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摘要

提出了新的二肽的基因表达测试数据，N-癸酰基-L-谷氨酰胺基-L-谷氨酰胺酰胺（DGGA），表明其作为治疗皮肤衰老的局部抗衰老剂。

关键词

肽，抗衰老，细胞衰老，皮肤衰老，蔷薇科，痤疮，皱纹

介绍

用一颗子弹瞄准多种原因来预防皮肤老化是科学和消费者最感兴趣的。基于细胞抗衰老的治疗现在提供多种皮肤疾病包括皮肤老化的单一解决方案!

衰老是指生物体在成熟后随着年龄的增长而发生的生物学变化，包括影响其细胞及其功能的变化，以及影响整个生物体的变化。衰老不是普遍现象，衰老在通过细胞有丝分裂过程繁殖的单细胞生物中不被观察到。人类的细胞衰老导致细胞通过有丝分裂过程停止自我复制，从而导致细胞在一段时间内退化。细胞是构成我们身体的基本结构，因此细胞的衰退有助于衰老的过程。

水是生命的关键元素。然而，有些生物已经进化出一种惊人的适应能力，使它们能够在完全脱水的条件下存活很长一段时间，直到水再次出现，恢复新陈代谢和生长。

细胞必须保持最佳的水分平衡，以保持丰满和健康。想象一张脸被画在装满水的气球上。由于气球内表面持续受到水的压力，脸型会显得丰满而年轻。但是，如果水慢慢地从气球中渗出(渗透)，那张憔悴的脸就会越来越多地看起来布满皱纹、疲惫、下垂和衰老。

高渗透压已被证明可诱发炎症。通过评估炎症期间体内的渗透压值，比较不同渗透剂的炎症电位，研究高渗透压对细胞命运的长期影响，已经建立了高渗透压和炎症之间的联系。细胞暴露在不同的化合物中，无论它们的分子量如何，只要渗透压低于300 mOsm的阈值，就不会影响细胞因子的分泌。较高的渗透压导致促炎细胞因子(白细胞介素-8，白细胞介素-6，白细胞介素-1 β和肿瘤坏死因子- α)[1]的分泌。

据报道，高渗透压可诱导促炎细胞因子反应。炎症似乎是蛋白质磷酸酶2A甲基化转变的简单结果，它反过来激活核因子-kappaB (NF-kappaB)。炎性细胞因子的产生导致衰老进程加速[2]。

已知的在非哺乳动物生物和植物中提供渗透保护的制剂包括海藻糖、麦芽糖、蔗糖、palatinose、cello二糖、gentiobose、turanose、山梨糖醇、氯化钙、某些氨基酸(如脯氨酸和谷氨酸)、α - d -甘露吡喃糖基-(1→2)- α - d -glucopyranosyl-(1→2)-甘油、二肌肌醇1,1'-磷酸，N(gamma)-乙酰-2,4-二氨基丁酸，ectoine，甘氨酸甜菜碱，肉碱，哌果酸，二甲基磺酰丙酸，二甲基磺酰乙酸，蛋白胨，牛磺酸和taltriide[3]。

此外，蔗糖、海藻糖、麦芽糖、纤维二糖、龙舌兰二糖、turanose和palatinose被报道为Sinorhizobium meliloti非常不寻常的渗透保护剂，因为这些化合物不像其他细菌渗透保护剂，在盐胁迫下的s.m uliloti细胞中不作为胞浆渗透物积累。相反，这些化合物在早期指数生长过程中被分解，并有助于提高两种内源性合成的渗透物质的胞质水平:谷氨酸和二肽n -乙酰谷氨酰胺[4]。

最近，在高渗透度生长的菌落中生长的Sinorhizobium Meliloti中发现二肽N-乙酰戊酰氨基氨基胺酰胺，随后被证明是由渗透压攻击细菌合成和积累的。该近期的研究表明，上述代谢产物二肽可用于治疗人体皮肤衰老[5]。据报道，谷氨酰胺基谷氨酰胺酰胺和N-乙酰戊酰胺基酰胺酰胺在典型的水性局部制剂中具有差的稳定性。

