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摘要

目的:研究原发性先天性青光眼(PCG)患者房水(AH)与先天性白内障患儿房水(AH)中microRNA (miRNA)的差异。

方法:手术中从PCG患者(n=6)和先天性白内障患者(n=6)中提取AH样本作为对照组。从约100µL的AH中提取miRNA后，使用生物分析仪(Agilent)确认了小rna(<200个核苷酸)的存在。然后根据标准协议将标记的miRNA杂交到miRNA微阵列4.0 (Affymetrix)上。使用Partek Genomic Suite 6.13和单因素方差分析(one-way ANOVA)统计检验分析miRNA微阵列数据，以识别显著差异表达的miRNA。使用DIANA工具(mirPath)进行通路分析，以识别与差异表达(DE) miRNAs相关的通路。

结果:在AH样本中，共有2578个miRNAs被定量。分析发现PCG患者AH中有11个DE miRNA。mirPath发现Wnt信号通路是与5个与5个基因相关的DE miRNAs [hsa-miR-4659a-5p, hsa-miR-548aa, hsa-miR-548t-3p, hsa-miR-606和hsa-miR-548aj-3p]相关的主要通路:ROCK1(ENSG00000067900),SMAD2(ENSG00000175387),NFAT5(ENSG00000102908),PRKCB(ENSG00000166501)和TBL1XR1分别(ENSG00000177565)。

结论:与先天性白内障对照组相比，PCG患者的AH显示出不同的miRNA谱。大多数下调的特异性miRNA与Wnt信号通路相关，可能与小梁网功能障碍有关，类似于在成人青光眼中报道的情况。

关键字

先天性青光眼，遗传，miRNA, Wnt信号

简介

原发性先天性青光眼(PCG;人类231300)是一种常染色体隐性青光眼，在婴儿期发病，其特征是小梁网(TM)发育缺陷和影响房水流出通路的前房角[1］．CYP1B1(人类* 601771；细胞色素P450，亚族I，多肽I)突变是人类PCG的主要原因[2］．尽管最近的动物研究支持氧化应激诱导的PCG模型，但其确切机制CYP1B1调节前房发育的机制仍不清楚[3.］．LTBP2(人类* 602091;潜在转化生长因子-结合蛋白2)突变是导致PCG的原因是极其罕见的;仅在巴基斯坦、伊朗和欧洲吉普赛人的少数家庭中有报道[4］．由此可见，PCG中其他基因/蛋白质可能发生改变，尚待鉴定。

AH蛋白组成的改变与包括PCG在内的几种眼病有关[5］．最近的研究为分子介质如microRNAs (miRNAs)参与青光眼的病理生理提供了证据[6］．此外，眼细胞中mirna的鉴定[7白内障患者的AH [8，从AH分离的外泌体[9和玻璃体液[10]表明miRNAs可能在眼睛功能和眼疾中发挥作用。

许多研究报道了miRNA在几种眼病中的失调。其中包括透明和老年性白内障人晶状体中央上皮中的差异miRNA表达[11];转化生长因子- 1 (TGFβ1)处理的人原代榫成纤维细胞[12];青光眼患者的AH [13];和福尔马林固定石蜡包埋眼内髓质上皮瘤患者的组织标本[14］．

