Geiselgasteig救护车，Grünwald，德国慕尼黑
德国科布伦茨大学医学工程与信息处理研究所
德国埃尔兰根大学医院输血和血液科
德国科布伦茨大学医学工程与信息处理研究所
德国科布伦茨应用科学大学多模态成像物理组
DOI: 10.15761 / FGNAMB.1000106
血小板是高度敏感的循环亚细胞传感器，对多种刺激作出反应，使其静止盘状变成更圆的结构，处理水泡和假足。血小板轮廓可以从数字图像中自动分割，并显示出分形行为。由于血小板形状变化对分析前影响因素的敏感性，高度标准化的检查程序是必要的
以获得可靠和可重复的结果。在当前的工作中，描述了一个完全标准化的分析程序，包括标准化的样品制备，机器人图像采集和算法图像分析，并使用不同大小的校准对象进行验证。系统允许用户独立
从未固定和未染色的可溶性物体样本中检验分形和欧几里得几何性质。
研究结果表明，该系统具有较大的载玻片内和载玻片间的再现性，并且能够清晰地识别和分离较小和较大的颗粒以及聚集物和不聚焦的物体。由于该系统非常适合于高通量的玻片检查，它将能够并加快对更大队列患者的血小板形状特征的检查。因此，它可能提供了一个理想的基础
检查可能的分析前约束，因此有助于提高我们对血小板形状变化的生理和病理生理意义的认识。
形状变化，几何，分形分析，定量，机器人显微镜，形态测量;标准化
血小板是敏感的循环亚细胞传感器，对多种刺激作出反应，使其静止盘状变成更圆的结构，处理水泡和假足。血小板结构的这些形态变化通常被称为血小板形状变化(PSC)反应。PSC被认为对分析前因素高度敏感，如温度[1]、抗凝血剂[2]、钙浓度[3,4]、葡萄糖浓度[5]、振动[6]、固定[7]和与玻璃接触[8-11]。
通过对血小板轮廓(PO)[12]应用不同的几何描述符，可以定量地描述PSC。研究发现，通过高分辨率暗场显微镜[12]和电子显微镜[13-16]成像的血小板PO显示分形行为，因此可以使用分形几何语言进行描述。分形几何在生命科学中引起了越来越多的兴趣，因为它可以对复杂和不规则的形式进行简单的数值描述[18-25]。
为了获得无偏见的PSC信息，需要一个高度标准化的分析程序。我们小组(Grünwald Remagen开源统一血小板识别跟踪器:group - it)[26]已经对采集的图像数据进行了标准化分析。该工具包包括在数字暗场显微图像上自动检测血小板样结构，并分析其分形和欧氏几何性质。
由于我们的目标是建立一个完全标准化的分析程序来检查血小板的形状及其变化，因此我们开发了一个标准化的制备程序以及一个简单而健壮的显微镜机器人，以实现可重复的显微镜检查和图像采集。目前的研究描述了由样品制备、图像采集和使用校准珠进行图像分析组成的完整系统的评估。
将不同直径(0.1 μm, 0.3 μm, 1.1 μm和3.0 μm)的聚苯乙烯乳胶珠(Sigma Aldrich, Germany)稀释为1:100 inaqua桌子．(ampwa®，Fresenius Kabi，德国)。从1:100的稀释液中再稀释100 μl，形成不同尺寸珠子的原液。另外，从每种稀释液中取25 μl的等分加入1000 μl的aqua服务台。得到混合珠子的原液。
用防水笔(Staedtler permanent Lumocolor，蓝色，Staedtler Mars GmbH & Co Kg，纽伦堡，德国)在高精度盖玻片(精密盖玻片编号1.5 H, 22x22 mm, 170±5 μm厚度，Paul Marienfeld GmbH & Co. Kg, Lauda-Königshofen，德国)上画点标记，并从每个盖玻片上滴10 μl原液(0.1 μm-， 0.3 μm-， 1.1 μm-， 3.0 μm-和混合珠液)。预清洗的显微镜载玻片(苏打石灰玻璃3。水解级，76 × 26毫米，厚度约为1毫米，Paul Marienfeld GmbH & Co. Kg, Lauda-Königshofen, Germany)，使用自制的45°楔形和标准的20 × 3毫米张力弹簧，以恒定的速度和压力下放到盖滑板上。在溶液完全溢出整个封面后，将玻片翻转，并立即密封。
