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摘要

癌症特异性亚型（CSI）与癌症有关。癌症基因组图谱（TCGA）是一个界面，有助于系统地研究大样本量多种肿瘤类型中CSI的疾病联系。我们分析了来自TCGA的12种不同组织的肿瘤类型的RNA序列数据集。根据剪接异构体的表达状态确定CSI。共分析了693对CSI×肿瘤类型对，涉及12种肿瘤类型的3935个样本中的288个不同亚型和263个不同基因。在52个已知的癌症生物标志物CSI基因中，48个正在进行临床试验分析。31个CSI与患者生存时间显著相关，其中18个来自肾癌样本。在59%的CSI×肿瘤类型对中观察到CSI基因过度表达/扩增率方面可能存在疾病联系。因此，CSI在发现癌症药物靶点方面可能比预期的更为重要。只有少数特异表达的CSI具有高选择性和安全性，如肺癌或肾癌中的Survivin-2B。

关键字

癌症特异性异构体，生存时间，剪接异构体，癌症基因组图谱

介绍

可变剪接是基因表达过程中的一个调控过程，它增加了转录组的多样性和蛋白质组的复杂性。转录因子结合位点[1]内的DNA和组蛋白修饰和突变等遗传和表观遗传因素共同调控。选择性剪接的变化与癌症[1]有关。许多信号通路在癌症中被改变是因为通路关键基因亚型表达的改变。一个基因的不同亚型可能表现出相反的生物活性，如caspase 8 (CASP8)的促凋亡亚型和抗凋亡亚型、肿瘤抑制亚型或Myc[1]的致癌亚型。以往的研究利用平行对端RNA测序或外显子阵列，探索了来自不同组织(包括前列腺、卵巢、结肠、膀胱、乳腺和肝脏)的一些癌症的特定亚型的谱图[2-8]。癌症特异性异构体(CSIs)可能为诊断标志物和治疗靶点提供一个候选库。例如，针对慢性髓系白血病(CML)细胞特异性断点簇区域- abelson (BCR-ABL)融合蛋白的抗癌药物可以针对癌症特异性亚型特别设计，以最小化毒性[1]。此外，Llpo的一项研究et al。报道了前列腺特异性抗原(PSA)亚型α2,3-唾液酸在鉴别侵袭性前列腺癌和非侵袭性前列腺癌方面的作用，以及其在临床翻译应用中的未来意义。此外，有报道称，已知基因如DNAJB6的剪接亚型参与了多种疾病，如亨廷顿病、帕金森病、四肢带肌营养不良、心肌细胞肥大和癌症[10]。王et al。，也报道了异常表达的微rna和某些转录因子在骨肉瘤[11]的预后和发病机制中的作用。

本研究的主要目的是利用公共资源全面探讨CSI的潜在疾病联系。有几个原因值得进行这项研究。首先，小样本一直是先前发表的CSI研究的主要限制。第二，研究药物靶点的生物学家需要了解癌症组织中异构体的表达谱及其与特定疾病或安全问题的可能相关性。迄今为止，只有为提供此类信息而专门设计的几个全面、公开的数据库。第三，以前的研究仅对少数CSI揭示了疾病联系的可能机制。据我们所知，目前还没有公开发表的研究系统地探讨了几十种大样本肿瘤类型中剪接异构体的疾病联系。在这项研究中，基于我们先前的发现[12]，我们系统地揭示了来自癌症基因组图谱（TCGA）不同组织的12种肿瘤类型的RNA-Seq数据集的剪接特征。总共从3935份样本中的12种肿瘤类型中选择693对CSI×肿瘤类型对。从三个不同的角度评估CSI的疾病联系潜力：已知的癌症-疾病生物标记物（37%对）、可能的过度表达/扩增生物标记物（59%）和可能的预后生物标记物（4%）。当某些CSI在肿瘤样本中特异表达，而在正常样本中不存在时，可以选择它们作为药物靶点。尽管特异性剪接亚型与各种癌症相关并不是一个新概念，针对这些改变可能是理解癌症的关键之一，我们的工作的重大贡献是在多种肿瘤类型的样本中纳入所有基因的CSI候选基因，并识别出具有巨大癌症潜力的CSI。

