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摘要

(+)-Aeroplysinin-1是一种溴化生物碱化合物，由于其有效的抗生素作用，被一些海绵用作防御。(+)-Aeroplysinin-1具有广谱的抗肿瘤作用，是牛主动脉内皮细胞有效的抗血管生成化合物。EGFR被认为是(+)-aeroplysinin-1抗肿瘤化合物的分子靶点。我们之前已经证明(+)-aeroplysinin-1可以阻止Bad的磷酸化，这与线粒体介导的细胞凋亡诱导有关。在本研究中，我们测试了(+)-aeroplysinin-1抑制一组蛋白激酶活性的潜力以及(+)-aeroplysinin-1处理对Akt和Erk信号通路的影响。我们的研究结果清楚地表明(+)-aeroplysin -1在体外不抑制EGFR、VEGFR、Akt、Erk等19种蛋白激酶的活性，但(+)-aeroplysin -1处理会抑制内皮细胞中Akt和Erk的磷酸化。

关键字

aeroplysinin-1, Akt信号，血管生成，肿瘤Erk信号

介绍

(+)-Aeroplysinin-1是一种具有光学活性的1,2-二氢芳烃-1,2-二醇生物碱Verongia aerophoba，它们利用它作为一种化学防御，在组织损伤后保护它们免受细菌病原体的入侵[1 - 4]。aeroplysinin-1的抗菌作用使其成为一种有效的抗菌药物[1，4，5]和抗寄生虫化合物[6]。此外，aeroplysinin-1对多种肿瘤细胞具有细胞抑制和细胞毒性作用[7 - 11]。特别是，aeroplysinin-1通过其对egf受体酪氨酸激酶活性的抑制作用，对两种人类egf依赖性乳腺癌细胞系显示出强大的抗肿瘤作用[8]。

抑制肿瘤进展的另一种方法是阻断肿瘤血管生成[12，13]。我们之前已经将aeroplysinin-1定性为一种有效的抗血管生成化合物在体外和在活的有机体内(14]。aeroplysinin-1的抗血管生成作用与其通过激活线粒体途径诱导内皮细胞凋亡有关[15]。

为了进一步了解导致aeroplysin -1对内皮细胞的促凋亡作用的上游信号通路，在本研究中，我们评估了aeroplysin -1在体外抑制蛋白激酶活性和干扰内皮细胞Akt和Erk磷酸化的潜力，Akt和Erk是控制细胞增殖和存活的两个关键信号分子。

我们的研究结果表明，aeroplysinin-1的凋亡诱导机制是内皮细胞特异性的，依赖于Akt和Erk通路的破坏。

材料与方法

道德声明

HUVEC原代培养从大学临床医院产科(Málaga)捐赠的脐带中获得，并根据伦理委员会批准的程序获得捐赠者的口头知情同意。所有的个人数据都是匿名的，整个过程对本文作者来说也是匿名的，他们在手术室外接受了捐赠的脐带。所有程序都是按照Málaga大学生物伦理委员会提供的规则进行的。这项研究是Málaga大学生物伦理委员会批准的研究项目的一部分。

化学品和试剂

(+)-Aeroplysinin-1由Instituto Biomar (León, Spain)提供，溶解于DMSO中，保存于-20°C。兔抗akt、抗phospho- akt (Ser473)、抗p44/42 MAP激酶和抗phospho-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204)多克隆抗体购自Cell Signaling Technology。兔抗gapdh抗体购自Nordic BioSite。山羊抗兔和小鼠抗hrp二联抗体来源于Pierce。细胞培养试剂来自Life Technologies。其他试剂均由Sigma-Aldrich公司提供。

体外激酶抑制试验

激酶抑制筛选是ProQinase GmbH (Freiburg, Germany)提供的定制服务。

细胞培养

牛主动脉内皮细胞(BAE)在含有1 g/L葡萄糖、10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、50 U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、1.25 μg/mL两性霉素b的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中生长。人脐静脉内皮细胞(HUVE)从脐带中分离，在含有10mM HEPES、20%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、100 μg/mL肝素和30 μg/mL内皮细胞生长补剂(ECGS)的medium 199中明胶包被培养皿上生长。Sigma-Aldrich, St Louis, MI, USA)， 50 U/mL青霉素，50 μg/mL链霉素，1.25 μg/mL两性霉素b。在含有4.5 g/L葡萄糖、10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、50 U/mL青霉素、50 μg/mL链霉素、1.25 μg/mL两性霉素b的DMEM中培养人结肠癌细胞株HCT-116 (john Hopkins Kimmel Comprehensive Cancer Center B. B. Vogelstein教授赠送)、人纤维肉瘤HT-1080和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。所有细胞株在37℃和5% CO湿化条件下保持₂的气氛。

