血浆蛋白)，还有其他内源性肽来自其他三个高丰度的血浆蛋白(纤维蛋白原α链，补体C3和载脂蛋白E)。然而，也很明显，内源性肽是由中丰度和低丰度的蛋白质释放的，如补体C4和α -2-抗纤溶蛋白在所有EDTA管品种中。

仔细分析表明，只有EDTA处理过的样品含有来自两种蛋白质(α -2-巨球蛋白和血清白蛋白)的内源性多肽，这在Gel EDTA或P100处理过的样品中没有发现。相比之下，凝胶EDTA和P100处理的样品分别有4个内源性肽(载脂蛋白C-III、载脂蛋白C-II、转甲状腺素和细胞外基质蛋白1)和1个内源性肽(α -1-抗凝糜胰蛋白酶)，这4个内源性肽在EDTA样品中没有发现。此外，我们还注意到EDTA处理过的血浆样本中含有8种中丰度和低丰度蛋白(即alpha- 2-抗纤溶蛋白、alpha- 2- hs -糖蛋白、载脂蛋白E、补体C4-A、补体C4-B、grb2相关的MAPK蛋白样调节蛋白、胰岛素样生长因子II、间-胰蛋白酶抑制剂重链H4和转甲状腺素)的内源性肽，其中5种是在EDTA凝胶中发现的内源性肽常见的。凝胶EDTA处理的样品有来自7个低丰度蛋白(alpha- 2-抗纤溶蛋白、alpha- 2- hs -糖蛋白、细胞外基质蛋白1、胰岛素样生长因子II、α -胰蛋白酶间型抑制剂重链H4和转甲状腺素)的内源性多肽。相比之下，在P100管中收集的样本只有从三种中丰度和低丰度蛋白质(α -1-抗凝糜蛋白酶，α -2-抗纤溶酶和补体C4)中收集的内源性多肽。我们的结果进一步表明，来自α -1抗凝糜胰蛋白酶的内源性肽只在含有蛋白酶抑制剂的管中发现，在EDTA和EDTA凝胶处理的样品中没有可重复的证据显示来自α -1抗凝糜胰蛋白酶的内源性肽。

随着对结果的进一步分析，我们预计会在用蛋白酶抑制剂处理过的血浆中发现α -1-抗凝糜胰蛋白酶，因为这种蛋白质可以抑制人体内蛋白酶的活性[54］．作为一种急性期蛋白，α -1抗糜凝胰蛋白酶与前列腺癌、肝病、帕金森病、阿尔茨海默病和慢性阻塞性肺疾病相关[55，56］．

我们的数据显示

结论

使用蛋白质组学研究对血浆生物标志物进行可重复和可靠的发现和验证，收集管中适当的标准抗凝剂是必不可少的。EDTA是最便宜和最常用的抗凝剂，用于临床和诊断目的的血液收集管。我们的观察结果强烈表明，与专门为研究目的而设计的更昂贵的含有蛋白酶抑制剂的血液收集管相比，用含有EDTA的血液收集管收集的血浆样本适合对临床样本进行蛋白质组学研究。本研究还表明，含有蛋白酶抑制剂的试管有时可以被认为是保存样品用于下游肽分析的合适选择。由于肽组学研究是在使用抗凝剂的基础上使用血浆样本池进行的，我们不能忽视个体生物学变异会造成观察误差的事实。然而，所使用的采血管和抗凝剂的类型将是为日常样本收集和处理而产生的所有sop的基本要求。

致谢

本研究得到了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会(NHMRC APP1010303)、新南威尔士州癌症委员会(RG10-04)和新南威尔士州癌症研究所(15/ECF/1-38)的项目资助，并得到了麦考瑞大学生物医学科学系的支持。本文描述的一些研究是通过访问澳大利亚政府国家合作研究基础设施战略(NCRIS)下建立的澳大利亚蛋白质组分析设施(APAF)来促进的。