材料和方法

在识别CSIS时使用公共可用数据集

整个转录组测序，也被称为“RNA- seq”，捕获生物样本中的编码和非编码RNA。我们收集并分析了3935份RNA-Seq样本的数据。该样本跨越TCGA的12种肿瘤类型，从不同角度全面了解了肿瘤基因组学。每个肿瘤类型的样本数量在34到849之间，以及它们的RNA-Seq数据、拷贝数变异数据和临床数据。在有实体组织正常样本RNASeq数据的情况下，从不同肿瘤组织中收集12种肿瘤类型:乳腺(乳腺癌BRCA)、内分泌(甲状腺癌THCA)、胃肠(肝肝细胞癌LIHC)、妇科(子宫体子宫内膜癌UCEC)、头颈部(头颈部鳞状细胞癌HNSC)、胸部(肺腺癌LUAD和肺鳞状细胞癌LUSC)和泌尿系(肾嫌色细胞癌KICH、肾肾细胞癌KIRC、肾肾乳头细胞癌KIRP、前列腺癌PRAD和膀胱癌BLCA)。

研究方案由研发信息中国公司阿斯利康批准，并严格按照STREGA指南进行研究。

从RNA-Seq数据集识别CSIs

图8A和8B描述了用于从RNA序列数据集中识别CSI的方法。剪接异构体的表达状态由其他地方讨论的方法确定[9]。首先，根据特定外显子集或连接集的表达值确定肿瘤样本中所有剪接亚型的表达状态。根据特定外显子或连接的平均表达值，以相同的方式确定合并的实体组织正常样本的所有剪接异构体的表达状态。第二，肿瘤样本的CSI候选样本通过两个标准之一确定：1）如果发现肿瘤样本中表达了一种异构体，但在实体组织正常样本中不存在；2）如果肿瘤样本和实体组织正常样本中都表达了一种异构体，仅当肿瘤样本和实体组织样本之间的所有特定外显子或亚型连接的平均表达值的倍数变化大于5倍时。第三，确定肿瘤类型的候选CSI。最后一组CSI包括在肿瘤类型中发生率不低于5%的亚型。

图8。用于查找来自RNA-SEQ数据集的癌症特异性同种型的管道和CSI功能注释
（A） 描述从RNA-Seq数据集中寻找癌症特异性亚型的方法；（B） 三类CSI×肿瘤类型对的重叠轮廓。I类由CSI×肿瘤类型对组成，其中CSI基因是GOBIOM疾病的生物标记物。II类由CSI×肿瘤类型对组成，其中CSI基因在匹配的肿瘤类型中显著过度表达或扩增。III类是CSI×肿瘤类型对，其中CSI可能是匹配肿瘤类型的预后生物标志物。

统计方法

与患者生存时间显著相关的CSIs通过两个步骤确定。首先，采用Cox比例风险模型，各CSI分别纳入临床分期、年龄、性别等其他临床参数并进行调整，以P<0.05为显著性。这个过程是通过使用R (version 3.1)项目中的生存包来执行的。其次,以下经验标准被用来过滤数据:1)两组的整体生存比率必须不大于3%,2)两组病人的样本大小必须极其不平衡,有或没有CSI和所选择的候选人被kaplan meier方法进一步分析。

结果

CSI综述TCGA肿瘤类型

本研究共鉴定了693对CSI×肿瘤类型对，涉及12种肿瘤类型。这693对涉及288个不同的亚型和263个不同的基因。每种肿瘤类型的亚型数量及其发生率差异很大。就每种肿瘤类型的CSI计数而言，一些肿瘤类型有大约100个CSI，如KIRP、LUCS/LUAD和LIHC。一些肿瘤类型有相当数量的CSI，如THCA和PRAD。就某一肿瘤类型的发生率而言，大多数配对涉及5%-10%的患者；然而，某些肿瘤类型富含高发生率的CSI(≥ 20%），如LUCS、KIRP和LUAD（图1）。此外，124个CSI是特定肿瘤类型特有的，164个CSI由两个或更多肿瘤类型共享。肿瘤类型计数越高的CSI发生率越高（图2）。