本研究的目的是评价PCG患者AH中的miRNA谱，并将其与先天性白内障患者AH中的miRNA谱进行比较(作为对照组)。

材料和方法

以PCG (n=6)为患者组，以先天性白内障(n=6)为对照对照组，检测AH差异miRNA表达。所有PCG患者均经临床确诊为PCG，且均为阳性CYP1B1突变(G61E)在沙特PCG患者中很常见。既往有患眼手术史、眼部炎症和先天性青光眼综合征的患者被排除在研究之外。在青光眼白内障手术开始前，大约100-200 μ L的AH通过穿刺术取出。样品立即在10,000xg的条件下离心10分钟，以去除细胞碎片。使用Qiagen miRNeasy迷你试剂盒(Qiagen Inc.， Valencia, CA, USA)从每个患者收集的约100µL的AH中提取miRNA，使用补充协议:RY43从血清或血浆中纯化总RNA(包括小RNA)。安捷伦2100生物分析仪证实了小rna(<200核苷酸)的存在。Santa Clara, CA, USA)使用安捷伦生物分析仪Pico芯片。使用Ncode miRNA扩增系统v.2扩增单个AH样本中的miRNA(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)。总共130 ng扩增的miRNA被用于FlashTag HSR标记试剂盒(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)的标记，由于扩增的miRNA在扩增步骤中已经被A尾，因此省略了A尾步骤。 The labelled miRNA was then hybridized to Affymetrix miRNA array 4.0 according to the standard protocol. Affymetrix miRNA 4.0 is the newest miRNA array from Affymetrix and it provides 100% miRBase v20 coverage including 2578 human mature miRNA probe sets, 1996 human snoRNA and scaRNA probe sets, and 2025 human pre-miRNA probe sets. Robust Multiarray Averaging (RMA) was performed and the miRNA microarray data was analyzed using Partek Genomic Suite 6.13 and one-way ANOVA statistical testing was performed to identify significantly differential expressed miRNA between different groups (P ≤ 0.05). The differential miRNAs identified were then analyzed with DIANA tools (mirPath) available at (http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php)[15］．mirPath旨在突出与已识别的miRNAs相关的通路。接下来，我们在mirPath中使用了一个叫做“路径交叉”的选项。该选项提供了所选mirna的靶向通路的交叉。结果子集只包含对所有所选miRNAs具有统计显著结果的路径。

这项研究得到了哈立德国王眼科专科医院机构审查委员会的批准，并遵循《赫尔辛基宣言》确立的原则。从所有研究参与者处获得书面知情同意，所有样本均为匿名，以保护患者机密。

结果

对PCG患者(患者组)和先天性白内障患者(对照组)的AH中2578个miRNAs的表达进行定量分析。两个研究组的人口学信息和临床资料汇总见表1。

图1所示。Wnt信号通路

表1。基于诊断的受试者的人口统计学和临床概况

变量	原发性先天性青光眼 (n = 6)	先天性白内障 (n = 6)	假定值__
在岁
中位数	3．5	5	-
25%的四分位数	2．0	3.75	-
范围	2 - 11	3 - 10	-
眼内压在毫米汞柱， 意思是(SD)	28.3 (11.6)	17.5 (2.1)	-
性别,没有。（％）
男性	4 (66.7)	6 (100)	-
女	2 (33.3)	0 (0)	0．45
不。占青光眼药物的百分比(%)
没有药物	0 (0)	6 (100)	-
1 - 2	4 (66.7)	0 (0)	0.0047
> 2	2 (33.7)	0 (0)	0.035
以前的手术
没有	1 (12.7)	0 (0)	-
是的	5 (83.3)	6 (100)	0.99

^__费雪精确概率检验

PCG组与对照组的miRNA谱比较显示有11个差异表达的miRNA(表2)[P≤0.05，采用单因素方差分析]。其中5个(45.5%)mirna表达上调，变化范围为+1.12 ~ 2.30,6个(54.5%)mirna表达下调，变化范围为(- 1.35 ~ - 2.26)。

表2。与对照组相比，原发性先天性青光眼患者房水mirna差异表达的倍增变化

DE microrna	褶皱变化 在PCG	假定值
hsa - mir - 4659 a - 5 - p	-1.35	0.010125
hsa - mir - 4445 - 3 - p	+ 2.20	0.020018
hsa - mir - 3201	+ 1.56	0.0403058
hsa - mir - 548 aa	-2.26	0.0214654
hsa - mir - 548 t - 3 - p	-2.26	0.0214654
hsa - mir - 3128	-1.88	0.0314196
hsa - mir - 4423 - 3 - p	-1.64	0.020099
hsa - mir - 606	-1.41	0.0342179
hsa - mir - 638	+ 2.30	0.0219638
hsa - mir - 548 - aj - 3 - p	+ 1.12	0.00974459
hsa - mir - 6777 - 5 - p	+ 1.28	0.0148227