治疗

Aeroplysinin-1溶解于DMSO中，-20℃保存。细胞生长至75%汇合。随后，用血清剥夺法使细胞饥饿过夜，并用aeroplysinin-1处理2小时。然后，用含10%胎牛血清的培养基刺激细胞10分钟，收获用于分析。

免疫印迹

细胞在Laemmli’s上样缓冲液2X中裂解，在95°C下煮沸5分钟。样品经SDS-PAG电泳分离，并按标准程序印迹到硝化纤维素膜上。在TBS-T和5%脱脂干乳中阻断后，在4°C下用一抗探测膜过夜。然后，用TBS-T洗涤膜，用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗在阻断液中检测，室温下1小时。洗涤后，用ECL显影膜^TM系统(Amersham Biosciences)。为了重新探测抗体，膜在剥离液(62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS和0.77% β -巯基乙醇)中在50°C下摇培养30分钟。

结果

(+)-Aeroplysinin-1不抑制激酶活性在体外

对EGFR酪氨酸激酶活性的抑制作用被认为是aeroplysinin-1抗肿瘤作用的直接分子靶点[8]。由于受体酪氨酸激酶和其他蛋白激酶在血管生成过程中起着关键作用[16]，我们决定对2和20 μM (+)-aeroplysinin-1对表1所列25种蛋白激酶的体外活性的影响进行体外激酶抑制筛选试验。即使在最高测试浓度(20 μM)下，(+)-aeroplysinin-1也不能对这些蛋白激酶活性产生明显的抑制作用。特别是，EGFR和VEGFR2活性保持不变。

表1。将25个蛋白激酶纳入体外激酶抑制筛选，测试2和20µM (+)-aeroplysinin-1的效果。

蛋白激酶

ABL1

AKT1

AKT2

碱性

AMPK

表皮生长因子受体

ERK1

ERK2

FAK

FGFR1

FGFR2

FGFR3

FGFR4

IKK-beta

工具包

见过

mTOR

PDGFR-alpha

PDGFR-beta

TGFR1

TGFR2

TIE2

VEGFR1

VEGFR2

VEGFR3

(+)-Aeroplysinin-1处理抑制内皮细胞中Akt和Erk的磷酸化

存活途径的调控直接参与内皮细胞凋亡的调控[16]。在内皮细胞(BAE和HUVE)、肿瘤细胞(HCT-116和HT-1018)和非转化细胞(MEF)中分析(+)-aeroplysinin-1对细胞存活途径的影响。通过血清剥夺使细胞饥饿过夜，然后用10和20µM (+)-aeroplysinin-1处理2小时或不处理。然后，除阴性对照组外，他们被血清刺激。如图1所示，20 μM (+)-aeroplysinin-1显著抑制了BAE细胞中Akt和Erk的磷酸化，达到或低于阴性对照的水平。在HUVE细胞中也获得了类似的结果，其中Akt去磷酸化水平表现出剂量依赖性。相反，(+)-aeroplysinin-1在肿瘤细胞系HCT-116和HT-1018中不能抑制Akt和Erk的磷酸化。此外，用(+)-aeroplysinin-1处理MEF细胞(包含完整的Akt和Erk通路)对Akt或Erk的磷酸化状态没有影响(图1)。(+)-aeroplysinin-1对不同细胞类型的差异作用反映了该药物对内皮细胞中功能的特定通路的选择性，这些通路在本研究中使用的其他细胞系中可能存在缺陷或不存在。

图1所示。(+)-aeroplysinin-1 (Apl-1)对内皮细胞和非内皮细胞Akt和Erk磷酸化的影响。用Apl-1处理2小时，用血清诱导10分钟。在Laemmli缓冲液中制备裂解物，用Western blot分析Akt (P-Akt)和Erk (P-Erk)的磷酸化。细胞膜中含有总Akt和Erk。阴性对照(C-)对应于饥饿而非诱导的细胞;阳性对照(C+)对应于饥饿和血清诱导的细胞。在两个独立的实验中得到了相同的结果。

