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摘要

潜伏性结核病(LTBI)在老年人群中更为常见，并可能导致长期医疗机构中的传播增加。由于结核菌素皮肤试验(TST)的潜在钝化，以及老年人耐受抗生素过程的能力降低，检测LTBI的困难凸显了对有效疫苗的需求。免疫衰老降低了疫苗诱导对许多病原体产生足够水平的保护性免疫的能力，进一步增加了老年人对传染病的易感性。我们试图评估B细胞对结核分枝杆菌（快艇)，以确定使用疫苗控制由活化的LTBI引起的感染和传播的可行性。我们的研究结果表明，尽管LTBI患者的B细胞反应更高，快艇抗原能刺激B细胞活化和分化在体外TST阴性受试者。来自老年受试者的B细胞表达了高水平的toll样受体(TLR)2和TLR4，并对其有强烈的反应快艇一些活化途径依赖于TLR2的配体。来自年轻受试者的血液、扁桃体和脾脏的B细胞反应相似，数量相同。这些结果表明，B细胞反应在老年人中是强有力的，结核病疫苗的改进，如基于TLR2配体的佐剂，可能有助于将免疫反应提高到保护水平。

简介

潜伏结核感染(LTBI)在发达国家大幅下降;然而，疾病的复发在老年人中很普遍。老年人的结核病(TB)被认为主要归因于LTBI的再激活;据报道，疗养院环境中的传播增强[2]。因此，美国的结核病发病率在疗养院或长期护理机构的人群中最高。此外，与结核病进展相关的共病(如慢性肾衰竭、控制不良的糖尿病)的老年人患病率高，以及生活到老年并在长期护理机构接受护理的人口比例高，也促进了结核病复发率的上升[4]。居民也可能处于拥挤的环境中，进一步增加传播风险[5]。

原发性感染结核分枝杆菌（快艇)导致临床疾病的病例在一般人群中仅占10%[6]。因此，在90%的病例中，感染似乎是由免疫反应控制的。然而，在这些个体中，只有大约10%的人被观察到病原体完全根除。剩下的部分，快艇在没有临床疾病的情况下处于非复制状态，称为LTBI。LTBI可在免疫系统恶化时发展为暴发性疾病，如艾滋病或免疫衰老状态[7,8]。由于结核菌素皮肤试验(TST)依赖于强烈的延迟型超敏反应[9]，免疫系统受损也导致感染检出率低。我们最近的报告表明，TST和其他诊断方法之间的不一致可能会增加养老院的传播风险[10]。

对于目前的LTBI治疗，老年患者不良事件发生率较高，特别是肝毒性，因此可能无法耐受消除感染所需的长期治疗[11,12]。开发对抗LTBI再活化的新治疗干预措施快艇针对老年、长期护理机构居民的预防传播，如疫苗接种计划，可减少LTBI的影响以及对工作人员、访客和患者的感染威胁更大的社区[5,13]。尽管有体液反应的早期证据，但卡介苗介导的相对较低的保护率表明，体液免疫对于预防感染并不重要，因此注意力转移到开发有效抗生素上[14,15]。鉴于世界范围内结核病的持续负担主要是由人类免疫缺陷病毒(艾滋病毒)的流行和结核病的发展造成的快艇在耐药性方面，研究人员重新审视了体液免疫对控制策略的重要性。

结核病免疫研究主要集中在T细胞上;因此，关于B细胞或抗体在人类疾病[16]中的作用的报道很少。在患有严重肺部疾病的活动性结核病患者中，调理IgG1和IgG3已被证明上升，这表明抗体可能起清除作用快艇感染[15、17]。这也得到了其他研究的支持快艇特异性IgG显著增强补体诱导的杀伤快艇在体外(18、19)。快艇-特异性抗体可干扰巨噬细胞粘附和吞噬溶酶体融合，调节肉芽肿形成。此外，鼻内单克隆IgA抗体的被动保护虽然短暂，但在小鼠肺部早期感染中被显示出来。有趣的是，静脉注射大剂量人免疫球蛋白(IVIG)给快艇-感染小鼠的肺部和脾脏中的细菌载量下降，这表明抗体有额外的保护作用，尽管缺乏证明快艇-特异性在IVIG[20]。

