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摘要

I型糖尿病(T1D)患病率的增加也导致了糖尿病宏观和微血管并发症数量的增加，如冠心病、中风、视力损害、糖尿病肾病(DN)和终末期肾病(ESRD)。此外，糖尿病仍然是进展为终末期肾病的最常见原因。

本研究旨在探讨糖尿病肾病患儿缺氧障碍水平、细胞凋亡控制系统状况及维生素D3水平。

该研究涉及36名患有T1D和糖尿病肾病的儿童(年龄6至17岁)。采用酶联免疫吸附试验检测细胞缺氧标志物HIF-1alfa、凋亡因子caspase-3、维生素D3水平。

细胞缺氧和凋亡效应子caspase-3水平升高的分期依赖方式有文献记载。这两种标志物在DN患者中的检出率明显高于T1D患者。DN患者存在维生素D3缺乏症。

因此，儿童DN的发展与细胞缺氧的形成和凋亡的激活有关，是DN肾损害的基本机制之一。上述疾病均伴有维生素D3缺乏。

关键字

糖尿病，糖尿病肾病，细胞缺氧，凋亡，维生素D3

简介

I型糖尿病(T1D)是一种世界性的流行病，导致糖尿病肾病(DN)的增加。在过去的二十年中，DN发病机制中涉及的各种途径已经得到了显著的阐明。尽管如此，临床医生管理这种疾病患者的方式几乎没有改变。目前，DN的治疗主要集中在控制高血糖、高血压和抑制肾素-血管紧张素系统。糖尿病和DN的主要生化障碍是高血糖，引起激活一系列不同的细胞内酶反应、炎症、氧化应激的毒性作用[1,3]。

充分控制糖尿病患者的血糖是治疗的一个重要方面。血液中葡萄糖浓度过高，可与血红蛋白等蛋白质酶结合，引起糖基化。糖化血红蛋白的形成水平取决于环境中葡萄糖的浓度。高血糖的人会有更高水平的糖化血红蛋白。非酶糖基化是葡萄糖与蛋白质氨基自发相互作用的结果，导致高级糖基化(AGA)产物的形成[3,4]。

小管间质纤维化和小管萎缩似乎比肾小球病理更能预测肾脏疾病的进展。蛋白尿糖尿病患者肾组织显示71%的肾小球显示肾小球管连接异常，8-17%的肾小球为管状肾小球[5]。

糖尿病患者肾小管萎缩的机制尚不完全清楚。体外和体内研究表明，高葡萄糖(HG)浓度与活性氧(ROS)产生增加、炎症相关，后者抑制近端小管功能并诱导细胞凋亡。糖尿病小鼠和大鼠肾近端小管细胞(rptc)已发现凋亡[5,6]。此外，体外实验数据显示维生素D3在葡萄糖和白蛋白诱导的肾细胞凋亡中具有拯救作用。这些过程在患有T1D和DN的儿科患者中尚未得到充分研究。

材料与方法

对在乌克兰基辅第六儿童临床医院内分泌科住院的36名T1D儿童(6至17岁)进行了调查。所有患者均行常规检查(检查、血压监测、血检、尿沉研究、肾超声等)等综合检查。除常规方法外，还测定了HIF-1alfa、caspase-3、维生素D3的血浆水平。对照组包括16名健康儿童。

免疫印迹法研究细胞缺氧标志物HIF-1alfa和促凋亡因子caspase-3的水平。简单地说，在Laemmli样品缓冲液中溶解的蛋白质通过SDS-PAGE在聚丙烯酰胺凝胶中分解，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。然后膜被堵塞在5%的脱脂牛奶中Tris-Buffered盐水而且渐变20(TBS-T - 136 mM NaCl, 10 mM Tris, 0.05% Tween 20)，并使用caspase-3和HIF-1α Ab (Cell Signaling Technology, Danvers, MA USA)和actin小鼠单抗(BD, Lexington KY, USA)在室温下免疫印迹1小时。肌动蛋白小鼠单抗作为加载对照。化学发光底物ECL显示蛋白条带。用密度分析法定量蛋白质含量。使用酶联免疫吸附测定法和市售试剂盒(维生素D3(人)酶联免疫吸附测定试剂盒(BioVision, USA)研究维生素D3水平。

使用变异统计(STATISTICA 6.0)和非参数统计方法(Mann-Whitney检验)处理材料。采用Spearman相关系数来表示参数之间的关联。结果are presented as Mean ± SEM, was considered statistically significant level of P<0.05.

结果

根据一般临床资料，将所有患者进行分组(表1)。

参数	T1D，首次诊断	DN	控制
年龄	13±5 (11-16)	12±4 (12 - 16)	12±5 (11-17)
男孩/女孩	10/12	6/8	8/8
体重，kg	55±2 (49-60)	52±4 (28-61)	61±4 (35-71)
高,厘米	161±6 (157-171)	163±4 (155-174)	163±5 (159-171)
血清肌酐，mcmol/mL	41±4 (36-49)	59±5 (45-73)	40±4 (34-45)
蛋白尿,毫克/天	缺席	250±70 (170-330)	缺席
糖化血红蛋白，%	缺席	11±7 (9-14)	缺席
收缩压，mmHg	110±4 (100-120)	122±20 (115-140)	112±7 (100-118)
舒张压，mmHg	88±3(68-89)	100±12 (92-116)	88±3 (68-87)

