摘要
目的:本研究旨在建立一种简单、快速检测间变淋巴瘤激酶(alk.)肺癌组织中的融合基因,这在肺癌的治疗决策中是重要的。
材料和方法:开发了一种方便的基于PCR的系统来检测alk.从固定肺组织提取的RNA中提取融合基因。该方法使用荧光标记的DNA探针“猝灭探针”(Q-Probe),在杂交后进行荧光猝灭,从而检测RT-PCR产物中的重排基因转录本。
结果和结论:17alk.(+)和18alk.( - )测定的手术样品,结果为15alk.(+)和15alk.(-)检测到内部对照物的样品与荧光样品相同原位杂交(鱼类),免疫组织化学(IHC)和/或RT-PCR。因此,该系统迅速(2小时内)并敏感地检测alk.融合。这种快速检测系统可能有助于肺癌的个体化治疗。
关键词
遗传诊断,ALK重排基因,非小细胞肺癌,淬火探针方法,I-DENSY
介绍
肺癌是全世界最常见的癌症死亡原因。组织学上,85%的肺癌属于非小细胞肺癌(NSCLC)。迄今为止,肺腺癌中报道的主要驱动突变包括表皮生长因子受体(表皮生长因子受体)突变(〜23%),克拉斯突变(~25%),间变性淋巴瘤激酶(alk.)重排(~6%)BRAF突变(〜3%)和这些突变是互斥的。
棘皮类微管相关蛋白4 (EML4),alk.重排基因(EML4-ALK.)首先于2007年报告[1]。分子靶向药物如屈服inib in非常有效碱-重排阳性肺癌治疗[2]。
到目前为止,已有10余种模式的熔点EML4-ALK.[3-9]和其他重排的报道[10-12](图1A)。有几种方法被用于诊断alk.重排以选择将受益的患者alk.临床应用中的抑制剂。这些测试,荧光原位杂交(鱼类)基于临床试验和免疫组织化学(IHC),RT-PCR已被广泛采用。
图1.频率NSCLC司机突变和alk.NSCLC中的变体
(一)的分布alk.重排变体。在这些变异中,V1、V2和V3a/b是主要变异。
(B)的百分比alk.变种可以用我们开发的检测混合物检测出来。有可能探测到接近80%的alk.使用检测混合物的重排基因1.该系统设计成使得可以一起使用多种检测混合物,导致检测超过90%alk.重排基因变异。自alk.重新排列基因变体已经在快速连续中发现,有一些变体是不可能用电流系统检测的变体。这种变型被描绘为饼图中的“其他”。
已有几篇报道指出,FISH、IHC和RT-PCR在检测方面缺乏一致性alk.融合基因[13-16]。鱼和IHC具有检测未知重排的优点,以及诊断结果可能因分析师偏差而有所不同的缺点。RT-PCR具有高敏感性和特异性,不含分析师偏见。然而,它无法检测到未知重排,并且需要复杂的多重PCR或多次PCR反应。
在这里,我们开发了一个可以轻松测量超过15的系统alk.在约2小时内使用纯化的RNA在约2小时内使用无复杂的制剂。该系统自动分配试剂,进行逆转录和PCR反应,并使用荧光检测靶标。所有操作员都需要进行机器并添加试剂和样品。
材料和方法
患者样品和样品处理的集合
35份手术标本来源的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织标本;17alk.国家癌症中心医院(日本东京,日本)作为联合研究项目的一部分,提供重新排列基因阳性样品(标记为阳性1至阳性-17)和18个阴性样品(标记为阴性-1至负-18)(CH25028)。书面知情同意书获取了所有参与者,以利用其样本。在他们向我们提供之前临床诊断并储存在国家癌症中心Biobank。制备了一块10μm厚的FFPE组织以提取总RNA。根据指示,使用RNEasy FFPE套件(Qiagen Inc.,Hilden,德国)获得总RNA样品。用30μl无RNA酶水萃取总RNA。将标本储存在-80℃直至测量。
使用I-密度和Q探针检测和分析ALK融合基因