B细胞具有多功能，可通过抗原提呈和免疫调节细胞因子的分泌增强T细胞的反应[21,22]。B细胞是可诱导的异位肺淋巴样聚集物的组成部分，在小鼠和人类肺部的位置均有描述快艇被认为已被控制[23-25]。聚集物中含有生发中心(GC) B细胞，表明B细胞分化和保护性免疫的发展发生在这些三级淋巴组织[23]中。这些B细胞滤泡也可能增强保护性炎症。在B细胞缺陷小鼠中，气溶胶挑战快艇,结果导致肺部细菌负担显著增加，肉芽肿组织受损，这是可以通过B细胞过养转移逆转的，这表明B细胞可能在控制TB[26]中具有多种功能。

由于研究的重点是通过[27]疫苗接种产生高度多样化的免疫反应，我们试图在患有LTBI的养老院老年队列中描述B细胞的激活和分化。我们证明了通过接种疫苗诱导靶向保护性免疫的可行性;这种方法可以应用于养老院居民，以帮助防止感染快艇以及LTBI的重新激活。

方法

研究参与者

这项研究得到了波士顿大学机构审查委员会的批准。研究对象来自当地三个长期护理机构。对医疗记录进行审查，以确定有TST阳性史的艾滋病毒未感染居民。根据图表回顾，受试者为HIV阴性，但本研究未对HIV状态进行主动测定。还招募了一个hiv阴性、性别和年龄匹配(5年内)、无TST阳性记录的对照组。37名参与者的中位年龄为78岁(范围58-98;表1)。

表1。学科特点

	例(n = 12)		控制(n = 14)
年龄中位数，年龄(范围)	78 (60 - 92)		79 (58-98)
男性，n (%)	11 (92)		10 (71.4)
比赛
非西班牙裔黑人	9	(75)	8	(61.5)
黑色的拉美裔	1	(8.3)	0
非西班牙裔白人	2	(16.7)	3.	(23.1)
白色的拉美裔	1	(8.3)	2	(15.4)
BMI中值(范围)	23.8 (19.2 - -30.5)		27日(16.5 -33)
吸烟史	6	(86)	7	(70)
美国出生，n (%)	2	（33）	7	(78)
护理平均年限	5	(-)	5.5 (0-18)
(范围)
中位数	3.	(n = 7)	4
室友(包括自己)
每天在公共场所用餐	8	(80)	9	(90)
餐厅
所有P = NS

在知情同意后，研究人员对参与者或其法定授权代表进行了标准化问卷调查，以获取有关其健康和个人历史的信息。取静脉血15 ml，放入肝素化管中检测T-SPOT。TB试验(干扰素释放试验;在此干扰素释放;牛津免疫技术(Oxford Immunotech, MA)和以下所述的免疫学分析。在静脉切开后，在前臂掌侧进行TST，并在48小时后使用圆珠笔和尺法读取。根据国家指南，硬结≥10 mm定义为TST阳性。任何可疑的结果都由一个第二个读者。TST阳性且IGRA阳性的受试者在这里被称为LTBI。阴性的受试者被称为tst阴性。该研究方案的其他细节已在之前发表[28]。

年轻受试者的血液和淋巴组织

来自年轻受试者(50岁以下)的肝素化全血样本(n=6)购自Research blood Components (Boston, MA)。废弃的扁桃体(n=3)和脾脏(n=1)手术样本购自PA国家疾病研究交流中心。他们的结核病史，暴露于快艇或卡介苗未披露。

新鲜全血的体外分析

检测新鲜全血中CD19+ B细胞体外CD27、CD36、TLR2和TLR4的表面表达。检测新鲜全血中性粒细胞TLR2和TLR4水平。100 μl/管肝素化全血与荧光标记抗体(BD Pharmingen;eBioscience)在4°C下溶解30分钟。红细胞用2 ml FACS溶解缓冲液(BD pharingen)在室温下黑暗中溶解30分钟。细胞用2ml 0.2%牛血清白蛋白(BSA)在PBS中清洗，流式细胞术评估。用抗cd19生成的门对每个样本进行B细胞表面表达的评估。中性粒细胞表面表达使用FSC/SSC上的电子分离细胞进行。剩下的全血被离心;收集并储存在- 20°C的血浆，用于检测抗体、炎症介质和细胞因子，详细说明如下。