粗体部分为参与Wnt信号通路的miRNA。

负(-)号表示下调，正(+)号表示上调。在PCG患者中，11个miRNAs中有5个上调，6个下调。

使用DIANA工具(mirPath)对与患者组(PCG)相关的11个差异表达miRNA进行分析，发现了63条与信号、代谢和癌症相关的通路(表3)。使用mirPath中的“通路交叉”工具进行进一步分析，发现了一条通路(Wnt signaling pathway)，涉及5个与5个基因相关的miRNA [hsa-miR-4659a-5p, hsa-miR-548aa, hsa-miR-548t-3p, hsa-miR-606和hsa-miR-548aj-3p:ROCK1(ENSG00000067900),SMAD2(ENSG00000175387),NFAT5(ENSG00000102908),PRKCB(ENSG00000166501)和TBL1XR1(ENSG00000177565)]。其中4个miRNAs下调，1个上调。由于缺乏足够的AH，这些miRNAs的差异表达无法通过二次实时定量PCR分析进行验证。无论如何，图1清楚地表明，这些差异表达的mirna显著影响Wnt信号通路。表4显示了它们在Wnt调制中的可能作用，然而，需要进一步的工作来理解这些链接在PCG背景下的表现和含义。

表3。路径识别

路径识别	# microrna
Ras信号通路	9
Glutamatergic突触	9
多巴胺能神经突触	9
安非他命上瘾	9
营的信号通路	9
及信号通路	8
调节干细胞多能性的信号通路	8
泛素介导的蛋白水解作用	8
粘着斑	8
长期势差	8
病毒致癌作用	8
内质网中的蛋白质加工	8
破骨细胞分化	8
PI3K-Akt信号通路	8
胆碱能突触	8
河马信号通路	7
蛋白聚糖在癌症	7
Adherens结	7
癌症中的转录失调	7
Wnt信号通路	7
催乳激素信号通路	7
鞘脂类信号通路	7
心肌细胞中的肾上腺素能信号	7
癌症中的胆碱代谢	7
Rap1信号通路	7
FoxO信号通路	7
雌激素信号通路	7
信使rna监测通路	7
催产素信号通路	7
MAPK信号通路	7
生成信号通路	7
鞘脂类代谢	7
胰岛素信号通路	7
HTLV-I感染	7
紧密连接	7
甲状腺激素的合成	7
细胞凋亡	7
心律失常性右心室心肌病	7
ErbB信号通路	6
结肠直肠癌	6
肾细胞癌	6
神经胶质瘤	6
慢性骨髓性白血病	6
胰腺癌	6
轴突的指导	6
前列腺癌	6
黑素瘤	6
非小细胞肺癌	6
长期的抑郁	6
甲状腺激素信号通路	6
乙型肝炎	6
肌萎缩侧索硬化症(ALS)	6
HIF-1信号通路	6
子宫内膜癌	5
T细胞受体信号通路	5
细胞周期	5
糖胺聚糖生物合成-硫酸软骨素/硫酸皮聚糖	5
急性髓系白血病	4
背腹轴形成	4
糖鞘脂生物合成-乳蛋白和新乳蛋白系列	4
甲状腺癌	4
黏蛋白型o聚糖生物合成	3.
生物素代谢	1

表4。与差异表达miRNAs相关的基因及其在Wnt信号调节中的作用

2021年版权燕麦。所有权利reserv

目标基因	Wnt信号调制中的作用
ROCK1	非典型wnt信号的下游中介，细胞骨架的主要调节因子，介导肌动蛋白聚合、细胞极性和迁移。
SMAD2	TGFβ信号通路的效应分子，参与典型的Wnt-TGFβ诱导的纤维化过程，包括肌成纤维细胞转化和细胞外基质分泌。
NFAT5	NFAT5是一种渗透应激反应因子，也是非典型wnt通路下游的转录因子，调节细胞命运和迁移。然而，NFAT也可以抑制规范的wnt信号。
PRKCB	Wnt通路调节剂，凋亡诱导剂。
TBL1XR1	调节Wnt-β连环蛋白介导的转录，作为辅抑制因子复合体的一部分。