共制备了13张载玻片，每一种原液各载玻片，3.0 μm和混合珠液各加4张载玻片。
标准实验室显微镜的工作台(Leitz Laborlux，暗场照明，物镜100,1.32-0.6油)配备了3个步进电机，连接到3个单板可编程微控制器(Adafruit, Flitko GmbH，德国)。
此外，与c-底座相适应的数码相机(佳能Eos 600 D)的释放，以及通过镜盒(Stahlschmidt, Hagen)与显微镜相适应的外部ttl -闪光灯(佳能430EX2)连接到微控制器堆栈，从而与显微镜台的运动同步。从而实现了一个简单的显微镜机器人。在将焦点设置到封面上的标记后，系统被打开。在没有任何进一步的用户交互的情况下，从幻灯片的10个不同位置总共获得了30张图像。每个视场的尺寸为97.5 × 63.1 μm²。整个测量过程每张幻灯片需要3分钟。
从1.1 μm和3.0 μm的图像序列中分别测量前20个尖锐聚焦珠的尺寸，采用计算机辅助人工测量，如前所述[8]。简单地说，将各自的图像堆栈加载到ImageJ (NIH ImageJ, version 1.47v)中，使用自行开发的ImageJ宏[8]确定珠子的内外边界直径。
包含校准珠图像的分割基于前面描述的真实血小板图像[12]的自动分割算法。与之前的方法相比，为了提高图像质量，实现了对模糊图像进行反褶积的额外步骤。更新后的算法形成了在我们小组中对真实血小板和校准珠进行的所有调查的基础，并被实现为一个开源工具包铁路[26]。除了模糊图像的反褶积外，该算法的完整描述可以在[16]中找到。但是为了完整起见，下面描述了算法的所有步骤。
首先对标定珠采集的RGB图像进行红绿通道平均，将其转化为灰度图像。然后，通过估计灰度分布的低频部分来去除图像背景分量，这是由采集过程中不均匀的照明引起的。然后使用如下所述的盲反褶积方法锐化相应的背景校正图像。
在这里，对于在10个不同位置获得的30张图像组成的堆栈中获取的每张图像，使用未模糊图像和PSF1的组合最大似然估计来确定点扩散函数(PSF)。但是，由于未模糊的图像仍然有很大一部分模糊，因此忽略了图像，只保留了PSF信息。最大似然估计是基于灰度值大于图像中所有灰度值的中位数的图像像素。这导致算法的稳定性显著增加，因为切割抑制了背景像素，而PSF估计是没有意义的。对于堆栈中的每个图像，沿着x和y方向的PSF宽度被确定并平均。使用空间平均宽度，然后从堆栈中具有最小PSF宽度的50%图像确定平均PSF。由于图像模糊最可能是由光学衍射或非完美的显微镜聚焦引起的，因此预计堆栈中的所有图像都是相似的。因此，不同的特定于堆栈的点扩展函数必须具有可比性。然而，根据特定的图像，最大似然优化方法可能会导致局部而不是全局的似然函数最小值，从而导致对PSF的偏差估计。为了识别这种虚假案例，二维皮尔逊相关系数，r，计算每个个体PSF与平均PSF之间的差值。的平均点扩散函数取代了图像特定的点扩散函数r < 0.9．最后，以背景校正后的图像和相应的PSF作为输入，使用Lucy-Richardson方法[27]对堆栈中的每张图像进行去模糊。图1 (a)显示了为校准珠子而获取的样本图像以及估计的点扩散函数(b)和相应的去模糊图像(c)。图像清晰度的增加是清晰可见的。
图1所示。a)直径分别为1.1μm和3μm的珠子溶液的原始灰度图像。相应的最大似然估计pointspreadfunction (PSF)如(b)所示。x轴和y轴以像素为单位表示，其中1像素对应0.135μm。去模糊和背景场校正后的图像如(c)所示，图像质量明显提高。