免疫测定评估细胞对结核分枝杆菌的反应

剪切组织，轻轻均质，并通过70细胞过滤器过滤，以获得单细胞悬浮液。将组织细胞和外周血(PB)进行Ficoll-Hypaque密度梯度(Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA)以获得单个核细胞(MC)。用负珠分离法从MC中分离出B细胞(表达载体)。MCs以2 × 10播种⁶细胞/ml, B细胞1 × 10⁶RPMI 1640中添加10%热灭活胎牛血清、1mm青霉素-链霉素和2mm l-谷氨酰胺(Invitrogen)。以下试剂通过BEI Resources, NIAID, NIH获得:结核分枝杆菌，菌株H37Rv，全细胞裂解液(WCL)， NR-14822。仅用培养基、2、5、10或20 g H37Rv WCL刺激细胞;anti-CD40 (1 g/ml;研发系统),大肠杆菌LPS(0.1或1g/ml)，或PAM3CSK4 (1g/ml)(均来自Invivogen)。在一些实验中，以10 g/ml加入TLR2和TLR4的阻断抗体(eBioscience)。在24、48和72小时，收集无细胞上清液，并在-20°C保存，直到用于测量分泌的细胞因子。收集细胞，用从BD Pharmingen和eBioscience购买的抗体进行流式细胞术检测B细胞激活和分化标志物，包括CD19、CD69、TLR2、TLR4、CD86、CD95、CD77、CD38和CD27。细胞用0.2%多聚甲醛固定(电子显微镜科学，华盛顿，PA)，然后用流式细胞仪进行评估。

细胞因子和分枝杆菌特异性抗体的测定

使用市售ELISA试剂(R&D Systems, Minneapolis, MN)对无细胞培养上清进行IFN-γ、IL-10、IL-4和IL-8水平评估。ELISA法检测血浆中细胞因子IL-6和IL-8。检测血浆抗体分枝杆菌-特异性抗体ELISA检测。用5 μg/ml的WCL在PBS中涂布，4℃过夜。用1% BSA/PBS清洗并堵塞盘子1小时。在血浆滴定后，以1:80稀释血浆(见图2A)，并在室温下孵育4小时。快艇用酶标二抗检测特异性IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，二抗购自南方生物科技。

图2。有先前免疫的证据快艇在LTBI。A.滴定快艇ELISA检测5例LTBI患者的特异性IgG1。B.平均外径值快艇-特异性IgG1在1:80血浆稀释时在LTBI受试者中更高。C) IFN-γ分泌对WCL的反应快艇LTBI较高。pmcs孵育72小时，ELISA检测IFN-γ。水平条表示中位数。

脂多糖和BPI

为了检测潜在的亚临床细菌感染，这会影响细胞激活的基线测量，LPS/内毒素水平(LAL;龙沙)和杀菌通透性增加蛋白(BPI;Hycult Biotech ELISA)检测血浆。

WCL中toll样受体配体的评估

从Invivogen购买表达TLR2和tlr4的HEK293细胞，并按照制造商的说明进行培养。流式细胞仪检测TLR2和TLR4表面表达后，以5万个/孔的数量在96孔板中接种细胞。用滴定浓度的WCL处理细胞。大肠杆菌以LPS和Pam3CSK4为对照。次日采集上清液，ELISA检测IL-8水平。

统计分析

使用GraphPad Prism (GraphPad Software)进行统计分析。Dunn后验和Mann-Whitney的单向方差分析U试验分别用于多组或单组比较。使用Spearman秩相关检验检验可能的相关性。由于一些患者样本无法获得，不同测试的组样本量不同。

结果

LTBI受试者的基线体外B细胞激活水平

我们的目标是确定老年受试者的B细胞对药物的反应能力快艇抗原是疫苗反应的代表。检测两组新鲜全血中B细胞上参与微生物识别的受体的基线表达。老年受试者循环B细胞表面TLR2、TLR4和CD36水平高于先前发表的成人、非老年人群细胞数据。然而，LTBI组和tst阴性组之间没有差异(图1A)。在那里通过表达CD27的CD19+细胞的百分比来衡量，循环记忆B细胞的水平没有差异(图1A)。

图1。LTBI的炎症指标基线水平较低。一个。体外参与细菌识别的B细胞受体水平在LTBI和tst阴性受试者中相似。CD27+ B细胞的百分比也相似。B。体外中性粒细胞TLRs水平在LTBI和tst阴性受试者中相似。C. LTBI和tst阴性受试者血浆内毒素水平相似。D.血浆BPI水平在LTBI和tst阴性之间也相似。科目。E. LTBI和tst阴性受试者血浆中IL-6和IL-8水平无差异。水平线表示中间值。LTBI和tst阴性之间的均值差异均为P> 0.05。