在这个小样本中没有观察到人口统计学和临床信息和miRNA表达的特定模式。

讨论

本研究强调了与先天性白内障比较后，PCG患者AH中独特的miRNA差异谱。miRNA谱分析在AH中已有描述[8和从AH分离的外泌体中[9]在少数成年白内障患者中。在目前的研究中发现，某些miRNA包括miR-486-5p, miR-184, et-7a, miR-125-5p和miR-181a在成人白内障AH中普遍存在，外泌体中的miRNA [8］．除了miR-181a外，其他的mirna都在数量最多的50个mirna之列。然而，在本研究中未发现这些miRNAs在先天性青光眼AH和白内障患者AH之间存在差异表达。用于检测和分析的方法、研究人群的临床差异和其他未知变量可能是导致AH中miRNA谱变化的原因。另一个可能影响与AH miRNA相关的差异表达研究的因素是缺乏与无眼病个体的AH进行比较，因为从伦理上不可能从健康眼睛中获得样本。

田中及其同事[13]使用3D-Gene人类miRNA ver对10例成人青光眼、5例白内障和5例视网膜前膜患者的AH进行了差异miRNA谱分析。1.60个含有2019 mirna的芯片(东丽工业公司，东京，日本)。该研究发现了18个差异表达的miRNAs，这些miRNAs在对照组和青光眼组中都是常见的，其中8个表达上调，10个表达下调;3个miRNAs显著上调(约2倍)，仅针对青光眼患者(对照组无);8种miRNAs显著上调(范围为1.6-3倍)，仅在对照组中检测到(青光眼患者中没有)。然而，本研究中报道的差异表达miRNAs均未发现与我们研究中发现的11种差异表达miRNAs重叠。这些差异可能是由于技术和临床取样的可变性引起的。然而，值得注意的是，Tanaka等人研究的青光眼患者包括原发性开角型青光眼、原发性闭角型青光眼和假性脱落型青光眼，没有一例有PCG。这表明miRNA谱分析可能有助于青光眼类型的区分，如果其生物学意义被功能研究证实，本研究中发现的miRNA可能与先天性青光眼的发病机制高度相关。

与之前研究AH样本中差异miRNA谱的研究不同，我们尝试使用途径分析来观察miRNA谱。我们最初的分析已经确定了11个差异表达的mirna和63个不同的通路，主要与癌症、代谢和信号有关，与这11个mirna有关。63种可能涉及的不同生物途径的检测使得评估这些途径对PCG的重要性变得困难。然而，使用“通路交叉”工具进一步分析发现了“Wnt信号通路”[15］．Wnt信号最初被确认为其在致癌中的作用，但后来又被确认为其在胚胎发育中的功能[16］．

与经典和非经典Wnt通路相关的基因在人类小梁网(TM)细胞中表达，研究人员已经表明，所有三个Wnt信号通路在TM系统中都是有效的[17］．此外，在该模型中，使用灌注器官培养的眼睛的研究将Wnt信号通路与眼压升高联系起来。研究人员发现了分泌卷曲相关蛋白-1 (srfp -1)，一种Wnt信号的拮抗剂，在调节IOP方面的新作用，并证实了sFRP1在人青光眼TM细胞中的过表达，恢复TM中的Wnt信号可能是治疗青光眼的一种新的疾病干预策略[18］．此外，Wnt信号通路与细胞外基质(ECM)关系复杂。它与tgf - β通路相交，调节ECM基因在多种细胞类型中的表达，并在ECM组装中发挥作用[19］．开角青光眼研究的证据表明，TM中存在功能性的典型Wnt信号，Wnt拮抗剂与TM细胞硬度增加之间存在联系[20.］．因此，PCG中Wnt信号通路的失调可能导致TM中的ECM异常。需要进一步的体外研究以及PCG患者TM标本的分子研究来证实这一假设。Villareal及其同事证明了miR-29b在TM中调控ECM的形成中发挥作用，在体外条件下，上调miR-29b可能抑制ECM的形成[21］．在我们的研究中，PCG或对照组的AH中未检测到miR-29b。Wnt信号通路可能与先天性青光眼有关的其他潜在间接证据来自一个先天性青光眼的病例报告HBP1基因。的HBP1基因，一种参与Wnt信号通路的转录抑制因子[22];并在视网膜、角膜和睫状体中表达[genecards.org数据库]。