然后使用[12]中描述的方法对去模糊的图像进行分割。简而言之，采用灰度值阈值和二进制标记相结合的方法来定义各个片段。在真实的血液图像中，假定的代表红细胞或白细胞的片段通过采用球形几何形状和它们的典型尺寸(比血小板的尺寸大得多)被去除。
最后，利用拉普拉斯高斯边缘检测滤波器计算出所有线段的轮廓。
对于每个线段，确定以下12个参数:(1)线段面积;(2)段周长;(3)分段边界的分形维数;(4)圆度;(5)平均灰色值和(6)相应的标准差;(7)与该段具有相同秒矩的椭圆的偏心率;(8)与线段面积相同的圆的直径;(9)区域面积与其包围框面积之比;(10)等效日食的长轴和(11)短轴长度;(12)固体度。固体度定义了段面积与相应凸包面积之间的比率。
此外，伪足的数量是附着在血小板体上的矛状物体，使用有监督的机器学习模型进行预测，该模型基于上面定义的[17]中所述的十二个参数。最后，使用具有双线性相互作用项[17]的线性回归模型，使用相同的12参数向量来预测称为激活分数的测量。激活评分范围在0-100之间，代表血小板激活的总体程度。使用专家分类的血小板形状和形态，训练相应的回归模型，以预测未知样本的激活评分。对整个方法包括其验证的完整描述已经给出了[17]。
整个分析过程使用Matlab R2015a (MathWorks Inc.， Natwick, USA)实现。
尽管目前的研究是基于没有任何表面结构的球形校准珠的检查，但其目的是评估精确的制备和检查链，这也用于分析真正的血小板。由于血小板分析的重要步骤之一是计算每个血小板的伪足数，下面简要介绍相应的检测步骤。
假足的正确鉴定依赖于对血小板体的精确定义。由于伪足的厚度通常比身体的宽度小得多，所有位于距离段边界不到3个像素的像素都被暂时移除，从而显著地抑制了伪足对段图像的贡献。假设大多数血小板体呈盘状，然后确定与临时处理的片段图像具有相同秒矩的椭圆的参数(位置、方向、长、小轴长度)。然而，对应的椭圆通常只是正确体型的近似值。为了说明每个线段的具体身体轮廓，估计的椭圆被识别完整的线段掩盖。生成的掩码表示估计的血小板体。然后通过标记完整的血小板面具和身体面具的减法图像来识别假足。最后，从伪足罩中去除面积<0.15 μm²或与伪足体有明显重叠(重叠像素的>35%)的伪足段。假足掩码中剩余的段数定义了每个血小板的假足数。
所有载玻片均安装在显微镜上，置于工作台相同的x (= 40 mm)和y (=110 mm)位置。焦点被设置为封面上的点标记。每块切片检查一次，3.0和混珠溶液各检查一次。因此，在21个检查周期中共拍摄了630张图像。从这些图像中自动分割出5347个不同物体的轮廓，并为每个轮廓确定上述几何和分形参数。从0.1 μm和0.3 μm原液中对载玻片的检查没有产生任何可用的结果，因此从下面讨论的进一步分析中放弃。因此，本文的结果是基于对11张幻灯片19个检查周期(1.1 μm, 3.0 μm和混合珠)的570张图像中的5246个片段进行分析。
首先，使用Kolmogorov-Smirnov检验检验所有变量是否正态分布。所有被测变量均呈非正态分布(p<0.05)。因此，采用非正态分布样本的非参数检验。对于两个独立样本，我们使用Mann-Whitney u检验，对于三个或更多组，我们使用Kruskal-Wallis检验。对于所有试验，当p值小于0.05时，差异被认为是显著的(p<0.05)，当p值小于0.001时，差异被认为是极显著的(p<0.001)。连续变量以均值和中位数表示，而选择标准差和四分位数作为离散度的度量。使用SPSS Statistics 20.0 (IBM Corp.， Armonk, NY)进行统计分析。