炎症生物标志物在LTBI和tst阴性之间相似

确定是否存在可能影响细胞反应的全身炎症反应在体外，我们测量了中性粒细胞表面TLR2和TLR4水平作为代理指标，发现两组之间没有差异(图1B)[30]。

血液中的LPS/内毒素水平也可以作为亚临床感染[31]的衡量标准。两组血浆内毒素水平同样较低(图1C)。同样，BPI(一种由循环中性粒细胞释放的分子，对LPS作出反应)的浓度在两组中都很低(图1D)[32]。

IL-6和IL-8，在活动性结核病中被描述为升高的促炎细胞因子，在两组中同样低(图1E)[33]。总的来说，这些数据表明两组之间的基线促炎状态相似。因此，没有发现会混淆所获得的结果的全身炎症测量体外。

LTBI中的mtb特异性记忆反应

的水平快艇在血浆中测量特异性IgG，作为预先免疫反应的指标和抗原特异性记忆B细胞存在的衡量标准(图2A)。高浓度的快艇与tst阴性受试者相比，LTBI受试者血浆中检测到-特异性IgG1(图2B)。抗原特异性IgG2或IgG3水平在两组中同样低，LTBI和TST阴性之间没有统计学差异(数据未显示)。快艇-特异性IgG4在两组中均未检测到(数据未显示)。

LTBI受试者的pmcs分泌的IFN-γ明显更多，但IL-10不响应WCL快艇(图2 c;图示为IFN-γ水平)。因此，大多数tst鉴定的LTBI受试者具有预先存在的记忆免疫反应的指标快艇．

在体外实验中，老年受试者的B细胞被Mtb抗原激活

用WCL处理PBMCs快艇通过CD69(一种常用的激活标志)的表达来测量，72小时后显示出高水平的激活B细胞(图3A和B)。与TST-neg相比，LTBI刺激后激活B细胞的比例更高(图3B)。

图3。快艇抗原激活B细胞．A.流式细胞术显示PBMC培养中CD19+ B细胞表达的CD69水平。所示为来自LTBI主题的图。据Hochberg报道，WCL还诱导非b细胞表达CD69等, 2016年。B.复合数据显示，使用图中所示刺激治疗后CD69+ B细胞增加。水控制法从快艇B细胞CD69表达增加，而抗cd40或两者的组合大肠杆菌LPS (TLR4配体)和PAM3CSK4 (TLR2配体)则没有。C.复合数据显示TLR2+ B细胞在图中所示刺激处理后增加。水控制法从快艇两组B细胞TLR2表达均升高。D.相比之下，TLR4在两组测试的任何刺激中都没有显著上调。水平条表示中位数。

尽管老年受试者表现出较高的TLR2+ B细胞基础水平，但我们发现，与未处理的细胞相比，用WCL处理pbmc导致LTBI和tst阴性的B细胞TLR2表达水平进一步升高(图3C)。相比之下，TLR4水平在WCL反应中没有显著上升，组间没有差异(图3D)。

作为混合细胞培养中WCL对B细胞非特异性刺激的对照，pmcs被TLR2配体Pam3CSK4和E。杆菌LPS, TLR4配体。与未处理的老年组细胞相比，这种刺激没有诱导显著的B细胞激活(图3B-3D)。

在老年人中，对Mtb抗原反应的B细胞分化是完整的

B细胞在淋巴生发中心(GC)中分化，并经过几个激活阶段转变为记忆B细胞或浆细胞[34]。我们评估了CD77的表达作为GC B细胞在WCL反应中发育的标志。与未处理的细胞相比，LTBI受试者的B细胞对WCL表达更高水平的CD77(图4A)。重要的是，来自TST-neg的B细胞表达CD77快艇抗原(图4A)．

图4。分枝杆菌抗原刺激老年受试者的B细胞分化．A.如图所示刺激处理后CD77+ B细胞上调。水控制法从快艇而抗cd40和PAM3CSK4和PAM3CSK4的联合作用均能增加B细胞CD77的表达大肠杆菌LPS则没有。B. CD27水平对WCL的响应快艇只在LTBI中。水平条表示中位数。C.血浆快艇-特异性IgG1与WCL治疗后CD27+ B细胞的百分比呈负相关，但在统计学上不显著。

