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摘要

背景

核苷二磷酸激酶(NDPK)被描述为NM23，一种转移抑制因子，在癌细胞株的培养基中被发现，这表明该激酶可能具有细胞外作用。我们认为乳腺癌细胞外NM23释放在活的有机体内刺激肿瘤细胞迁移、增殖和内皮细胞血管生成，支持转移发展。

方法

ELISA法检测携带人三阴性乳腺癌的免疫缺陷小鼠或乳腺癌患者血流中NM23的含量。原发性和转移性肿瘤的发展，NM23的封锁和/或它对核苷酸受体的刺激的影响被测量在活的有机体内成像。我们检查了Curtis乳腺癌数据集中的NM23表达数据，以检验我们的假设，即NM23可能在乳腺癌发展中发挥机制作用。

结果

携带转移性MDA-MB-231Luc的SCID小鼠⁺三阴性人乳腺肿瘤细胞修饰NM23进入循环与原发肿瘤生长相关。用NM23抑制剂鞣花酸(EA)或嘌呤能受体拮抗剂MRS2179治疗小鼠可以减缓原发肿瘤的生长。植入后16周，EA、MRS2179或联合治疗的小鼠肺转移减少。在Curtis乳腺数据集中NM23的表达证实了NM23在肿瘤转移中的可能作用。

结论

细胞外NM23可能是乳腺癌的生物标志物和治疗靶点。

关键字

乳腺癌，NDPK, NM23, P2Y1受体，SCID小鼠，肿瘤生长，转移

简介

乳腺癌细胞在形成侵袭性转移之前就会迁移到身体较远的部位，因此可以保持休眠状态。原发肿瘤切除后不久会出现肿瘤转移[2,3]。假设细胞在手术过程中没有“脱位”，这是一个在智力上不受欢迎的概念，我们有理由将其作为辅助治疗时远处转移存在且惰性的证据，而这些细胞在未来某个时间(可能是手术后数年)发生从静止生长到活跃生长的变化。我们不知道疾病传播背后的确切细胞行为，是否通过淋巴或血液，但血管内渗、外渗和血管生成是早期的事件，是形成转移性病变的必要条件。

乳腺癌特异性死亡率几乎完全是转移[4]的功能。如果细胞没有扩散，乳房切除术，如果没有乳房肿块切除术可能治愈乳腺癌。肿瘤细胞作为转移瘤的生长决定了肿瘤细胞必须首先进入血流，它们大量进入，然后进入组织空间，如肺，并在多次潜在的命运中存活下来。因此，这些都是罕见的事件。决定细胞向远处扩散能力的是上皮向间充质转化(EMT)的去分化[7,8]，该过程由转化生长因子b[9]促进。

NME1和NME2基因的产物(又名.， NDPK-A和NDPK-B)作为核苷二磷酸激酶，通过将g-磷酸从核苷三磷酸(NTP)如ATP或GTP共价转移到核苷二磷酸受体(NDP;如ADP)。当磷酸基供体是ATP时，这可能被视为徒劳的转化，其结果是维持酶环境中的ADP水平。在血流中，这意味着核苷酸浓度在时间和空间上保持不变。这是循环NM23唯一已知的功能，而细胞内NM23同工酶已被证明具有组氨酸激酶[11]、转录激活剂和外切酶[12]的作用。在[13]发育过程中，NM23的细胞外作用在细胞指导中发挥作用。细胞内NM23作为一种转移抑制因子的最初描述[14,15]得到了相当多的关注，但我们实验室和其他实验室也出现了例外[16-21]。我们的数据表明，在乳腺癌中，只有Nm23的转移抑制作用可能不是这样的，而且，Nm23的细胞外作用与整体细胞表达和其他[22]的重点细胞内信号传递是不同的。当乳腺肿瘤细胞将NM23的NDPKinase活化进入血液时，NM23的NDPKinase活性有助于维持ADP水平，否则ADP会迅速转化为腺苷。