使用i-densy (Arkray, Inc.,京都,日本),一个全自动遗传分析系统和荧光标记淬灭探针(Q-Probe,新日铁Kankyo Engineering Co., Ltd.,东京,日本)的简单遗传分析已经被报道[17]。i-密系统的每个通道可以检测3种不同的波长。用于标记Q-Probe的荧光色素为PACIFIC BLUE、BODIPY FL和TAMRA。混合alk.融合基因特异性Q-探针,用于扩增每种特定序列和逆转录酶(Superstmichiii; Invitrogen,Carlsbad,Ca,USA)的引物被置于含有DNA的I-Densy Pack Universal(Arkray,Inc.)的井中聚合酶链反应所需的聚合酶,核苷酸和其他试剂。使用超过2ng的RNA /试验将纯化的RNA样品加入到反应管中。逆转录在55℃下进行15分钟。循环条件如下,将反应在95℃下孵育2分钟,然后在95℃下在58℃下为50个循环,在58℃下30秒。PCR后,产品的熔化曲线如下获取;在95℃下,在40℃下1分钟,1°C,每步的每步,每步3秒的步长,从40℃达到75℃。将I-Densy Pack Universal和反应管设定为I-密度机用于测量,约2小时后,存在或不存在alk.可以确定融合基因。十七种alk.以及内部控制,tata结合蛋白(TBP.),可以在本系统中使用四种类型的检测混合物进行特异性检测。设置检测混合物1使所有高频突变(如V1, V2, V3a/b)能够测量。表1显示了alk.使用每个检测混合物可检测的融合基因(表1)。检测混合物1含有8个引物和3 Q探针,混合物2含有6个引物和2 Q探针,混合物3含有5个引物,2 Q探针,混合物4含有6个引物和1 Q探针。反向引物用于逆转录和靶扩增。引物和探针的序列信息在表S1中提供。
表格1。使用每个检测混合物和荧光颜料标记探针可检测到ALK融合基因的变体。使用4种不同的检测混合物使得可以检测超过15种ALK基因融合的变体。
检测 混合物1 |
Bodipy fl.:EML4-ALK.V1(E13; A20),V2(E20; A20),V3A / B(E6A / B; A20) |
|
Tamra.:EML4-ALK.V6(E13; INS69 A20) |
|
太平洋蓝:内部控制(塔塔结合蛋白,TBP.) |
|
检测 混合物2 |
Bodipy fl.:EML4-ALK.V4 (E15;A20) |
|
Tamra.:EML4-ALK.V8A(E17; INS 30 A20),V8B(E17; INS 95 A20) |
|
检测 混合物3. |
Bodipy fl.: EML4-ALK.V5A(E2; A20),V5B(E2; INS 17 A20),V7(E14; DEL 12 A20),V5'(E18; A20) |
|
|
检测 混合物4. |
Bodipy fl.: |
|
KIF5B-ALK(K15; A20),(K17; A20),(K15; A20), |
|
TFG-ALK.(T3;A20), KLC1-ALK (K9;A20) |
|
使用区域分析软件,MEQNET IDIA(ARKRACE,INC.)进行分析测量结果,该区域对内部控制设定了区域值阈值和alk.对每个检测试剂的重新排列基因测量(表2,排顶部)。对于内部标准测量,使用区域阈值来确定反应是否正常工作。为了alk.重排基因测量,区域值阈值用于判断存在(正值;计算alk.重新排列基因峰面积大于面值阈值)或不存在(负值;峰面积小于该区域值阈值的峰面积)。
表2。区域值分析混合物和荧光颜料标记探针概述
|
检测混合1 |
检测混合2 |
检测混合3 |
检测混合4 |
|
太平洋蓝 |
Bodipy fl. |
Tamra. |
Bodipy fl. |
Tamra. |
Bodipy fl. |
Bodipy fl. |
|
内部控制 |
V1 V2或V3 a/b |
V6 |
V4 |
V8 A / B. |
V5a/b, V5'或V7 |
KIF5B,TFG或KLC1-ALK |
面积阈值 |
16.5 |
14.4 |
13.8 |
42.0 |
10.5 |
36.7 |
19.4 |
- 1 |
10.4 |
3.4 |
9.3 |
7.0 |
4.2 |
0.1 |
4.9 |
- 2 |
21.7 |
8.2 |
3.0 |
4.7 |
5.0 |
1.4 |
2.5 |
- 3 |
22.0 |
11.0. |
7.3 |
17.4 |
0.3 |
0.0 |
15.1 |
- 4 |
3.6 |
2.0 |
2.7 |
3.6 |
0.0 |
1.5 |
10.3 |
- 5 |
45.0 |
1.8 |
4.6 |
26.8 |