来自LTBI的B细胞，而不是来自tst阴性对照受试者的B细胞，在对WCL的响应中，记忆标记CD27水平增加(图4B)。因为更高的层次快艇-特异性IgG1表明较高的预先存在水平快艇在LTBI中，我们评估了wcl诱导的CD27表达与LTBI中CD27水平之间的关系快艇特殊技能IgG1。与CD27+ B细胞的增加相反，但不具有统计学意义快艇-特异性IgG1提示存在快艇特异性记忆B细胞在遇到感染时可能会遵循不同的分化途径，例如重新进入GC(图4C)。然而，两者之间没有相关性快艇-特异性IgG1水平和CD77水平变化对WCL的响应(数据未显示)。

B细胞激活标记物与诊断测试读数强度相关

TST和IGRA主要是T细胞介导的反应，但B细胞已被证明在TB的肉芽肿形成中起作用，这是一种类似于TST的延迟型超敏反应。B细胞活化，包括TLR2和CD69的上调，与TST(直径大小)的强度和来自IGRA的斑点数量相关(图5A;所示为TLR2水平)。而与TLR4的上调没有关系(图5B)。这一观察结果表明，B细胞的TLR2反应可能在该过程中起作用快艇介导免疫。

图5。快艇-介导的B细胞TLR上调与IGRA强度相关．A) PBMC与WCL培养后TLR2+ B细胞的百分比快艇与IGRA诊断强度相关。B)相比之下，PBMC与WCL培养后TLR4+ B细胞的百分比与IGRA的强度无关。C. TLR2+ HEK细胞通过分泌IL-8对WCL产生反应(图左侧)，但TLR4+ HEK细胞对WCL的反应较弱(图右侧)。

虽然WCL可能含有多种抗原，交联B细胞受体，培养TLR2+ HEK和TLR4+ HEK细胞与WCL快艇证明TLR2配体和弱TLR4配体的存在(图5C)。

来自未感染的年轻受试者的单个核细胞对WCL的反应类似

以确定B细胞的激活水平是否达到快艇来自老年受试者的抗原是沉默的，我们评估了来自年轻受试者的PBMCs(>50岁)的反应，这些年轻受试者有未知的结核病史，暴露于Mtb或卡介苗。一般来说，细胞对快艇抗原的强度和动力学与老年组相似，包括CD69、TLR2和CD77在72小时内的上调(表2;图6 a)。同样，TLR4没有显著上调(数据未显示)。WCL诱导CD38表达上调^高B细胞，可能代表GC或浆细胞前体(表2;图6 b)。此外，在pbmc中，B细胞上的CD86和CD95增加，这表明人类B细胞高度激活，并对免疫应答进行分化快艇抗原，即使在naïve状态(表2;图6 c)。奇怪的是，这些标记在培养24小时后几乎没有上调(数据未显示)。

图6。来自非老年受试者的B细胞与来自老年受试者的B细胞反应相似: A. B细胞在外周血母细胞内表达CD69、TLR2、CD77和CD38 (B)，以响应培养后的WCL;*表示仅从媒体的均值来看有统计学上的显著差异;P< 0.02。pbmc内的C. B细胞表达额外的激活标记，包括CD86和CD95，以响应WCL。Pam3CSK4和大肠杆菌LPS也诱导CD86和CD95。***表示刺激诱导的激活方式不同于单独的介质;P< 0.02。D)粘膜B细胞对WCL表现出类似的反应，并上调CD69、TLR2和CD77。*表示与单独的媒体相比有统计学上的显著差异;P < 0.02。所有数据均为72小时时间点，n=3个独立实验。

表2。WCL的作用快艇对MC内的脾B细胞进行72小时培养

	% CD69	% TLR2	% TLR4	% CD77	% CD38	% CD27
媒体	45.9	18.1	13.6	13.2	25.1	42.0
WCL 5 μg/ml	65.6	69.1	63.1	23.6	62.5	62.0
WCL 10 μg/ml	66.2	74.7	66.1	24.2	59.7	63.2
WCL 15 μg/ml	68.4	71.1	66.3	24.5	51.1	60.8
抗bcr +抗cd40	79.8	66.3	60.2	17.7	78.4	50.7
WCL 10 μg/ml + anti-CD40	66.6	83.9	76.1	28.0	68.4	66.2
WCL 10 μg/ml + Pam3	71.1	85.7	81.1	34.6	75.8	71.3
WCL 10 μg/ml +大肠杆菌LPS	74.3	78.5	68.9	23.4	71.9	62.8