尽管细胞外NM23在促进转移中的作用仍有争议，但癌细胞条件培养基和纯化NDPK促进血管生成的能力在体外已经确定[19,21]。许多乳腺癌细胞系都能表达NM23，而正常的对应细胞[21]则无法表达。NM23的胞外作用可能与血管内皮细胞生长因子(VEGF)信号通路有关。VEGF被确定为emt相关因子[7]。在VEGF[21]缺失的情况下，NM23可激活VEGF受体(VEGFR)，提示NM23在EMT中发挥作用。此外，NM23结合并激活细胞表面受体MUC1[23]，影响干细胞生长，促进跨内皮迁移，与内渗和外渗[24]一致。因此，仅将NM23视为一种转移抑制因子[25]与其细胞外作用的显著证据不一致。同样清楚的是，当细胞外细化时，仅将NM23视为血管生成因子也提供了不完整的图像[26]。通过使用哺乳动物和非哺乳动物血管生成模型，Wieland的研究小组认为，NM23 (nddp - b)是VEGF诱导的血管生成所必需的，并有助于VEGF受体2型和ve -钙粘蛋白在内皮粘附连接处的定位。这些作者将他们的发现解释为NDPK-B在正常和病理模型中的细胞内而不是细胞外作用。 We suspect that these data are indicative of normal processes that are aberrantly regulated in disease.

为了进一步了解NM23在乳腺肿瘤发展中的作用，我们使用了携带原位人乳腺癌的免疫缺陷SCID小鼠。MDA-MB-231人类三阴性肿瘤细胞被改造成表达荧光素酶，允许在小鼠中对肿瘤生长和转移进行纵向评估。如果细胞外Nm23在局部血管生成发育中起作用，如果Nm23出现在血流中，则阻断细胞外Nm23的激酶作用或阻止内皮P2Y上ATP/ADP的作用₁受体会影响MDA-MB-231Luc的活性⁺在小鼠体内形成肿瘤和转移的细胞。

材料和方法

人乳腺癌小鼠模型

荧光素酶2 (lucc⁺)表达人类癌细胞(Caliper Sciences, Hopkinton, MA)被注射到雌性SCID小鼠乳腺脂肪垫中以建立原发肿瘤。MDA-MB-231S细胞的荧光素erase标记子系指定(231-Luc⁺)允许肿瘤成像和转移追踪。mda - mb - 231 -卢克⁺细胞在含有10%胎牛血清的Eagle 's Minimum Essential Medium (MEM)中培养，37℃，5% CO₂．用胰蛋白酶(0.05%)收集细胞，用无氯化钙和氯化镁(sigma, MO)和2.5×10的冷无菌PBS洗涤两次⁶细胞与Matrigel (Sigma, MO)混合50:50 (v/v)并注射南卡罗来纳州4到6周大的雌性CB-17 SCID小鼠的乳腺脂肪中。实验得到了内华达大学里诺分校动物保护和使用委员会的批准。

血液采集

每隔两周，穿刺小鼠颈静脉，采血100-125 μl。妇女血清样本从国家疾病研究交流中心(NDRI)或当地irb批准的知情同意下获得。血液在血清分离管(Becton Dickinson, USA)中室温凝结1-2小时。血清在6,000×g离心10分钟后立即用于实验或保存在−80°C备用。

间接酶联免疫吸附试验(ELISA)

用酶联免疫吸附法(ELISA)检测分泌的人NM23蛋白，采用NM23同工酶非特异性抗体识别人NM23蛋白．96孔板(Corning, NY)涂有重组NM23蛋白作为标准样品(Abnova，台湾)，或血清测试蛋白(实验性)。标准Nm23样品在0.03 ~ 100 ng/mL磷酸盐缓冲盐水(含0.05%叠氮化钠)中使用;将50 μ l的等分物加入孔中，板在室温(RT)下孵育2小时，然后在4℃下过夜^°C用慢速振动筛。加入含5% BSA和0.05% ten -20的磷酸盐缓冲盐水(PBST 0.05%)闭塞缓冲液(100µl)，在rt下孵育1.5小时。然后用150µl的PBST冲洗1次，用含有1 mM EDTA和0.25% BSA(100µl)的PBST缓冲液稀释的小鼠抗nm23抗体(Abcam, Cambridge, MA USA)孵育2小时，37℃慢摇，然后用150µl的PBST冲洗3次。用兔抗小鼠IgG孵育培养皿辣根过氧化物酶(HRP)共轭(Southern Biotech, Birmingham, AL)在37°C下缓慢摇动2小时，并用PBST洗涤3次。通过添加100 μ l的邻苯二胺二盐酸盐底物(Sigma St. Louis, MO)来开发平板，并使用微板阅读器在490 nm处测量吸光度。

患者血清中NM23的测定

我们从癌症患者(NDRI, Philadelphia, PA, USA)和对照样本(无癌症或慢性疾病史)中获得，对照样本来自UNEVX实验室(Dr. V. Lombardi)，该实验室收集了确诊为肌痛性脑脊髓炎的女性患者的血清样本。这些样本被用来评估NM23在乳腺癌患者血清中出现的可能性，这是其特定疾病的结果。NM23患者采用ELISA检测，方法如上。