2.3 |
0.0 |
14.3 |
- 6 |
8.4 |
0.0 |
6.0 |
7.0 |
3.9 |
1.2 |
1.8 |
- 7 |
70.2 |
2.4 |
11.4 |
9.8 |
0.0 |
1.0 |
0.5 |
负8. |
51.0 |
0.0 |
2.0 |
23.3. |
0.8 |
5.0 |
1.0 |
负-9. |
23.0 |
0.0 |
2.0 |
2.6 |
8.6 |
6.8 |
3.2 |
负10. |
55.0 |
0.0 |
2.0 |
11.7 |
5.5 |
2.2 |
11.5 |
负-11 |
46.0 |
0.8 |
1.5 |
11.5 |
1.3 |
1.0 |
3.0 |
负极12. |
22.0 |
3.2 |
2.9 |
24.5 |
1.0 |
9.0 |
9.2 |
负-13. |
43.5 |
0.3 |
1.3 |
5.3 |
2.4 |
2.2 |
1.7 |
负-14. |
34.0 |
0.6 |
1.0 |
15.7 |
1.1 |
0.4 |
5.6 |
否定15. |
72.0 |
0.1 |
2.4 |
10.8 |
2.6 |
0.0 |
1.8 |
负-16. |
57.0 |
1.2 |
5.4 |
0.3 |
2.9 |
13.9 |
9.1 |
负-17 |
53.5 |
5.0 |
10.8 |
0.8 |
1.8 |
1.4 |
8.4 |
负-18 |
61.0 |
12.1 |
2.2 |
0.7 |
2.4 |
4.3 |
1.9 |
+ 1 |
31.0 |
276.2 |
0.8 |
8.9 |
0.4 |
0.0 |
0.0 |
+ 2 |
28.0 |
177.0 |
1.8 |
15.2 |
4.6 |
0.4 |
1.1 |
+ 3 |
20.5 |
78.2 |
5.0 |
3.4 |
2.6 |
0.0 |
4.6 |
正4 |
18.5 |
255.2 |
7.2 |
7.3 |
0.4 |
1.2 |
0.0 |
正五 |
20.5 |
133.5 |
5.2 |
8.9 |
2.2 |
2.7 |
0.0 |
+ 6 |
39.0 |
171.0 |
6.4 |
14.6 |
0.0 |
0.0 |
1.9 |
+ 7 |
3.0 |
2.5 |
0.0 |
7.9 |
3.3 |
5.6 |
7.0 |
正8 |
40.5 |
311.0 |
4.4 |
8.9 |
1.1 |
0.2 |
1.7 |
+ 9 |
45.0 |
0.0 |
11.2 |
14.0 |
0.4 |
659.6. |
2.3 |
积极10. |
22.0 |
455.0 |
3.0 |
5.4 |
1.0 |
1.3 |
2.6 |
积极11. |
23.0 |
45.5 |
1.0 |
6.2 |
4.2 |
3.4 |
9.0 |
积极的12. |
15.0 |
33.2 |
6.0 |
37.3 |
3.5 |
2.0 |
5.0 |
积极13. |
38.0 |
12.8 |
0.6 |
3.8 |
4.5 |
0.9 |
3.7 |
积极的14. |
60.0 |
375.0 |
6.7 |
11.8 |
3.9 |
4.3 |
6.7 |
积极的15. |
49.0 |
424.0 |
0.2 |
15.8 |
1.1 |
1.4 |
0.3 |
积极的16. |
26.5 |
2.2 |
7.6 |
5.2 |
2.0 |
328.8 |
0.0 |
积极的17. |
81.5 |
76.5 |
5.5 |
0.3 |
0.0 |
0.0 |
0.7 |
- 使用MEQNET IDIA软件分析所获得的测量数据,为每种试剂提供单独的区域值。
- 在最上面的行中写入的值被设置为阈值。大于该值的区域值被认为是正面的,并以粗体文本表示。
- 如果内部控制面积值小于阈值,则反应被视为“不可评估”。
ncounter分析