讨论

生物碱化合物aeroplysinin-1是由几种海洋海绵合成并分泌的一种防御武器[1,4,5]，对广泛的原核和真核细胞都具有细胞抑制和细胞毒性作用[1,4-11,14,17]。aeroplysinin-1抗肿瘤作用的分子靶点是EGFR酪氨酸激酶活性。一些报道提供了aeroplysinin-1对EGF受体的抑制作用的证据[8]，尽管这种作用受到其他人的质疑[18]。最近的一项对接研究预测，aeroplysin -1可以与EGFR催化激酶结构域相互作用，并表明类似的相互作用可能有效地抑制aeroplysin -1对其他受体酪氨酸激酶(如VEGFR2)的抑制作用，VEGFR2是血管生成的关键信号分子[19]。不幸的是，根据我们在体外激酶抑制筛选测试中获得的完全阴性结果，2和20 μM (+)-aeroplysinin-1对表1中列出的25种蛋白激酶的体外活性的影响，在现实世界中似乎并非如此。事实上，这次筛选表明(+)-aeroplysinin-1绝对不能抑制任何被测蛋白激酶活性，包括EGFR和VEGFR2。

另一方面，aeroplysinin-1的抗血管生成作用包括其对内皮细胞增殖的有效抑制作用(具有IC)₅₀值为2µM的BAEC)，并通过激活线粒体途径诱导内皮细胞凋亡。我们之前发表的研究结果表明，(+)-aeroplysin -1对内皮细胞凋亡的激活作用涉及多个靶点。它们包括Bad去磷酸化和转位到线粒体，在线粒体中，它与Bcl-XL的二聚化会促进细胞色素c的释放，从而导致半胱天冬酶的激活[15]。在控制血管生成的通路网络中，细胞外信号相关激酶-丝裂原活化蛋白激酶(ERK-MAPK)级联和PI3K/Akt通路起关键作用，控制增殖和存活信号的转导[16]。有趣的是，这两条信号通路都位于Bad磷酸化的上游(图2)。(+)-aeroplysinin-1抑制Erk和Akt磷酸化的能力(如图1所示)可能是其抗血管生成活性的原因。然而，我们在体外激酶抑制筛选中获得的阴性结果表明(+)-aeroplysinin-1也不能直接抑制Akt和Erk激酶的活性。本研究支持了(+)-aeroplysinin-1作为转导通路调节剂的假说。有趣的是，根据我们的研究结果，aeroplysin -1似乎对内皮细胞具有特异性作用，因为在肿瘤细胞系HCT-116和HT-1080的转导途径中未检测到任何影响(图1)，这些信号通路被解除调控[20.，21]。类似的情况也发生在MEF细胞中，尽管它们具有完整的信号通路。这一特征表明aeroplysinin-1可能是一些内皮酪氨酸激酶受体下游的特异性未识别介质的抑制剂，参与PI3K/Akt和MAPK通路的激活。因此，这种共同介质的阻断将导致两种途径的抑制。这一假设可以解释为什么aeroplysinin-1选择性地抑制内皮细胞中Erk和Akt的磷酸化。然而，需要进一步的研究来验证这一假设。图2总结了目前的知识状况，并提出了本研究结果与我们小组先前发表的结果之间的联系，表明(+)-aeroplysinin-1通过抑制Bad磷酸化、刺激细胞色素c释放和激活caspases对内皮细胞凋亡具有激活作用[15]。

图2。Apl-1诱导细胞凋亡的机制。内皮细胞特异性酪氨酸激酶受体下游的一种未知介质的抑制可能导致Erk和Akt磷酸化的抑制。在这种情况下，Bad会被去磷酸化并从细胞质溶胶转移到线粒体，在那里它会与Bcl-XL二聚，从而促进细胞色素c的释放，激活caspase 9和随后的凋亡(本工作和我们之前的文章[15]中获得的内皮细胞中Apl-1的结果用星号表示)。

Ackowledgements

作者感谢Auxiliadora López jimamesnez出色的技术援助。感谢Instituto Biomar S.A. (León, Spain)为我们提供化合物。

资金

这项工作得到了BIO2014-56092-R (MINECO和FEDER)和P12-CTS-1507(安达卢西亚政府和FEDER)的资助。“EnfermedadesRaras网络”是ISCIII(西班牙)的一项倡议。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定发表或准备手稿方面没有任何作用。

作者和贡献

构思和设计实验:Ana R. Quesada, Miguel Ángel Medina。
进行实验:Beatriz Martínez Poveda。
分析数据:Beatriz Martínez Poveda, Ana R. Quesada, Miguel Ángel Medina。
作者:Miguel Ángel Medina。

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