补充表271016

参考文献

1. 谢淑云，陈荣坤，潘玉华，刘慧玲(2006)样品采集程序对低分子血清/血浆蛋白质组分析影响的系统评价。蛋白质组学2006;6: p。3189 - 98。(Crossref)
2. 沈燕，刘涛，ToliÄ N, Petritis BO，赵锐等。(2010)人血浆的降解-肽分析策略。J蛋白质组Res9: 2339 - 2346。(Crossref)
3. Hanash S(2012)呼吁对血浆蛋白质组进行全新的观察。蛋白质组学中国:6: 443 - 446。(Crossref)
4. Anderson NL, NG Anderson(2002)人血浆蛋白质组学的历史、特征和诊断前景。分子和细胞蛋白质组学2002;1 (11): 845 - 867 p。(Crossref)
5. Lundblad R(2005)使用血浆和血清进行蛋白质组学分析的考虑。肠胃病学网络杂志2005;1(2)。
6. Karczmarski J, Rubel T, Mikula M, Wolski J, Rutkowski A(2013)在一项基于质谱的大肠癌和前列腺癌生物标志物研究中，发现了影响血清肽谱的分析前相关变异性。Acta Biochimica Polonica2013;3 (60): 417 - 425 p。(Crossref)
7. 库什尼尔MM(2013):你冰箱里的样品还适合生物标志物的发现吗?美国临床病理学杂志2013;140(3): 287 - 288页。(Crossref)
8. Percy AJ, Parker CE, Borchers CH(2013)基于绝对定量mrm的血浆蛋白质组学研究中的分析前和分析变异性。生物分析法2013;5(22): 2837 - 56页。(Crossref)
9. Fung KY, Nice E, Priebe I, Belobrajdic D, Phatak A(2014)结直肠癌生物标志物:存在还是不存在?来自一条人迹众多的道路的警世故事。世界胃肠病学杂志:WJG2014;(4): 20 p。888。(Crossref)
10. 张宏，刘强，Zimmerman LJ, Ham AJ, Slebos RJ等。(2011)液相色谱-多反应监测质谱法定量多肽和蛋白质的方法。摩尔细胞蛋白质组学10: M110中心也能看到。(Crossref)
11. Surinova S, Schiess R, Hüttenhain R, Cerciello F, Wollscheid B，等(2011)血浆蛋白生物标志物的开发。J蛋白质组Res10: 5-16。(Crossref)
12. Luchansky MS, Washburn AL, McClellan MS, Bailey RC(2011)利用硅光子微环谐振器和亚微米微珠在扩展动态范围内对人血清和血浆中的蛋白质生物标志物进行灵敏片上检测。芯片实验室2011;11(12): 2042 - 4页。(Crossref)
13. Merrick BA(2003)人类蛋白质组组织(HUPO)与环境健康。有效马力Toxicogenomics111: 1 - 5。(Crossref)
14. omn GS(2004)通过HUPO血浆蛋白质组学项目发现和验证生物标志物的进展。Dis标记20: 131 - 134。(Crossref)
15. omn GS(2004)临床化学和实验室医学国际合作:人类蛋白质组组织(HUPO)血浆蛋白质组项目。临床化学实验室医学2004;42(1): 1 - 2页。
16. Muthusamy B, Hanumanthu G, Suresh S, Rekha B, Srinivas D，等(2005)血浆蛋白质组数据库作为蛋白质组学研究的资源。蛋白质组学5: 3531 - 3536。(Crossref)
17. omn GS(2004)通过HUPO血浆蛋白质组学项目发现和验证生物标志物的进展。Dis标记20: 131 - 134。(Crossref)
18. Rai AJ, Gelfand CA, Haywood BC, Warunek DJ, Schuchard MD等(2005)HUPO血浆蛋白质组项目标本采集和处理:迈向血浆蛋白质组样本参数标准化。蛋白质组学2005;5(13): 3262 - 3277页。(Crossref)
19. Hildebrand D, Merkel P, Eggers LF, Schlüter H(2013)人血浆中血管紧张素- i的蛋白水解过程。《公共科学图书馆•综合》8: e64027。(Crossref)