原发肿瘤形成的检测

小白鼠注射南卡罗来纳州在颈部有荧光素酶底物d-荧光素。小鼠在iacuc批准的方案下麻醉20分钟，然后使用Caliper Lumina II IVIS仪器(Perkin Elmer, Waltham, MA)对肿瘤进行20秒成像。每隔一周复查一次，监测肿瘤生长情况。使用卡钳测量和IVIS光谱数据分别测量肿瘤的平均体积和平均肿瘤生物发光，以确定原发肿瘤发展的时间线。用卡尺计算肿瘤体积大小，计算公式为肿瘤体积(mm)^3.)=[长度(毫米)]x[宽度(毫米)]²0.52 x。当原发肿瘤达到约2000 mm时处死小鼠^3.体积(~16周)。深部组织转移的成像需要动物重新定位(腋窝淋巴结)，对于早期肺转移的时间点来说不如直接切除器官和成像可靠。在实验结束时，动物被安乐死，并选择组织进行分析体外成像并进行后续组织学检查。

人分泌NM23的免疫印迹

为了从携带人类肿瘤的小鼠中检测人类分泌的NM23，将血清样本在4˚C下浓缩30分钟，并使用AmiconÒ Ultra-0.5 10 kDa离心过滤器(Millipore, Bedford, MA)在2000 0xg下离心。用免疫印迹法分析浓缩样品中NM23蛋白的分泌情况。蛋白质在SDS-PAGE凝胶上分解，转移到硝化纤维素膜上，与抗nm23小鼠单抗(Abcam, Cambridge, MA)在4˚C下孵育过夜。与Alexa Fluor 680偶联的二抗体(Invitrogen, Carlsbad, CA)在1:1奥德赛阻断缓冲液(Licor Biosciences, Lincoln, NE)和含0.1% Tween-20 (v/v)的PBS中孵育膜。使用奥德赛红外成像系统(V2.04)检测波段。为了确定NM23是否通过MDA-MB-231Luc分泌进入小鼠循环⁺肿瘤细胞是这种细胞类型特有的，或者是一种更普遍的现象，我们从携带炎症性乳腺癌[27]和原发性肺腺癌细胞[28]的Mary-X肿瘤的动物血清中取样。

rt - pcr

为了确定原发肿瘤中细胞内人类NM23的mRNA水平，使用Mag MAX-96总RNA分离试剂盒(Ambio, Foster City, CA)提取总RNA，并使用SuperscriptII (Invitrogen, Carlsbad, CA)和随机六重引物(Invitrogen, Carlsbad, CA)反转录。在Go Tag聚合酶(Promega, Madison, WI) PCR中使用hNDPK-B的特异性引物[5 ' - ACC TTC ATC GCC ATC A -3 '(有意义)和5 ' - AAT CCT GTT GCC TCT AA -3 '(反义)]。β-肌动蛋白作为阳性对照。使用FluoroChem 5500 (Innotech®)成像系统和软件进行标准终点逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析。

用体外生物发光检测转移性肿瘤

在尸检(16周)时采集肺组织，检测生物发光体外成像。简单地说，将肺组织分别放入24孔板的孔中。在Krebs缓冲液中加入荧光素(300 μg/ml)覆盖组织，然后在20、30和40秒用Lumina II IVIS仪(B级/FOV 15 cm)成像。

MRS2179和鞣花酸(EA)的治疗

老鼠mda - mb - 231 -吕克·轴承⁺肿瘤直径100-200毫米^3.随机分为5组，每组6只动物(第1组，未处理;组2,MRS2179采用微渗透泵;第三组，饮用水中的鞣花酸;组4,EA和MRS2179;第5组，小渗透泵应用内皮抑素)。我们植入微型渗透泵(ALZETä Technical Services, Cupertino, CA)给2组和4组注射MRS2179 (200 μM/天)。泵容量为100 μl，以0.11 μl/hr的速度连续给药30天。第28天，所有的泵在无菌条件下拆卸，并更换为新的泵。每隔28天更换一次泵，直到对照组肿瘤达到末端大小(2000毫米)^3.在我们的设计中，~16周)。首先在4只小鼠身上试验EA和MRS2179化合物的毒性，分别从30、60和120 μg/ml的饮用水(每只小鼠每天5±0.7 ml)和每天腹腔注射100 ul的MRS2179 AT 100、150、200 μM开始，为期2个月。未观察到明显的毒性或异常(数据未显示)。肿瘤生长抑制(TGI)通过比较肿瘤平均体积(mm)的减少来确定^3.)和对照组和治疗小鼠在原发和转移部位的平均肿瘤生物发光。肿瘤转移抑制(TMI)在尸检时通过直接生物发光检测肺。