还评估了来自粘膜和全身淋巴组织(包括扁桃体和脾脏)的单个核细胞内的B细胞。淋巴B细胞通过上调CD69、TLR2、TLR4和CD77在治疗72小时(但不是24小时)对WCL产生强烈反应(表2;图6 d)。因此，当人类B细胞识别的WCL快艇，细胞激活的固有延迟可能表明B细胞免疫逃避抗原的存在。

Mtb的WCL直接激活人B细胞

确定…的直接效果快艇抗原、纯化的扁桃体B细胞和脾脏单个核细胞用WCL培养。WCL诱导了活化标记的表达，但在24小时后表现出延迟(表3;图7;所示为CD69+ B细胞)。WCL还直接诱导纯化的B细胞分泌IL-8(图7B)。

图7。TLR2配体可增强纯化B细胞的直接反应．A)纯化的脾B细胞对WCL的反应与混合细胞培养的反应相似，包括CD69表达的延迟。这种延迟通过添加TLR2配体Pam3CSK4(黑色条)而减少。B)纯化的脾B细胞分泌IL-8对WCL的反应，添加Pam3CSK4后72小时观察到IL-8增强。C) PBMC内的B细胞需要TLR2，而不是TLR4，以获得响应WCL的最佳激活;*表示CD69和CD86的均值与单独培养基相比有统计学意义上的差异;**表明与单独使用WCL相比，anti-TLR2将应答降低到具有统计学意义的平均差异;72小时的时间点。D)抗tlr2和抗tlr4阻断抗体均可适度减少IFN-γ的分泌;72小时的时间点。

表3:WCL的作用快艇在纯化的脾B细胞上72小时培养

	% TLR2	% TLR4	% CD77	% CD38嗨	% CD27
媒体	11.1	9.9	9.1	7.6	24.6
WCL 5 μg/ml	42.5	18.1	10.9	46.3	37.5
WCL 10 μg/ml	21.2	30.6	9.6	20.7	42.5
WCL 15 μg/ml	24.3	48.1	7.8	10.1	43.9
抗bcr +抗cd40	9.8	12.1	6.3	7.2	22.4
WCL 10 μg/ml + anti-CD40	23.8	50.8	5.6	13.5	44.9
WCL 10 μg/ml + Pam3	31.7	58.4	9.7	14.1	48.1
WCL 10 μg/ml +大肠杆菌有限合伙人	24.2	46.3	4．9	10.9	43.1

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mtb诱导的B细胞活化部分依赖于TLR2

接下来，我们根据上述观察评估了TLR2或TLR4是否在B细胞激活中发挥作用。在用WCL处理的pmcs或扁桃体MC中添加TLR2配体(Pam3CSK4)可增加B细胞CD69和CD86的表达(图6D;扁桃体MC;图7 b;此外，B细胞激活延迟减少与Pam3CSK4的添加，但没有大肠杆菌LPS，到WCL(图7A和7B)。相比之下，加入TLR4配体，大肠杆菌LPS无影响(数据未显示)。

阻断TLR2抗体降低了这些激活标记在WCL反应中的表达(图7C);然而，用CD38测量的B细胞分化不受影响(未显示)。相比之下，阻断TLR4对测量到的任何B细胞激活或分化标志物都没有影响(图7C)。

细胞因子的产生不依赖于TLR2或TLR4

为了确定IFN-记忆可能形成的机制，在抗tlr2或抗tlr4阻断抗体存在的情况下，用WCL处理pmcs。两种抗体对IFN-γ的产生都有一定的影响在体外(图7 d)。相反，组织中PBMC或MC的IL-8分泌不受anti-TLR2或anti-TLR4的影响(数据未显示)。

讨论

老年人是结核病和结核病传播的高危人群快艇在老年人长期护理机构中有报道[4,35]。由于年龄会影响有效诊断和疫苗接种所需的免疫反应，因此迫切需要改进的工具，如有效疫苗，以帮助控制疾病[28]。此外，包含分枝杆菌的保护机制尚不明确，B细胞或抗体在控制结核病中的作用应得到澄清，以改进疫苗策略[36]。