20. Wildes D, Wells JA(2010)人类血液n端蛋白质组的采样。美国国家科学研究院2010;107(10): 4561 - 6页。(Crossref)
21. 肖亚德，Brian AZ, Timothy M, Samantha JA, Tracy MH，等。(2009)血浆羧基肽酶N，羧基肽酶B(活化凝血酶激活纤维蛋白溶解抑制剂)和血小板对趋化素生物活性的调节作用。J临床生物化学2009;284 (2): p751-8。(Crossref)
22. Luque-Garcia JL, Neubert TA(2007)用质谱法制备血清/血浆谱分析和生物标志物鉴定的样品．J Chromatogr一个2007;1153 (2): 259 - 76 p。(Crossref)
23. Drake SK, Bowen RA, Remaley AT, Hortin GL(2004)血液收集管在血清多肽质谱分析中的潜在干扰。中国化学: 2398 - 2401。(Crossref)
24. 沈燕，ToliÄ N，刘涛，赵锐，Petritis BO，等。(2010)乳腺癌的血肽穹-降解组谱。《公共科学图书馆•综合》5: e13133。(Crossref)
25. Randall SA, McKay MJ, Molloy MP(2010)使用选择性反应监测MS评价采血管:对蛋白质组学生物标志物研究的意义。蛋白质组学10: 2050 - 2056。(Crossref)
26. O'Neal WK, Anderson W, Basta PV, caretta EE, Doerschuk CM等(2014)在SPIROMICS研究中比较慢性阻塞性肺疾病患者的血清、EDTA血浆和P100血浆中基于发光物的生物标志物多重检测。J Transl地中海12: 9。(Crossref)
27. Yi J, Craft D, Gelfand CA(2011)通过适当的血液收集和处理减少血浆样本的分析前变异。方法杂志728: 137 - 49页。(Crossref)
28. Rai AJ, Vitzthum F(2006)分析前变量对人血清和血浆中肽和蛋白质测量的影响:对临床蛋白质组学的意义。蛋白质组学的专家评论2006;3(4): 409 - 426页。(Crossref)
29. Barelli S, Crettaz D, Thadikkaran L, Rubin O, Tissot JD(2007)血浆/血清蛋白质组学:分析前问题。专家加速蛋白质组学2007;4: 363 - 370。(Crossref)
30. Banks RE, Stanley AJ, Cairns DA, Barrett JH, Clarke P, et al.(2005)血液样本处理对表面增强激光解吸/电离质谱鉴定低分子量蛋白质组的影响。临床化学, 2005;51(9): 1637 - 1649页。(Crossref)
31. Nanjappa V, Thomas JK, Marimuthu A, Muthusamy B, Radhakrishnan A，等(2014)血浆蛋白质组数据库作为蛋白质组学研究的资源:2014年更新。核酸Res42: d959 - 965。(Crossref)
32. Kim HJ, Kim MR, So EJ和Kim CW(2007)用二维凝胶电泳比较各种人血浆制剂中的蛋白质组。生物化学生物物理方法70: 619 - 625。(Crossref)
33. Rossignol P, Cambillau M, Bissery A, Mouradian D, Benetos A，等(2008)采血程序对血浆基质金属蛋白酶及其组织抑制剂浓度的影响。临床Exp药物学2008;35(4): 464 - 9页。(Crossref)
34. Krakow EF, Goudar R, Petzold E, Suvarna S, Last M，等。(2007)标本采集和储存对血小板因子-肝素抗体检测的影响。J是Clin Pathol吗128: 150 - 155。(Crossref)
35. Mohri M, Rezapoor H(2009)肝素、柠檬酸和EDTA对绵羊血浆生化的影响:与血清的比较。Res兽医科学86: 111 - 114。(Crossref)
36. Banfi G, Salvagno GL, Lippi G(2007)乙二胺四乙酸(EDTA)作为体外抗凝血诊断的作用。临床化学实验室医学45: 565 - 576。(Crossref)
37. Yi J, C Kim, Gelfand CA(2007)抑制内在蛋白水解活性调节人血浆的分析前变异性和不稳定性。蛋白质组学研究杂志2007;6(5): 1768 - 1781页．(Crossref)