图1。不同肿瘤类型肿瘤特异性亚型发生率的密度图
x轴表示肿瘤类型中癌症特异性亚型的发生率。y轴表示相应发生率的密度。

图2。癌症特异性异构体的发生率与存在癌症特异性异构体的肿瘤类型数量的箱形图
X轴表示存在癌症特异性亚型的肿瘤类型数量。Y轴代表肿瘤类型中癌症特异性亚型的发生率。

的CSI的生物功能在它们涉及在生物过程的方面的探讨。如所示图3中，CSI基因被映射到63基因本体论（GO）术语，主要属于“代谢过程”，“响应于刺激”，“细胞通信，“”细胞生长和死亡，“生物合成过程，”转录，“”运输“和”蛋白质改性[13]。通过映射到它的基因的平均值的平均值来评分GO术语。虽然在所有肿瘤类型中几乎所有的GO术语都存在，但在肿瘤类型的情况下得分术语不同（图3）。例如，LUSC和KICH或KIRC中的GO术语分别总是大于LUAD和KIRP。这意味着即使通过GO条款分组，肿瘤类型的CSIS的发生比率仍然不均匀。通过使用在线工具数据库进行注释，可视化和集成发现（David）的CSI基因的丰富和聚类分析如下表文件[14]。具有高浓缩性的顶部簇含有生物学过程，如细胞死亡和细胞周期。

图3。肿瘤类型癌症特异性同种型的生物学功能。柱是肿瘤类型
列是基因本体论的癌症特定亚型的基因。细胞值是所有癌症特定亚型的平均发生率，其相应的基因被映射到基因本体论术语。不同的单元格值范围用不同的颜色表示。

CSI基因的已知疾病生物标志物

我们收集了由疾病生物标志物分类的所有基因，用于来自GVK生物在线生物标志物数据库（Gobiom），一个综合生物标志物数据库，包括从临床试验，科学会议，监管核准的文件，文学数据库等信息收集信息。

263个CSI基因中，有52个在gobio癌症生物标志物中发现。在疾病生物标志物的药物研发管道阶段，40个CSI基因处于临床试验阶段(2个在IV期，8个在III期，15个在II期，15个在I期)，其他CSI基因处于临床前或探索阶段。参与不同GOBIOM疾病的CSI基因可能处于不同的管道阶段。每个肿瘤类型和功能类别中被标注为癌症疾病生物标志物的CSI基因的百分比分别在7%-39%和29%-50%之间。

在GOBIOM中，一个基因可以被注释为多种肿瘤类型的疾病生物标志物。GOBIOM肿瘤类型越多，CSI基因与癌症的相关性越强的可能性就越大。如图4所示，有31个CSI基因GOBIOM肿瘤类型数大于1。CSI基因在GOBIOM和TCGA肿瘤类型之间注释不同，如果CSI基因的TCGA肿瘤类型之一也在GOBIOM肿瘤类型中发现，该CSI基因与TCGA肿瘤类型的疾病联系被归类为“已验证”。在52个CSI基因中，有22个已经“验证”与某些癌症的疾病联系(图4)。

图4。在GOBIOM肿瘤类型中存在CSI基因
颜色红色表示GOBIOM和TCGA肿瘤类型的重叠。X轴代表癌症特异性同种型的基因。Y轴表示存在CSI基因的GOBIOM肿瘤类型的数量。

CSIs每一肿瘤类型的发生率和CSIs的TCGA肿瘤类型计数是CSIs疾病联系的两个简单而直接的测量方法。随着CSIs发生率的增加，被标注为疾病生物标志物的CSI基因比例增加。例如，半数以上的CSI基因(其发生率大于50%)与某些肿瘤类型有疾病联系的证据。CSIs的TCGA肿瘤类型计数也有相同的趋势。随着肿瘤类型计数的增加，被标注为疾病生物标志物的CSI基因的比例增加。

CSIS与临床表型的相关性

识别癌症司机的共同策略是将基因组改变与临床表型联系起来。观察到一些CSIS与患者存活时间明显相关。它们被认为是预后生物标志物的候选者并被称为预后CSIS。总共31种预后CSIS（图5;补充表2）涉及不同的肿瘤类型和生物功能类别。在32个预后CSIS中，8例被注释为GOBIOM疾病生物标志物。根据两组患者所取的危险比计算 - 有或没有CSI - 预后CSIS的患者分为两组：预后差和良好的预后生物标志物。