基因表达分析

公开的Oncomine数据库(www.oncomine.org)用于评估乳腺肿瘤亚型和正常组织[29]的Curtis乳腺数据集11中的NM23 mRNA表达。乳腺癌肿瘤按癌症类型和日志分类₂比较NM23的表达。用Kaplan-Meier图评价Affymetrix ID: 201268_at在乳腺癌中的预后价值(www.kmplot.com)．样本按NM23中位数表达进行分离。在所有样本中收集该基因的归一化基因表达水平，并计算中位数(数字排序后的中间标记)。表达高于中位数的称为“高”，表达低于中位数的称为“低”。这些队列的规模相当。

统计分析

使用InStat统计软件(V3.0;GraphPad软件公司，西雅图，华盛顿州)。所有实验均采用方差分析(ANOVA)进行正态性检验，p≤0.05被认为是显著的。数据点和误差条表示均值±S.E.M.。Kaplan-Meier图的显著性由km图[30]生成。

结果

人乳腺癌细胞分泌的NM23在小鼠中的表现

我们已经证明，转移性人乳腺癌细胞在培养时分泌/脱落NM23到周围环境中在体外这个细胞外的NM23起到反式磷酸化酶[21]的作用。此外，我们还证实了细胞外NM23促进内皮细胞迁移、增殖[21]和小管形成在体外(18、19)。细胞将NM23作为一个磷蛋白合成到细胞外环境中，在那里酶能够将一个磷酸化基团转移到核苷二磷酸受体上通过一种高能磷酸组氨酸中间体[31,32]。我们的基本假设是，在具有原位人乳腺肿瘤的免疫缺陷小鼠中，肿瘤细胞将细化NM23。分泌的NM23有助于维持有利于血管扩张的ATP/ADP水平，促进毛细血管的形成，允许血管内渗、外渗和血管生成，通过模拟正常的diapedesis[33]机制支持原发肿瘤的生长和转移。

在肿瘤细胞放置前和此后每隔2周收集一次小鼠血液，直到第16周，血液中NM23水平不断升高(图1a)。生物发光数据与人工肿瘤体积测量相关(r²=0.92)与预期一致(图1b)。肿瘤生物发光与NM23细胞外形态呈正相关²=0.85(图1c)，这表明肿瘤发展过程中血清中人类NM23的存在与NM23刺激肿瘤生长的作用相一致。这些结果也与肿瘤生长增加导致NM23分泌增加从而形成一个潜在的正反馈循环的假设一致。

图1．携带MDA-MB-231Luc+肿瘤的SCID小鼠中NM23的分泌检测。在肿瘤细胞放置前，每隔2周收集一次小鼠血液，直到第16周。对照组(方号)只注射稀释剂(n=4只小鼠)。ELISA法测定血清中NM23的分泌量(n=24只小鼠)。(a)在携带乳腺癌细胞的小鼠中，从第一个时间点(~400 ng/ml)到第16周(~924 ng/ml)测量血清NM23。(b)原发肿瘤生长由平均肿瘤体积和使用无创体内成像(Caliper, Lumina II®)的生物发光随时间变化(每隔一周进行一次，共16周)来测定。(c)平均肿瘤体积与平均生物发光之间的相关性为r2=0.92。

我们通过Western blot分析证实了分泌的NM23在携带人类肿瘤的小鼠血清中的表达(图2a)。我们发现细胞外NM23同工酶(~17和19 kDa)在携带人三阴性炎症性乳腺癌(Mary-X)和支气管肺泡癌(BAC)异种移植瘤的裸鼠(nu/nu)和携带MDA-MB-231Luc的SCID小鼠样本中均有表达⁺肿瘤(图2a通道4-6)。对照组小鼠浓缩血清中未检出NM23。重要的是，我们在乳腺癌女性的血清中检测到了NM23(图2,P1-4通道)，然而在健康女性中没有检测到细胞外NM23的表达(通道V1,2)。