38. Adriana AM, Michael AK, dominic D, Christoph HB, Mark B(2012)分析前变异对基于mrm - ms的中至高丰度血浆蛋白生物标志物和一组细胞因子测量的影响。《公共科学图书馆•综合》2012;7 (6): p . e38290-e38290。(Crossref)
39. Marouga RS, David, Hawkins E (2005) DIGE系统的发展:二维荧光差凝胶分析技术。分析和生物分析化学2005;382(3): 669 - 678页。(Crossref)
40. Palsuledesai CC, Ochocki JD, Markowski TW, Distefano MD(2014)代谢标记和2D-DIGE分析对法尼酰基转移酶抑制剂的响应有助于发现新的丙烯酰化蛋白。摩尔Biosyst2014;10(5)。(Crossref)
41. Mahboob S, Mohamedali A, Ahn SB, Schulz-Knappe P, Nice E, et al.(2015)全面分离人血浆肽顶是一个可以实现的目标吗?J蛋白质组学127: 300 - 309。(Crossref)
42. 屠C, Rudnick PA, Martinez MY, Cheek KL, Stein SE，等(2010)血浆蛋白质组学的局限性和血浆蛋白质组学的耗损。J蛋白质组Res9: 4982 - 4991。(Crossref)
43. Ahn SB, Khan A(2014)人血浆中高丰度蛋白消耗前后27种细胞因子、趋化因子和生长因子的检测和定量。EuPA打开蛋白质组学2014;3: p。78 - 84。
44. Fernando N, Panozzo J, Tausz M, Norton R, Fitzgerald G，等(2015)co2浓度升高改变小麦籽粒蛋白质组和面粉流变特性。食品化学170: 448 - 454。(Crossref)
45. Polaskova V, Kapur A, Khan A, Molloy MP, Baker MS(2010)高丰度蛋白质消耗:人类血浆生物标志物发现方法的比较。电泳31日:471 - 482。(Crossref)
46. Aguilar MA, Kuzyk MA, Domanski D, Borchers CH, Basik M(2012)分析前变异对基于mrm - ms的中至高丰度血浆蛋白生物标志物和一组细胞因子测量的影响。《公共科学图书馆•综合》7: e38290。(Crossref)
47. Cao TH, Quinn PA, Sandhu JK, Voors AA, Lang CC，等(2015)心衰患者血浆中用于预测治疗反应的新型生物标志物的鉴定。《柳叶刀》385供应1:S26。(Crossref)
48. Liu Y, Buil A, Collins BC, Gillet LC, Blum LC, et al.(2015)人类双胞胎人群中342种血浆蛋白的定量变异。摩尔系统杂志11: 786。(Crossref)
49. Lone AM, Kim YG, Saghatelian A(2013)识别肽酶-底物相互作用的肽组学方法。化学生物学的最新观点17: 83 - 89。(Crossref)
50. Yi J, Liu Z, Craft D, O'Mullan P, Ju G, et al.(2008)人血浆肽消化过程中固有肽酶活性引起顺序多步反应(SMSR)。J蛋白质组Res2008;7(12): 5112 - 8页。(Crossref)
51. Waters T，被膜E(2007)抑制固有蛋白水解活性减缓分析前变异和稳定人类血浆。蛋白质组。J蛋白质组Res．(Crossref)
52. a1 -抗凝乳胰蛋白酶可能是阿尔茨海默型痴呆的生化标志物。神经病学年鉴28日:561 - 567。
53. Christensson A, Björk T, Nilsson O, Dahlén U, Matikainen MT，等(1993)血清前列腺特异性抗原复合物1-抗凝乳胰蛋白酶作为前列腺癌的指标。J Urol150: 100 - 105。(Crossref)
54. Stenman UH, Leinonen J, Alfthan H, Rannikko S, Tuhkanen K, et al.(1991)前列腺癌患者血清中前列腺特异性抗原和a1-抗糜凝胰蛋白酶之间的复合物是前列腺特异性抗原的主要形式:检测复合物提高了对癌症的临床敏感性。癌症研究51: 222 - 226。(Crossref)