对同一玻片的重复测量表明，所建立的测量系统具有较高的可靠性和重现性(图2)。在分段珠数以及所有测量参数如面积、周长、圆度和分形维数上均无显著差异(p<0.001)。此外，对同一溶液的不同玻片的重复测量显示，测量结果的可变性仅略有增加，但仍不显著(p=0.014)。
图2。左图:对同一玻片的重复检查显示无显著差异(玻片内重现性，p<0.001)，以及对同一溶液的不同玻片的重复检查(右图)(玻片间重现性，p=0.014)。
红线:检测珠子的真实直径。
不同大小的珠子可以明确区分不同股票的解决方案(表1)的幻灯片以及幻灯片从珠子溶液混合使用diameter-circularity散点图(图3)。急剧集中珠子出现在暗视野显微镜作为一个在黑色背景白色与黑暗的中心环(图4)。外部和内部直径二十1.1和3.0的第一个珠子,分别是被专家认为是急剧集中,手工测量。1.1 μm的平均外径为1.68±0.15 μm, 3.0 μm的平均外径为4.15±0.14 μm。圆线宽度1.1 μm为1.18±0.21 μm, 3.0 μm为1.71±0.07 μm。由于算法分析分割了物体的外边界，如果利用圆方程从面积和周长测量数据中计算出的直径等于或小于人工测量的平均外径加上标准偏差(1.1 μm =1.83 μm, 3.0 μm = 4.29 μm)，则认为自动分割的珠子是尖锐聚焦的。因此，1.1 μm的37.8%(445个)和3.0 μm的92.7%(1086个)被分类为尖锐聚焦。
图3。不同尺寸珠子的直径ap -圆度散点图。1.1 μmbeads(上)与3.0 μmbeads(中)相比，由于锐度降低和焦点丢失，在圆度和直径上的散射更大。然而，在对混合珠液进行检查时，1.1 μm珠和3.0 μm珠可以清楚地区分开来(下图)。箭头1、2和3显示了图4中珠子图像对应的数据点。
图4。在暗场显微镜下，3 μm珠在黑色背景上呈白色环，中心为黑色。通过使用直径ap -圆度散点图(图3)，可以很容易地检测到不同类型的段(箭头:1:尖锐聚焦的珠粒，2:小聚集，3:珠粒失焦)。图的右边部分显示了自动化算法分析的结果。对比度增强，检测到原始珠子的外圆线(左)。自动计算不同的形状描述符。
1.1µm |
3.0µm |
|
珠数 |
1177 |
1171 |
区域(µm²) |
3.05 (1.63 - -19.98) |
10.98 (9.68 - -16.01) |
周长(µm] |
6.91 (4.2 - -29.54) |
10.98 (10.3 - -15.18) |
FD |
0.94 (0.77 - -1.12) |
0.90 (0.86 - -1.08) |
中国保监会 |
0.83 (0.25 - -1.23) |
1.16 (0.91 - -1.19) |
AvGW |
18.86 (7.53 - -37.02) |
58.42 (35.85 - -74.93) |
StdGW |
6.76 (2.23 - -14.01) |
12.71 (7.37 - -22.87) |
Eccent |
0.65 (0.31 - -0.92) |
0.2 (0.1 - -0.38) |
EquivDia |
16.08 (12 - 39.62) |
29.27 (27.55 - -35.29) |
程度上 |
0.62 (0.41 - -0.8) |
0.78 (0.72 - -0.8) |
MajorAxisL |
21.38 (12.77 - -60.51) |
29.61 (27.82 - -36.55) |
MinorAxis |
13.83 (10.42 - -37.2) |
29.01 (27.23 - -33.34) |
可靠性 |
0.87 (0.62 - -0.98) |
0.98 (0.92 - -0.99) |