表1．患者临床特点

与对照组相比，我们检测到所有T1D和DN患者血清中细胞缺氧标志物(HIF-1 α)水平升高。T1D组HIF-1α水平高于对照组18.5±1.76% (p<0.01)， DN组HIF-1α水平高于对照组30.03±3.75% (р<0.01)(图1)。

图1所示。A) Western Blot显示HIF-1α在T1D和DN患儿中的表达。B) HIF-1α的密度定量。对照组的条带密度设置为100%。直方图显示平均值±SEM。*р< 0.05。

Westudiedthelevelsofapoptoticeffector caspase-3。所有患者均有caspase-3水平升高的记录。DN患者caspase-3表达高于对照组34.19±4.36% (р<0.001)。该markerint1d组的水平高于对照组14.82±2.35% (р<0.01)。对照组标记假设为100%(图2)。

数字2．A) Western Blot显示T1D和DN患儿caspase-3表达。B) caspase-3的密度定量。对照组的条带密度设置为100%。直方图显示平均值±SEM。*р< 0.01,* *р< 0.001。

维生素D3正常水平、不足和缺乏分别定义为-≥30 ng/mL、21-29 ng/mL和≤20 ng/mL。内源性维生素D3水平随季节而变化。所有患者都是在9月至2月期间被招募到这项研究的。

我们发现，糖尿病肾病患者组中维生素D3缺乏最为突出。对照组T1D - 32.37±5.1 ng/mL、糖尿病肾病- 19.39±1.76 ng/mL患者维生素D3检测水平为35.68±1.56 ng/mL(与对照组相比<0.01)(图3A)。对维生素ind3水平与疾病病程的分析发现两者呈负相关(R=-0.79， р<0.001)(图3B)。

数字3.A)显示T1D和DN患者血浆维生素D3水平的直方图。结果以均数±SEM表示。* *р< 0.01。B)维生素D3水平与糖尿病肾病病程的相关性(R=-0.79， р<0.001)。

在糖尿病肾病患者中，维生素D3水平与蛋白尿水平的相关性分析显示为负相关(R=-0.59， р<0.001)(图4)。

数字4．糖尿病肾病患者维生素D3水平与蛋白尿的相关性(R=-0.59， р<0.001)。

讨论

糖尿病肾病的特点是蛋白尿和进行性肾功能丧失，导致终末期肾脏疾病，需要肾脏替代治疗。糖尿病肾病的病理底物是肾实质细胞的进行性损失和细胞外基质的积累。最近，炎症也有助于糖尿病肾病[7]已变得清楚。

不平衡凋亡细胞死亡导致肾细胞丢失，在实验性糖尿病肾病[8]的足细胞、小管细胞和内皮细胞中观察到。在发达国家，糖尿病肾病是终末期肾病最常见的病因。只有全面了解肾损伤起始和进展的分子基础，才能合理设计新的、成功的治疗策略。

小管间质慢性缺氧已被认为是许多肾脏疾病常见的一种进展机制。慢性高血糖的表现——红细胞异常、氧化应激、由自主神经病变引起的肾交感神经去支配和糖尿病诱导的肾小管凋亡，加重了早期糖尿病肾病的低氧环境;因此，糖尿病小管间质缺氧可能是一个重要的早期事件[7-9]。

本研究显示，新诊断的T1D患者细胞缺氧水平增加，DN患者细胞缺氧水平显著增加。同时，慢性缺氧是凋亡因子激活和细胞死亡的重要诱导因子，特别是肾元管状段[10]的凋亡。我们推测这两种情况之间存在联系——细胞缺氧和凋亡，而在T1D患者和DN患者中都有高水平的凋亡效应子caspase-3激活。

肾脏在维生素D3的代谢和循环水平的调节中起着核心作用。除了在钙和磷酸盐稳态中的作用外，维生素D还是细胞增殖、炎症、分化和免疫的重要调节剂。维生素D3通过抑制纤维化、炎症和细胞凋亡来减轻肾损伤，通过抑制已知在肾损伤中起作用的多种途径，包括肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)、核因子-κB (NF-κB)[11,12]、转化生长因子-β (TGF-β)/Smad[12-15]。

也有报道称，在庆大霉素诱导的肾损伤[16]中，细胞凋亡标志物Bax/Bcl-2比值的增加和caspase-3的裂解形式被paricalcitol治疗逆转。在这里，我们发现糖尿病肾病患者caspase-3活性增加。此外，D。_3.通过激活磷脂酰肌醇3-激酶/ akt信号通路[17]防止嘌呤霉素氨基核苷诱导的肾小球足细胞凋亡。此外，最近的临床研究表明，维生素D3缺乏与T2DM[18]女性患者DN增加独立相关。相比之下，维生素D联合血管紧张素II 1型受体阻滞剂对大鼠DN的治疗具有协同作用，不仅通过抑制肾素，而且通过减少氧化应激和增加肾脏抗氧化能力[19]。综上所述，这些数据评估了维生素D3在DN中观察到的肾损害中的具体重要性。

在这项研究中，我们发现糖尿病肾病儿童缺乏维生素D3，凋亡效应子caspase-3激活，细胞高度缺氧。我们推测维生素D3水平与蛋白尿呈负相关，这可能是维生素D3对糖尿病肾病患儿肾小球屏障具有保护作用的证据，这可能是由于维生素D3可能具有抗凋亡和抗炎活性。进一步研究维生素D3在DN儿童中可能的肾保护作用及其机制，可能有助于预防和治疗DN。

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