图2。健康女性、乳腺癌患者和人类癌症小鼠模型血清中的NM23。Western blot检测NM23在患者对照(V1-2)、携带炎性Mary X乳腺癌(M-X)、细支气管肺泡癌(BAC)和人三阴性MDA-MB-231肿瘤(231)的小鼠中进行检测。在转移性乳腺癌患者的血清中也测定了NM23 (P1-4)。Blots是多个实验的代表。

这些数据与我们之前的观察一致，NM23不由非致瘤性MCF-12F乳腺上皮细胞[21]分泌。测量携带Mary-X和BAC肿瘤的动物在16周采样时的肿瘤中NM23 mRNA表达量(图3a)和血清中NM23水平(图3b)，表明这些肿瘤表达高水平的NM23信使RNA，并分泌NM23。

由于细胞内NM23表达已经被用来定义NM23作为一种转移抑制因子，我们探索了与没有乳腺癌证据的患者相比，乳腺癌患者中NM23 mRNA表达是否上调。使用公开的乳腺癌基因表达Miner[29]检测Curtis乳腺癌数据集中的NM23表达。数据显示，与健康女性相比，乳腺肿瘤患者NM23 mRNA表达上调(图4a, 4b)。

图3。异种移植瘤小鼠NM23及NM23 mRNA表达的检测

• NM23 mRNA在原发肿瘤和(b)携带MDA-MB-231、炎症性Mary-X或细支气管肺泡癌(BAC)小鼠血清中的表达。数据为平均值±SEM, n=4-6。* * = * = p < 0.05, p < 0.01。

图4．NM23在Curtis乳腺数据集中的表达

使用公开可用的数据库Oncomine评估(a) NDPK-A和(b)在Curtis乳腺数据集中(1992)例乳腺癌样本和(144)例正常乳腺样本中的NDPK-B mRNA表达。对乳腺基因组和转录组结构数据集的微阵列进行访问，包括1=正常乳腺(n=144)， 2=乳腺良性肿瘤(n=3)， 3=乳腺癌(n=14)， 4 =乳腺叶状瘤(n=5)， 5=原位乳腺导管癌(n=10)， 6=浸润性乳腺癌(n=21)， 7=浸润性导管癌和浸润性小叶癌(n=90)， 8=浸润性导管癌(n= 1556)， 9=浸润性小叶癌(n=148)， 10=髓质乳腺癌(n=32)，11=黏液性乳腺癌(n=46)， 12 =管状乳腺癌(n=67)， n=样本数。日志₂NDPK-A/B (NM23)表达水平的中心比值用盒状图和须状图表示。点表示最大和最小异常值。数据集在第95百分位通过异常值分析进行排序，并按癌症类型分组。(c, d)利用公开的乳腺癌临床数据库绘制乳腺癌患者Kaplan-Meier生存曲线。乳腺癌患者按NDPK-A/B的高表达和低表达进行分组。NM23水平，中位随访时间为12年。图中显示患者总生存概率(c)和无复发生存概率(d)。采用Log-Rank检验分析生存差异，*P<0.01与对照组比较。

NM23表达增加与总体生存率降低和无复发生存率相关

我们进一步使用Kaplan-Meier图[30]检验中位NM23 (NDPK-A/B) mRNA表达水平与总生存期和无复发生存期的相关性。重要的是，与NM23表达水平较高的乳腺癌患者相比，NM23表达水平低的乳腺癌患者的总生存率和无复发生存率显著延长(图3c, 3d)。综上所述，这些结果符合我们的假设，即NM23是人类乳腺癌转移的关键调控因子，细胞外核苷酸激酶与乳腺癌患者不良预后相关。

我们认为，如果NM23是从植入小鼠的乳腺癌细胞中衍生并出现在血清中，并且在乳腺导管癌患者血清的Western blots中可见(图2)，那么可以在乳腺癌患者血清中通过ELISA检测。我们从UNEVX实验室(V. Lombardi博士)获得了去鉴别的血清样本，这些样本来自癌症患者(NDRI)和对照样本(无癌症或慢性疾病史)，UNEVX实验室从诊断为ME/CFS的女性患者中收集了血清样本。这些样本是评估NM23在乳腺癌患者血清中出现的可能性的第一步(表1)。我们的数据表明，NM23在患有乳腺癌转移的女性患者的血液中循环，但在患有不相关慢性疾病(ME/CFS)的性别控制人群或无已知疾病的患者(对照组)中不存在。此外，低水平的NM23在导管癌患者中可见原位(表1)。