图5。肿瘤类型的癌症特异性同种型的预后生物标志物

大多数预后不良的CSI被发现富含肿瘤型KIRC。NM_000238是KCNH2（钾通道，电压门控Eag相关亚家族H，成员2）的最长异构体，编码一种称为Kv11.1（乙醚-a-go-go相关基因/Herg）的蛋白质，该蛋白质是电压门控钾通道的α亚单位。Kv11.1的过度表达导致卵巢癌和胃癌的预后不佳[15,16]。NM_016592编码神经内分泌分泌蛋白55（NESP55），在胰腺和肾上腺的神经内分泌肿瘤中表达[17]。它是编码鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G蛋白）α亚单位的GNA亚型。GNAS突变是胰腺囊性肿瘤的一种亚型，是导管内乳头状黏液性肿瘤的特异性突变，预后不良。另一种GNAS剪接变体可能与雌激素受体阳性乳腺癌的发病机制有关，这与不良预后有关[18]。NM_004000编码最长的几丁质酶3样2（CHI3L2）亚型。几丁质酶样软骨蛋白的CHI3L1和CHI3L2基因具有高度的核苷酸和氨基酸序列同源性。CHI3L1或CHI3L2激活PI3K/AKT通路和MAP激酶信号级联[19-21]。它们的过度表达与胶质母细胞瘤的低生存率显著相关[22]。

发现良好的预后CSIS显着与延长存活时间显着相关，遍布多种肿瘤类型。虽然它们可能是某些肿瘤类型的真正预后生物标志物，但很难确定它们是否也是癌症司机。我们的知识范围有限，我们引用了一个示例，表明预后CSIS类别在癌症研究中可能是重要的。NM_130439（MXI1-SRALPHA）编码基因MXI1（最大相互作用蛋白1）的拼接同种型，其是MYC系列转录调节剂的成员。MXI1的过度表达与中国乳腺癌患者的更好的疾病特异性存活率显着相关[23]。MXI1甲基化是Medulloblastoma的高风险生物标志物之一[24]。此外，原发性人透明细胞肾癌中的MXI1过表达重新编程细胞能量代谢并保护来自C-MYC依赖性细胞凋亡的细胞[25,26]。

CSI基因的过表达和扩增谱

由于肿瘤发生、增殖和转移所必需的基因总是被放大或过表达，因此可以选择DNA扩增或基因过表达作为生物标志物来评估该基因与各自肿瘤的连锁潜力。值得注意的是，在肿瘤类型中过度表达和高比例放大的基因通常作为药物靶点。我们假设，如果一个基因与肿瘤类型有关联，那么它的CSIs可能也有相同的疾病关联。

肿瘤类型中CSI基因的过度表达程度或扩增率允许评估CSI与相同肿瘤类型存在疾病联系的可能性。194 CSI基因×肿瘤类型的过表达率大于10%（图6）。按药物研发管道阶段分类的三类CSI基因的过表达率密度图相似。此外，CSI基因过度表达率与CSI比率之间没有线性关系；也就是说，具有小基因过度表达率的基因可能具有大CSI样本率，反之亦然。因此，CSIs的表达有时可能比其基因的表达更好。例如，38%的LUSC样本中存在编码CD44最长转录本的NM_000610（CD44v6），但LUSC中CD44的过度表达率为零。CD44v6在肺鳞状细胞癌中表达，并与淋巴结转移和肿瘤大小显著相关[27]。

图6。癌症特异性异构体(csi基因)基因过表达率概况
X轴表示癌症特异性同种型的发生比。Y轴表示癌症特异性同种型基因的过表达比。

27个CSI基因×肿瘤类型的扩增比大于5％，表示CSIS的基因不太可能被扩增。过表达和扩增的CSI基因如图7所示。虽然只有一些CSI基因被作为GOBIOM疾病生物标志物注释，但其他CSI基因也可能具有疾病联系的潜力。例如，RAB3IP，RAS样GTPASERAB3A的交流剂的人类同源物在三种癌症类型中过表达和扩增：BLCA），管道和颈部鳞状细胞癌HNSC。在三种癌症类型中，RAB31P，NM_00102467的剪接变体的样品比分别为28％，26％和17％。据我们所知，RAB31P和癌症之间没有建立联系;然而，其相互作用蛋白rab3a显示参与肿瘤发生[28,29]。