PredNPseudoPods |
0 (0 - 2.76) |
0 (0 - 0) |
PredActivationScore |
31.62 (17.94 - -78.22) |
25.95 (24 - 35.29) |
D(P) =周长/π[µm] |
2.2 (1.34 - -9.4) |
3.49 (3.28 - -4.83) |
D(A) = 2平方(面积/π)[µm] |
1.97 (1.44 - -5.04) |
3.74 (3.51 - -4.51) |
Di(AP) = (D(A)+ D(P))/2[µm] |
2.08 (1.4 - -7.21) |
3.61 (3.39 - -4.66) |
表1。中位数(5. -95。1.1 μm和3.0 μm珠子几何描述符的百分位值。
表的上半部分是直接从珠子的分段轮廓测量的参数。下图为根据实测值计算出的参数。
最小的可分割珠子直径为1.1 μm。从0.1 μm和0.3 μm原液中对载玻片的分析没有产生任何可用的结果，因为图像只显示背景。此外，用混合溶液制备的载玻片的评价没有发现小于1.1 μm的载玻片。1.1 μm珠的活化得分中位数为31.62,3.0 μm珠的活化得分中位数为25.95。混合珠液的预测活化得分中位数为26.46。1.1 μm颗粒的分形维数中位数为0.94,3.0 μm颗粒的分形维数中位数为0.90，混合颗粒溶液的分形维数中位数为0.92，整体的分形维数中位数为0.91。中位数圆度为1.1为0.83,3.0为1.16，混合珠液为0.97。所有珠粒的中位数圆度为1.01。
3 μm (1.1 μm)珠粒中83.7%(84.9%)未检出伪足。相比之下，在3 μm和1.1 μm珠粒中，单个假足的测量率分别为7.6%和13.0%。其余节段显示1个以上的假足。采用多元模型预测相应数字时，误检率略高。其中，77.9%的3 μm珠粒被预测不存在假足，这与1.1 μm珠粒数据集的结果(76.2%)相当。不过，两种珠子的尺寸都差不多。90%的分段被预测最多有一个伪足。如上图所示，相当一部分片段失焦，这体现在圆度分布中的长尾(图3)。因此，如果只评估圆度为>0.8的片段，无论是直接测量(98.0%未检测到假足的片段)还是多元预测模型(96.3%未预测到假足的片段)都表现得更好。
目前的研究描述了一个自动化和标准化程序的验证，以调查血小板的形态计量学。这种新方法将极大地支持未来关于PSC生理和病理生理意义的研究，因为它首次允许几乎完全自动化和高度独立的血小板形状评估。这是特别有趣的，因为血小板被认为对分析前的影响因素高度敏感。因此，应用一个健全和标准化的考试系统来抑制因准备和考试过程而带来的任何偏见是特别重要的。此外，该系统的安全操作不需要特定的用户知识。这是血小板形状评估方面的重大进展，因为目前血小板形状的成像仍是耗时、复杂的，因此成本高且容易出现系统错误。
结果表明，所建立的体系具有较高的玻片内和玻片间再现性，对检测溶液中自由溶解颗粒的检出率较高。3.0 μm微珠的聚焦率高达92.7%。对于较小的粒子，聚焦物体的速率显著降低。该系统能够清楚地识别和分离较小和较大的颗粒。此外，双态粒子和大小颗粒的聚集物以及不聚焦的粒子都可以被识别。这增加了考试的信息价值和有效性。我们之前已经证明了[8]，通过精确聚焦和暴露于光下，可以在暗场显微镜中达到更高的分辨率(约0.2 μm)。在本研究中，分辨率的受损是基于系统的固定焦点和发光强度。然而，由于血小板的直径预计在3 μm左右或更大，所建立的系统应该适合于血小板形状的自动化分析。
完美圆的分形维数的中位数预计为1.0。系统将所有三个珠线的这个值低估了大约0.09。这是由于所使用的数字图像像素尺寸有限，加上成像对象尺寸较小，存在固有的不准确性。然而，由于这是一个内在错误，这应该不会影响从相同像素大小的图像中分割的结构的相对值的比较。因此，这一问题需要进一步阐述，一方面根据准确性和可比性，另一方面根据实用性，找到可能的最佳图像尺寸。