一种新的谷氨酰胺二肽衍生物，N-癸酰- l-谷氨酰胺(N²-Decanoyl-L-glutaminyl-L-glutamamide;DGGA, Formula I，)，最近被报道为一种抗衰老剂，治疗皮肤老化[6]。通过对这种新化合物[7]的基因表达检测，通过其作为渗透保护剂和细胞抗衰老剂的功效，揭示了其在局部治疗皮肤衰老方面的新的潜在应用(图1)。

图1所示。DGGA，公式I

材料和方法

对DGGA与对照进行了基因表达测试(genmarker LLC(2013))，以评估这种新型仿生肽在局部应用中可能的皮肤有益属性。

研究总结

该研究的目的是了解局部材料如何影响皮肤中的基因表达。目前使用全厚度在体外皮肤培养模型（MATTEK，EPIDERM EFT-400）进行的研究进行。将10个PI测试材料（溶解在100％DMSO中的0.1％DGGA）施加到每个试验培养的表面上;培养物返回培养箱，并在申请后24小时收集。在RNATATER中收集组织以进行基因表达分析。使用Taqman低密度阵列（TLDA）格式的验证的Taqman基因表达测定分析基因表达。使用基因级标准皮肤面板进行分析，其含有92个靶基因和四个内源对照基因的测定。将每个基因一式两份测定。

标准皮板试验包括试验材料与未处理对照组的比较。然而，根据基因标记获得的以前的信息，当处理组与适当的对照剂组比较时，结果是“干净的”。基因标记有关于100% DMSO基因表达谱的历史数据。本研究采用两种方法对qPCR数据进行分析:

1.治疗组对未处理对照组（包括在皮肤面板测试中）。

2.治疗组与历史DMSO对照组（无需额外费用）。

实验程序摘要

试验材料的稀释：在基因马克斯人中获得测试材料“DGGA”作为固体颗粒。通过在50℃下将16mg测试材料溶解16mg测试材料来制备100倍的储备溶液。用100％DMSO进一步稀释100倍的储备溶液以产生LX工作溶液。将1x工作溶液在室温下储存。

对待文化:使用校准的移液管将10µL的lx工作液涂抹在每个EFT-400培养物的中心，并使用无菌玻璃撒布器在表面扩散。目视检查每个培养物，以确保测试材料的均匀分布，培养物保持在37°C和5%的CO2下，并在24小时后收集。

RNA隔离:根据制造商对纤维组织的说明，使用Qiagen RNeasy分离试剂盒从EFT-400培养物中分离RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific)测定RNA浓度和纯度。从所有组织标本中分离出高质量的RNA(表1)。

表格1。正癸酰-谷氨酰胺-谷氨酰胺对皮肤益处的基因表达。

cDNA合成：根据制造商的说明，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(应用生物系统)对每个样品生成cDNA。

qPCR处理:PCR反应使用Applied Biosystems 7900HT仪器进行。92个靶基因使用应用生物系统验证的TLDA格式的基因表达分析。所有基因都是双基因。

数据分析：使用相对定量（RQ）方法导入原始数据以进行实时实例化软件V4.2（积分组）以进行分析。在RQ分析的第一步中，靶基因的CT值被标准化为每个样品的内源对照基因的CT值以产生δCT（DCT）。计算DCT值以进行标准化/控制在实验过程中可能发生的样品之间的可变性。三种算法用于确认内源性对照基因的选择;关于用于确定最合适的对照基因的方法的细节在下面的“内源性对照基因选择”部分中概述。未配对的T检验用于将治疗组与适当的载体对照组进行比较。报告基因表达（P <0.05，N = 4）的统计学上显着的变化。

数据报告:Satminer软件报告基因表达的差异作为LogiorQ值，其中阳性值表示增加的基因表达和负值表明基因表达减少。LogiorQ值为1.0相当于基因表达的10倍变化。LogiorQ值为0.3相当于线性折叠变化为2.0。STERMINER的LogiorQ值已被转换为线性折叠变更值，以简化本报告的表和图中的数据解释（请参阅附加的Excel文件，所有LogiorQ值的024-001-Data-21nov2012“）。线性折叠变化值为2.0或更大通常被认为是生物学相关的。