图7。癌症特异性同种型基因的扩增比和过表达比的散点图（CSI-基因）
大点是CSI基因，具有显著的扩增和过度表达相关性。”“已知”代表注释为GOBIOM癌症疾病生物标记物的CSI基因。

查询界面

本研究提供了查询和下载所有详细数据的界面。它既可以用于患者级数据(特定外显子/连接基因及其表达值、亚型存在状态等)，也可以用于疾病级数据(CSIs的发生率和相应的基因过表达/扩增率)。该界面可通过http://dev-rwe.rwebox.com/TCGA/(2016年6月20日访问)[30]登录。

讨论

我们分析了从12种TCGA肿瘤类型的RNA-Seq数据集中鉴定的693对CSI ×肿瘤类型对。这些对被分为三类。I类有255对(37%)CSI基因为gobio癌症疾病生物标志物。II类有411对(59%)CSI基因在匹配的肿瘤类型中过度表达或扩增。III类有31对(4%)CSIs是可能的预后生物标志物。IV类有188对(27%)，其疾病联系有待进一步探索。在II类配对中，27%也属于I类，这表明除了过度表达或扩增外，还存在其他剪接亚型，这可能是这些基因导致癌症的一种新的机制。在III类配对中，58%在I类中未发现，但在II类中发现，说明这些CSI基因可能是新的癌症基因，但这需要进一步证实。I-III类唯一共有的CSI是KIRC的NM_000135，它编码的亚型最长FANCA（Fanconi贫血，互补组A）基因。据我们所知，没有关于该基因与肾肾细胞癌的联系的公布研究。在52个已知的癌症生物标志物CSI基因中，已经在临床试验中使用了48个;在先前的研究中发现了22种CSI基因的22种CSI基因的疾病联系。在31中，CSIS与患者存活时间显着相关，在肾脏癌症中发现18个。这表示少数替代的拼接同种型可以是肾癌的关键驱动因素，特别是肾肾细胞癌。

由于两个原因，有些异构体没有包括在这项工作中。首先，这项工作是基于已知的基因组注释结构，因此很少有新的异构体被遗漏。其次，我们根据单一亚型水平挖掘CSI候选。因此，一些众所周知的亚型切换事件可能会被遗漏，因为它们涉及多个亚型。例如，据报道，肾癌中成纤维细胞生长因子受体2 (FGFR2)的FGFR2- iiib (NM_001144919, NM_022970)和FGFR2- iiic (NM_001144915, NM_001144916, NM_001144918, NM_000141)之间的肿瘤特异性亚型切换不包括在本研究[31]中。

一些CSIs可能会被化合物、抗体或siRNA高选择性地靶向，当它们满足以下一个或多个标准时:1)它们是可药物治疗的;2)是高表达的膜蛋白;3)是化合物的酶或激酶;4)专在肿瘤标本中表达，具有较高的有效性和安全性。举个例子,在我们的研究中,NM_001012271 (Survivin-2B)的剪接变体BIRC5 (Baculoviral IAP重复包含5)被发现只表示在KIRP肿瘤样本,LUAD, LUSC,高出现率为29%,19%,和34%,分别,而不是表现在邻近固体组织正常样本。张的研究et al。据报道，在非小细胞和小细胞肺癌中，多种基因表达与不良的总存活和无复发存活（RFS）有关。Survivin-2b的抗凋亡作用和高表达与体外急性髓性白血病（AML）患者的较低生存率相关[33,34]。靶向Survivin-2B可以是Kirp，Luad或Lusc患者的有效手段，以克服它们对化疗等标准治疗方案的抵抗力。其他CSI候选人的药物潜力和可能的疾病联系是由肿瘤研究人员调查和验证的认证和验证。

利益争夺

作者声明他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

贾伟构思了这项研究;闫吉表演分析;明辰开发了Web应用程序;闫吉，云​​钦陈和贾伟参加了稿件。所有作者都已读取并批准了稿件的最终版本。

确认

我们欣赏Ziliang Qian和Dong Hua为这项工作给了我们一些有用的建议。

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