用于nCounter分析,使用RNeasy FFPE试剂盒(Qiagen)从FFPE组织切片(5µm厚)中提取RNA。使用Nanodrop 8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)对RNA进行定量。nCounter系统是一个基于多重荧光的平台,用于计数特定的mRNA分子,而不需要PCR扩增[18],用于检测alk.重新排列样品,样品ID为Positive-13。捕获并报告与alk.-重排mRNA序列,以及野生型5 '和3 '部分的定量alk.MRNA定制如表S2所示,并由纳米复合技术(西雅图,WA,USA)合成。根据制造商的议定书进行NCounter测定。简而言之,在67℃下将100ng的总RNA与Ncounter探针组杂交16小时。样品,由样本ID组成。使用自动化的NCounter样品制备站(纳米斯特林Technologies,Inc。)加工阳性13和11其他肺癌RNA样品。随后在NCounter数字分析仪(Nanostring Technologies,Inc.)上设置了固定化和对齐的报告复合物的盒式粘结剂在555个视野下成像。使用纳米杆的NSOLVER分析软件2.0版收集和标准化报告计数。
数据通过两步归一化。首先,使用6个阳性内部对照来消除单个杂交实验之间潜在的系统差异。强度总和(年代我)对6个阳性对照探针进行样本计算我然后被归一化因子S缩放意思/ s.我.第二,样本的缩放强度我使用四个管家基因进一步标准化,以消除任何可能归因于差异的影响,例如,输入RNA的数量。如果H我基因是否为样本我,则定义第二个归一化因子为H意思/H一世..存在alk.融合的判断基于alk.5'/ 3'分子比和融合-mRNA检测。如果5'/ 3'表达率小于0.1或者至少一个融合探针的计数大于100,则判断为阳性。
结果
通过Q探针方法检测ALK重排
alk.从FFPE手术切除的样本中提取总RNA的35个样本,使用i- density系统测量重排基因变异,使用检测混合物1到4(表1)。由于我们开发的试剂是基于RT-PCR的,我们的系统可以检测高频变异,如EML4-ALK.variant1, variant2和variant3a/b只使用检测mix1(图1B)。
图2。的检测示例塔塔结合蛋白使用作为内部控制RNA质量和alk.重新排列
(a)塔塔结合蛋白(TBP.使用检测混合物1检测为内部控制1.所示的结果以波长1(太平洋蓝色)示出。
左:内部检测的示例TBP.控制在测量中alk.负-18。峰顶的顶部可见在59-61°C之间。该图显示59°C的峰顶。计算的区域值为61.0,超过阈值16.5。
右:内部阴性检测的例子TBP.控制在测量中alk.- 4。未见明显峰,计算面积值为3.6,低于阈值16.5。
(b)分析样品阳性-1(左)和正 - 16(右)。alk.对两个样品获得重排正峰。所有样品的测量结果都显示在补充图1中。
一般情况下,从FFPE组织中提取的RNA由于福尔马林固定[19]而片段化,为了检查提取的RNA的降解水平,采用引物和探针进行检测TBP.作为内部对照将被添加到检测混合物1。当AN.alk.重排基因未检测到,检测不到TBP.可以用作是否的指示alk.标本重排基因状态是否真的为阴性,或者是否由于RNA质量差而根本无法检测到突变。正面和负面的例子TBP.检测如图2A所示。确定样品是否为阴性或阳性的内控和alk.重排,我们使用面积值阈值,这是根据阴性控制测量值设置的。对于内部控制,面积阈值设为16.5。图2A左边的图表显示内部控制的面积值为61.0,因此被判定为“阳性”(意味着测量系统在工作)。如果内部控制的面积值小于阈值,则视为“不可评价”,如图2A右侧所示,图中面积值为3.6,说明该样本“不可评价”。每个样本面积值的测量结果汇总见表2。18个阴性样本中没有一个显示出alk.用i- density检测重排基因(用i- density检测阴性-1到阴性-18样本的测量结果如图S1A所示),说明没有假阳性结果(表2)。TBP.在这些18个样品中3中使用的用作内部控制的阴性是阴性的,表明这3个样品的RNA可能高度降解。
当i-decsy用于测量样本时alk.重排基因阳性,17个样品中的15个为内部对照阳性,并且这15个样品中的14个是alk.重排正面。这些结果与使用参考方法获得的结果相同。表2总结了使用检测混合物1,2,3和4计算的区域值,其用于判断样品是否为负或阳性alk.重新排列(使用i-Decsy的样品对阳性-1的测量结果的图表,如图S1b所示)。