我们所有的PCG患者都有突变CYP1B1基因。然而,确切的机制CYP1B1突变对PCG发病机制的影响还不完全清楚。CYP1B1表达于角膜、睫状体、虹膜和视网膜。然而，在TM中未发现表达。与成人眼相比，胎儿眼中CYP1B1表达水平较高，提示其在眼组织成熟过程中发挥作用[23］．Wnt信号与CYP1B1之间没有明确的联系，尽管新出现的数据将Wnt信号与其他细胞类型的酶的细胞色素P450家族成员联系起来，包括CYP1B1通过转录因子Sp1激活Wnt信号[24］．然而，Wnt和CYP1B1在TM中的联系还不清楚。

在我们的研究中，与Wnt信号通路相关的5个miRNAs中的4个被下调。miRNAs和mRNA的上调和下调之间的相互作用是可变的。一般来说，上调的miRNAs可以在不降低靶mRNA表达水平的情况下通过干扰翻译使靶基因沉默，或者miRNAs确实可以诱导mRNA降解。此外，更多的证据表明，miRNA的表达降低了许多携带潜在miRNA靶点的转录本的丰度[25］．根据mirna表达的已知功能，有可能是由于PCG患者AH中mirna的下调导致TM中Wnt信号通路的干扰，导致IOP升高。

观察到miR-548基因家族中的3个miRNAs，包括miR-548aa、miR-548t-3p和miR-548aj-3p在PCG患者中显著升高;前两种miRNAs的水平增加了2倍多。miR-548aa和miR-548t-3p虽然分别位于不同的染色体上，但8和4具有相同的成熟序列和靶基因。miR-548由一个庞大的69个成员组成，保守性差的灵长类特异性miRNA基因家族位于除19和Y染色体外的几乎所有染色体上[26］．功能浓缩分析表明，该miRNA基因家族在多种生物过程和人类疾病中发挥重要作用，包括:调节肌动蛋白细胞骨架、Wnt信号通路、泛素介导的蛋白水解、tgf - β信号通路、各种癌症和阿尔茨海默病[26］．考虑到Wnt信号通路(如上所述)和tgf - β信号通路在青光眼发病中的具体作用[27]那么，miR-548aa和miR-548t-3p可能通过其中一种或多种途径在先天性青光眼中发挥作用。

其他需要特别提及的miRNA是miR-638，其在患者组中下降超过2倍。途径分析表明，该miRNA显著影响涉及单个细胞色素P450基因的药物代谢途径，CYP3A43．突变CYP1B1基因与PCG有关，PCG是沙特阿拉伯王国先天性青光眼的主要原因[3.］．然而，也不能排除其他细胞色素P450基因的作用[28］．最近的一项研究[22]报道了涉及一小簇细胞色素P450基因的7q22.1从头缺失，包括CYP3A4, CYP3A5，CYP3A7,CYP3A43在一个年轻的女性先天性青光眼患者突出其他的重要性CYP基因和miR-638在PCG中的作用。3A亚家族成员在人虹膜、睫状体和角膜中表达[29];有趣的是,CYP3A43已证明在人类角膜中有差异表达[30.)和镜头。miR-638的作用及其与细胞色素P50家族基因的相互作用有待进一步研究。

总之，该研究强调了先天性青光眼患者与对照组相比房水miRNA谱的变化，并提示了Wnt信号通路在PCG中可能的作用。需要进一步的功能研究来确定这些miRNAs的生物学意义，特别是miR-548aa、miR548t-3p和miR-638，以及它们在PCG发病机制中的作用。

致谢

作者感谢以下KKESH研究部门的工作人员，Rajiv Khandekar博士对患者临床数据进行统计分析，Gaddah Al Asali先生，协调患者招募的临床协调员和Maha Othman女士，技术研究助理，在研究期间所做的努力。Khaled Abu-Amero和Altaf Kondkar博士受到沙特国王大学医学院眼科青光眼研究主任的支持。

作者的贡献

研究理念与设计;B -收集和/或汇编数据;C -数据分析和解释;D——写文章;E -批判性修改文章;F -文章的最终批准。

伦理批准和同意参与

这项研究遵守了《赫尔辛基宣言》的原则，并获得了机构审查委员会和研究伦理委员会的批准。在纳入本研究之前，所有参与者都获得了书面的知情同意。

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