我们观察到圆度值C>1，特别是小段。即使C在理论上受到最大值的约束，有限的图像分辨率导致血小板小时周长/面积比增加。原则上，可以将所有超过1的测量值设置为C=1。然而，这将使所有相关测量产生偏差，因为点将恰好聚集在C=1处。因此，我们也允许C>1的结果，其中必须记住，这些值只是由于有限的图像分辨率。
由于目前的研究只研究了没有任何表面结构的完美球形物体，因此它为评估两种不同的方法来确定每段伪足数的性能提供了一个理想的测试用例。首先，使用上述定义的几何参数训练一个多元模型来预测相应的数字[12,17]，而第二种方法直接从每个片段获取的图像中确定伪足。我们在目前的研究中观察到，这两种方法几乎同样有效，而直接检测方法略有优势。90%以上的节段被分类为最多有一个伪足。采用直接检测方法，85%的分段不存在伪足。然而，最重要的是，研究证明，错误分类的片段的圆度明显低于正确分类的片段。由于上述低圆度段大部分存在失焦对象，因此误检率主要受图像采集方法的缺陷影响，较小程度上受检测和预测算法的缺陷影响。事实上，98%(96.3%)的高圆度物体被正确测量(预测)为无伪足，这表明两种方法在正确确定无伪足物体中的伪足数量方面都是高效的。然而，应该指出的是，这并不一定同样适用于具有真实假足的物体，并且需要对此类片段进行额外的验证研究，这超出了本文的范围。
以前已经证明，形状变化的血小板可以定量描述和分类使用暗场显微图像[12]。我们已经证明，表征血小板形状的参数可以敏感地表征血小板的不同激活状态。Bianciardi和同事的研究结果支持了这一研究，他们发现凝血酶[15]激活的血小板以及糖尿病患者[14]和原发性高胆固醇血症患者[13]的血小板在电子显微镜图像上轮廓的分形维数有显著差异。此外Canaultet al。[28]在荧光显微镜图像上发现，与健康受试者相比，来自RASGRP2敲除小鼠的血小板在纤维蛋白原扩散过程中明显减少了丝状伪足的形成。然而，与其他显微技术相比，暗场显微镜具有一些固有的优势。作为一种低成本的程序，不需要染色或固定样本，它非常适合于可视化活的、未染色的和未固定的血小板。
总之，目前的研究描述了一种高度自动化和标准化的暗场显微测量系统的评估，该系统允许对血小板形状进行定量、可靠和可重复的检查。该系统可能特别有用的检查和定量可能的前分析约束在形状变化的血小板成像。此外，由于该系统可以由实验室助理在没有特定知识的情况下操作，并且适用于高通量的玻片检查，它将能够并加快在更大的患者队列中检查psc -特征。因此，这将提高我们对PSC的生理和病理生理相关性的认识。
Bianciardi乔治•
锡耶纳大学
研究文章
收稿日期:2015年5月3日
录用日期:2015年5月25日
出版日期:2015年5月29日
©2015 Kraus MJ。这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可的条款发布，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是要注明原作者和来源。
Kraus MJ, Strasser EF, Neeb H(2015)用于血小板形状标准化和可重复性定量形态测量的自动化显微镜。医学与生物学分形几何与非线性分析1:doi: 10.15761/FGNAMB.1000106
Robert-Koch-Str。9 82031 Grünwald，德国，电话:+49-89-64954228;传真:+ 49-89-64963485。
1.1µm |
3.0µm |
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珠数 |