两种的I-Densy结果alk.重排基因阳性样品如图2 (B)所示。测量左侧的positive -1样品时,使用检测混合物1在56℃下检测BODIPY FL标记的Q-probe的峰值,面积值为276.2。这个结果证明了阳性-1样本具有V1, V2或V3 a/balk.重新排列。还发现该样品具有V1alk.通过参考FISH和RT-PCR分析(数据未显示),Q-Probe方法与参考方法完全一致。又如图2B中右侧的样品Positive-16,使用检测混合物3时,用BODIPY FL标记的q探针在56℃下检测到峰值,面积值为328.8,说明Positive-16样品具有alk.重新排列变型5a / b,变型7或变型5'。令人惊讶的是,阳性16样品在大约13年前的福尔马林固定和石蜡嵌入式,表明我们的系统可能会发现alk.从这种旧样品中重排基因。表3显示了I-DENSY结果与参考结果(表3A)以及所有的所有结果的整体交易alk.在检测内部控制方面,分别重排 - 阴性和正样品(表3B和3C),alk.-重排状态与参考分析的一致性,以及固定后的时间。
表3。测量结果alk.使用Q探针方法重新排列状态。alk.重排阴性和阳性样品根据以前的FISH和/或RT-PCR分析进行确定。(B)和(C)中“不可评价”的结果是未检测到内部控制的样品结果。
|
检测到内部控制 |
和谐与参考 内部控制(+) |
alk.负 |
15/18 |
15/15 |
(n = 18) |
(可检测83.3%) |
(100%的一致性) |
alk.积极的 |
15/17 |
14/15 |
(n = 17) |
(检测到88.2%) |
(93.3%的一致性) |
全部的 |
30/35 (检测到85.7%) |
29/30 (96.6%的一致性) |
(a)一致的率alk.(-/+)样品用Q-Probe方法分析,结果参照参考方法。15个阴性样品,在内部控制可以检测没有显示峰alk.重新排列基因,这意味着没有假阳性结果。什么时候alk.测量重排基因阳性样品,17个中的15个为内部对照,其中14个出现相同alk.重排结果与参考方法所得结果一致。
(b)对...的结果分析alk.重新排列负样品。
样本 |
内部 控制 |
alk.融合基因 |
时间固定 (年) |
- 1 |
- |
不可评估 |
8 |
- 2 |
+ |
负 |
7 |
- 3 |
+ |
不可评估 |
8 |
- 4 |
- |
不可评估 |
8 |
- 5 |
+ |
负 |
12. |
- 6 |
- |
不可评估 |
8 |
- 7 |
+ |
负 |
6 |
负8. |
+ |
负 |
12. |
负-9. |
+ |
负 |
15. |
负10. |
+ |
负 |
7 |
负-11 |
+ |
负 |
6 |
负极12. |
+ |
负 |
12. |
负-13. |
+ |
负 |
7 |
负-14. |
+ |
负 |
8 |
否定15. |
+ |
负 |
8 |
负-16. |
+ |
负 |
6 |
负-17 |
+ |
负 |
10. |
负-18 |
+ |
负 |
7 |
(C)的i-密度分析结果alk.重排正样品。alk.虽然检测到内控,测量系统正常工作,但在Positive-13样品中未检测到重排。
样本 |
内部 控制 |
alk.融合基因 |
时间固定 (年) |
+ 1 |
+ |
积极的 |
6 |
+ 2 |
+ |
积极的 |
7 |
+ 3 |
+ |
积极的 |
12. |
正4 |
+ |
积极的 |
11. |
正五 |
+ |
积极的 |
10. |
+ 6 |
+ |
积极的 |
8 |
+ 7 |
- |
不可评估 |
8 |
正8 |
+ |
积极的 |
11. |
+ 9 |
+ |
积极的 |
8 |
积极10. |
+ |
积极的 |
10. |
积极11. |
+ |
积极的 |
12. |
积极的12. |
- |
不可评估 |
11. |
积极13. |
+ |
负 |
6 |
积极的14. |
+ |
积极的 |
5 |
积极的15. |
+ |
积极的 |
2 |
积极的16. |
+ |
积极的 |
13. |
积极的17. |
+ |
积极的 |
11. |