最近的报道表明，TB中B细胞激活和分化的一个重要部位是肺异位淋巴样聚集物[23]。支气管相关淋巴组织(BALT)在肺的支气管周围、血管周围和间质区发育，以应对感染，但它通常不存在于健康的人类肺部[37]。BALT的特征是活化和GC B细胞由中央滤泡树突状细胞网络支持，类似于典型的淋巴组织[37]。因此，结核中的异位淋巴样聚集物类似于BALT，位于结核样肉芽肿附近。这些聚集物可能包含gc样B细胞，但在人类中还没有很好的特征。缺乏这些淋巴组织的病人痰中分枝杆菌的数量较高，这表明了控制的作用快艇［23］．有趣的是，在利妥昔单抗(不消除iga特异性B细胞)治疗的LTBI类风湿性关节炎患者中没有观察到TB的再激活，这表明快艇特异性IgA可能是肺[38]的关键效应抗体同型。B细胞也可能通过分泌趋化因子或诱导T细胞的激活，在招募细胞到肺中发挥作用。新的重点是通过接种疫苗产生高度多样化的免疫反应，我们的目标是确定WCL的效果快艇对老年人B细胞进行研究，以帮助确定控制LTBI[27]激活和传播的疫苗接种策略的可行性。

虽然我们没有测量IgA，但我们证明了来自LTBI老年人群的血浆中IgA含量增加快艇特异性IgG1水平，提示肺快艇刺激免疫系统的体液臂。我们报告，来自LTBI和tst阴性的老年受试者的外周血B细胞对药物的反应强烈，并且类似快艇。来自年轻受试者的循环B细胞和粘膜B细胞的反应程度相当。总的来说，我们的数据表明，B细胞上调了与激活(CD69)、微生物识别(TLR2和TLR4)和分化(CD38、CD77、CD95)以及与T细胞激活(CD86)相关的表面分子。这些活化和分化的标记物大多在LTBI受试者的B细胞上有较高程度的增加。只有来自LTBI的B细胞上调了CD27快艇抗原，一种记忆B细胞的标志。然而，tst阴性受试者的B细胞活性增加快艇两组研究的生发中心B细胞分化表明，在老年患者中接种疫苗可诱导强有力的免疫反应。

有趣的是，我们的数据表明，可能有免疫抑制抗原针对B细胞包含在WCL快艇[39]。添加TLR2配体佐剂可在疫苗策略中规避部分这种效应。我们之前已经证明IFN-γ在B细胞的TLR2表达中没有直接作用，但TLR2介导的B细胞在LTBI中的应答的意义可能反映在IGRA与TLR2上调之间的正相关快艇抗原[40]。因此，我们假设在细菌遏制中，TLR2+ B细胞可能参与了回忆反应。我们的研究结果支持了这一点，即TLR2在响应WCL的B细胞激活中发挥作用在体外．在疫苗策略中通过TLR2激活B细胞可能使免疫系统更好地准备清除感染。相比之下,大肠杆菌LPS和其他TLR4配体在历史上一直是人类B细胞的不良刺激物，尽管在该队列中TLR4水平升高[41,42]。TLR2已被证明可以驱动记忆B细胞的发育，记忆B细胞似乎保留了TLR2的表面表达，使细胞具有快速响应病原体[43]的能力。我们和其他人也证明了从粘膜淋巴样组织分离的TLR2+ B细胞具有GC B细胞的特征，TLR2刺激的B细胞分泌大量的趋化因子，这些趋化因子可能会招募必要的细胞快艇曝光(44岁,45岁)。最后，TLR2可能通过诱导特异性归巢受体[46]的上调，在引导B细胞到达粘膜组织中发挥作用。

总之，好坏参半快艇含有外源性TLR2配体的抗原疫苗可能对LTBI的再活化或Mtb感染具有很强的保护作用[27,47]。TLR2配体疫苗可以克服潜在的固有免疫逃避抗原，诱导B细胞激活并在LTBI[39]感染或再激活时归巢到肺。未来的研究应侧重于更好地描述BALT在产生保护性免疫中所起的作用。

资金来源

这项工作得到了NIAID赠款AI097684和AI116593的支持，L.M.G.和波士顿大学在妇女健康领域建立跨学科研究事业赠款(K12-HD43444给N.S.H)。

确认

我们要感谢长期护理机构人员、抽血师和参与本研究的受试者的帮助。

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