1177 |
1171 |
区域(µm²) |
3.05 (1.63 - -19.98) |
10.98 (9.68 - -16.01) |
周长(µm] |
6.91 (4.2 - -29.54) |
10.98 (10.3 - -15.18) |
FD |
0.94 (0.77 - -1.12) |
0.90 (0.86 - -1.08) |
中国保监会 |
0.83 (0.25 - -1.23) |
1.16 (0.91 - -1.19) |
AvGW |
18.86 (7.53 - -37.02) |
58.42 (35.85 - -74.93) |
StdGW |
6.76 (2.23 - -14.01) |
12.71 (7.37 - -22.87) |
Eccent |
0.65 (0.31 - -0.92) |
0.2 (0.1 - -0.38) |
EquivDia |
16.08 (12 - 39.62) |
29.27 (27.55 - -35.29) |
程度上 |
0.62 (0.41 - -0.8) |
0.78 (0.72 - -0.8) |
MajorAxisL |
21.38 (12.77 - -60.51) |
29.61 (27.82 - -36.55) |
MinorAxis |
13.83 (10.42 - -37.2) |
29.01 (27.23 - -33.34) |
可靠性 |
0.87 (0.62 - -0.98) |
0.98 (0.92 - -0.99) |
PredNPseudoPods |
0 (0 - 2.76) |
0 (0 - 0) |
PredActivationScore |
31.62 (17.94 - -78.22) |
25.95 (24 - 35.29) |
D(P) =周长/π[µm] |
2.2 (1.34 - -9.4) |
3.49 (3.28 - -4.83) |
D(A) = 2平方(面积/π)[µm] |
1.97 (1.44 - -5.04) |
3.74 (3.51 - -4.51) |
Di(AP) = (D(A)+ D(P))/2[µm] |
2.08 (1.4 - -7.21) |
3.61 (3.39 - -4.66) |
表1。中位数(5. -95。1.1 μm和3.0 μm珠子几何描述符的百分位值。
表的上半部分是直接从珠子的分段轮廓测量的参数。下图为根据实测值计算出的参数。
图1所示。a)直径分别为1.1μm和3μm的珠子溶液的原始灰度图像。相应的最大似然估计pointspreadfunction (PSF)如(b)所示。x轴和y轴以像素为单位表示，其中1像素对应0.135μm。去模糊和背景场校正后的图像如(c)所示，图像质量明显提高。
图2。左图:对同一玻片的重复检查显示无显著差异(玻片内重现性，p<0.001)，以及对同一溶液的不同玻片的重复检查(右图)(玻片间重现性，p=0.014)。
红线:检测珠子的真实直径。
图3。不同尺寸珠子的直径ap -圆度散点图。1.1 μmbeads(上)与3.0 μmbeads(中)相比，由于锐度降低和焦点丢失，在圆度和直径上的散射更大。然而，在对混合珠液进行检查时，1.1 μm珠和3.0 μm珠可以清楚地区分开来(下图)。箭头1、2和3显示了图4中珠子图像对应的数据点。
图4。在暗场显微镜下，3 μm珠在黑色背景上呈白色环，中心为黑色。通过使用直径ap -圆度散点图(图3)，可以很容易地检测到不同类型的段(箭头:1:尖锐聚焦的珠粒，2:小聚集，3:珠粒失焦)。图的右边部分显示了自动化算法分析的结果。对比度增强，检测到原始珠子的外圆线(左)。自动计算不同的形状描述符。