17中的两个alk.重排阳性样本判定为“不可评价”,其余15个样本中有14个与Q-Probe和参比方法的结果一致。
为了总结测量的结果,在总共35个样品中,测量系统被证明对30个样品有效。所测样品与对照分析的符合率为96.6%。敏感性和特异性分别为93.3%和100.0%(表3A)。只有在样品编号为。“阳性13”是不可能检测到的alk.使用Q探针方法重新排列。
用nCounter系统重新测量不匹配样品
因此,我们试图使用NCounter系统分析样品编号“正13”。检查存在的情况alk.使用ncounter重新排列在此样品中,alk.通过计算已知检测重排EML4-alk.,KIF5B-碱性,和过渡政府-alk.通过5′和3′不平衡的测定alk.mRNA分子。5'/ 3'表达比alk.mRNA为0.01,而显着的众所周知alk.-Rearrandement变体MRNA未检测到。因此,认为这个样本有alk.重新排列,其中alk.重排伙伴不是EML4,KIF5B, 要么过渡政府基因。
Q-Probe方法预测alk.基于荧光峰的存在或不存在已经报道的基因重排。即使金额TBP.RNA是不够的或者如果RNA被高度降解,只要有足够的量alk.呈现重排基因RNA,可以通过该方法检测。
讨论
这alk.使用Q探针方法的重排基因测量系统产生高度一致的结果,其与所使用的参考方法高度一致,不显示误报。该系统提供了一种简单快捷的系统,用于检测alk.重组基因需要最少的技术实验和少量的样本。如果alk.可以容易且快速地检测重排基因表皮生长因子受体突变(例如L858R,EXON19缺失突变),这些发现可以显着促进治疗方案的快速测定。
alk.No. 1病例未发现重排即使内部控制是通过Q-probe方法检测到的,也是“阳性-13”。虽然alk.通过NCounter分析在该样品中检测到重新排列,这种分析无法识别伴侣alk..无法检测到alk.合伙人可能是因为alk.变体是Q探针方法的4个检测混合物中的任何一个不能检测的变体,或者通过NCounter方法。迄今为止,Eml4, kif5b, tfg, klc1、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体3型(PTPN3.)[20]和亨廷顿相互作用蛋白1(HIP1)[21]已被报道为alk.重新安排合作伙伴。无法检测到ALK-PTPN3.要么HIP1-ALK.使用目前设计的检测混合物1到4或nCounter试剂。也不可能探测到其他未知alk.通过使用Q-探针方法重新排列合作伙伴和点。
近年来,利用下一代测序仪技术进行高通量测序已被广泛应用于分析变异基因序列的研究。但是,由于后一步骤需要大量的时间和精力,这种方法仍然不适合在临床设置中使用。
相比之下,i-密度法操作简单,是一种快速、简单的分析方法。我们的系统可能被用来确认诊断,而不是作为一种检测alk.在临床环境中的重新安排。此外,如果一部小说的顺序alk.已知重新排列,可以通过向I-Decsy系统添加特定的引物和探针来检测这种重排以进行检测。
变异的alk.基因重排的发现速度很快,因此必须改进检测技术,以适当地治疗每个病人。众所周知alk.重排基因阳性患者对克唑替尼治疗反应良好。然而,二次alk.导致克唑替尼耐药的突变,例如alk.L1196M [22],V1180T和I1171T [23]近年来报道。已经发现这些突变在接受屈曲治疗的NSCLC患者中。新的alk.抑制剂如ceritinib[24]和alectinib[25,26]已经被开发用于克唑替尼耐药突变患者。由于肺癌的治疗方法归因于alk.重排基因正在迅速推进,因此诊断系统需要更可靠地检测突变。可以具体检测突变的Q探针方法还可以检测如上所述的点突变[17]。这些是我们认为使用我们刚提出的Q-Probe方法的系统可以有助于迅速推进个性化医学。
确认
我们感谢Moeko ohishi进行技术咨询。
金融与竞争国际EST披露
Marifu Yamagishi和Mitsuharu Hirai是Arkray,Inc。的员工,该作者没有其他相关的联系或财务冲突或财务冲突与手稿中讨论的主题或物资与披露的人。
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