结果与讨论

结果摘要

与未经处理的控制相比，0.1％DGGA：基因表达的变化被报道为治疗组和载体对照组之间的线性折叠变化差异。正值表示基因表达增加;负值表示基因表达减少(表2)。

基因	24小时足球俱乐部	调节与治疗的方向
MMP9.	-4.19	下来
AQP3.	-2.30	下来
KRT1	-2.08	下来 向上
BMP2	2．00	向上
LCE3D	2.12	向上
PTGS2	2.22	向上
IL1B	2.26	向上
蒸机	2.93	向上
118.	3.33	向上
生活	4.88	向上

表2。与未经处理的控制相比，0.1％DGGA

基因	24小时足球俱乐部	调节与治疗的方向
BMP2	-3.98	下来
是	-3.44	下来
FLG.	-2.49	下来
肿瘤坏死因子	-2.19	下来
COL3A1	-2.17	下来
PTGS2	2.08	向上
TP73	2.16	向上
CDSN	2.21	向上
民族解放军	2.24	向上
KRT4	2.38	向上
ICAM1.	2.41	向上
MKI67.	2.54	向上
GSTT1	2.55	向上
Calml5.	2.91	向上
AQP3.	3.13	向上
在你	3.23	向上
mt1a.	4.57	向上
CDKN2A	6.86.	向上
GPX1.	7.19	向上

表3。0.1% DGGA相比100% DMSO车辆控制

0.1% DGGA相比100% DMSO车辆控制:基因表达的变化被报道为治疗组和载体对照组之间的线性折叠变化差异。正值表示基因表达增加;负值表示基因表达减少(表3)。

折叠变化值2.0或更大通常被认为是生物学相关的，但在个人护理行业中，营销材料中经常看到1.5的折叠变化值。表1中提供了DGGA基因表达测试数据的概述，因为它们与目标护肤益处相关。

卓越的结果

基因表达数据（表）清楚地表明DGGA提供了一种治疗的局部方法，减少炎症，氧化损伤，炎症，皮肤刺激的局部处理或改善与炎症相关的症状，细胞粘附丧失，脱落丧失，额外的细胞包括结缔组织基质击穿和肤色损失，角质化丧失，细胞衰老，皮肤衰老从细胞衰老，皮肤白度丧失，皮肤屏障损失，皮肤损失，肌肤损失，肌肉损失，皮肤造成的炎症，皮肤毁伤来自玉米饼的皮肤变色，痤疮的炎症，皮肤皱纹和细胞衰老细胞细胞，细胞氧化，皮肤胶原损失，以及局部伤口。

结论

DGGA通过管理各种生物途径提供了一种新的局部护肤方法，包括素质发生，细胞炎症，自由基和其他氧化损伤，衰老和皮肤衰老。

参考

1. Schwartz L, Guais A, Pooya M, Abolhassani M(2009)炎症是细胞外高渗的结果吗?J Inflamm (Lond)6: 21。(Crossref)
2. Abolhassani M1，Wertz X，Pooya M，Chaumet-Riffaud P，Guais A等。（2008）高摩托度通过蛋白质磷酸酶2a的甲基化引起炎症。充气res.57: 419 - 429。(Crossref)
3. (in chinese)绿脓杆菌对渗透胁迫的适应。申请环境微生物59：473-478。(Crossref)
4. Gouffi K, Blanco C(2000)渗透保护剂的积累是细菌渗透保护的独特机制吗?int J Food Microbiol55：1-3。(Crossref)
5. Sagot B1, Gaysinski M, Mehiri M, Guigonis JM, Le Rudulier D，等(2010)。二肽n -乙酰谷氨酰胺的渗透诱导合成是由细菌中保守的新途径介导的。美国国家科学院学报107: 12652 - 12657。(Crossref)
6. Gupta S，Walker L（2012）通过天然肽复合物预防哺乳动物的细胞衰老，美国帕特。8,212,876.（2012年7月3日）;8258343年(2012年9月4日);8293943年(2012年10月23日)。
7. Genemarkers LLC（2013）基因表达分析在测试材料处理24小时后用测试材料处理的全厚度厚度。项目报告024-001（2012年11月21日）。Genemarkers，126 E.南街，美国密歇根州，美国。