病人
数量的科目	NM23 (ng / mL血清)	年龄(平均值±SEM)	诊断
10	0.02±0.01	32±3	控制
4	54.2±22.3	41.75±14	骨转移
9	74.28±7.5	56±4.4	肺转移
7	6.2±2.1	50±2.7	原位乳腺管癌
8	0.6±0.02	47±6.4	我交货

表1。乳腺癌患者血清中NM23的测定

ELISA测定数据为均数±SEM NM23。诊断是基于临床病史。

导管原位癌。肌痛性脑脊髓炎/慢性疲劳综合征

NM23抑制/P2Y的效果₁受体拮抗剂对SCID小鼠肿瘤形成的影响

由于细胞外NM23可预期维持血流中ATP/ADP的水平，我们提出细胞外NM23通过激活内皮嘌呤核苷酸受体P2Y发挥作用₁．该受体表现为ADP、>、ATP的激动剂等级，不受腺苷的影响。鞣花酸(EA)已知可以抑制nm23活性[34]，并被证明具有抗血管生成的作用[35,36]。MRS2179是一种有效的内皮细胞P2Y₁受体拮抗剂[37]。我们将MRS2179(200µM)和内皮抑素(200 mM)通过微渗透泵(0.11µl/hr)和饮用水中EA(120µg/ml)连续应用于携带MDA-MB-231Luc的SCID小鼠⁺肿瘤。通过测量肿瘤体积和非侵入性检测原发肿瘤生长情况在活的有机体内成像(新)。在第16周，治疗组的肿瘤体积明显减小，显示出抑制肿瘤生长的治疗效果(图5;2日set-EA;第三集——MRS2179;4^thMRS2179+EA的set-combination)，分别降低了60%、65%和68%(图6)。这些治疗与作为阳性对照的内皮抑素的效果相当(图6)。当对这些影响进行纵向研究时，发现随着时间的推移，治疗可以减少原发肿瘤的生长(图6)。内皮抑素在11周时减少了73%的原发肿瘤生长，与EA和MRS2179联合治疗的效果相当，后者在同一时间点减少了69%的原发肿瘤生长(图6插入)。

图5．P2Y1受体阻滞剂或NM23拮抗剂可显著抑制肿瘤形成在活的有机体内．一旦MDA-MB-231Luc+原发肿瘤在SCID小鼠中达到100-200 mm的体积^3.渗透泵皮下植入(背背)，以输送200 mM MRS2179或内皮抑素(泵内容积100 μl)以0.11μl/hr的速率连续输送药物30天(MRS2179和内皮抑素均为26.4 pg/g /day)。EA以120 μg/ml (~34 mg/g /day)的剂量加于饮用水中。每周测量肿瘤体积和肿瘤生物发光，以评估抗肿瘤抑制剂的效果(n=8只小鼠/组)，图像显示16周时原发肿瘤被生物发光活性抑制，与对照组(未治疗)相比，16周时原发肿瘤被生物发光活性抑制。

图6．P2Y1受体阻滞剂或NM23拮抗剂可显著抑制肿瘤形成在活的有机体内．
在如图5所示的单独实验中，6只动物/组，测定了内皮抑素、EA、MRS2179或联合用药对肿瘤体积的影响。插图:对照数据与内皮抑素治疗的比较。

NM23抑制/P2Y的效果₁受体对SCID小鼠肿瘤转移的拮抗作用:

我们通过MDA-MB-231Luc成像检测转移⁺细胞荧光素酶活性体外在携带MDA-MB-231Luc的小鼠的肺中⁺该方法允许在去除直接成像的肺后，通过生物发光对肺转移进行定量评估。正如预期的那样，在第16周，数亿次计数显示明显的肺部肿瘤形成(图7)。如图所示，治疗显著减少了肺部的转移负担。MRS2179和EA治疗均可显著降低肺转移负担(图7)，EA比MRS2179更有效。MRS2179/EA联合治疗进一步降低，与内皮抑素治疗观察到的类似。

图7。MRS2179和EA对MDA-MB-231转移病灶的抑制。16周时，处死小鼠，取肺、肝和胰腺组织并成像观察荧光素酶活性。日志₂每组6只动物肺组织测定生物发光。MRS 2179 (MRS)、鞣花酸(EA)及联合治疗可降低转移瘤负担。每个治疗组的转移病灶的代表性图像显示。数据为均值±SEM, n=6-8;* p = < 0.05, * * p = < 0.01。

讨论

在这里，我们研究了细胞外NM23的作用，它似乎与细胞内激酶[25]的表达非常不同。NM23出现在培养的乳腺癌细胞的条件培养基中是无可争议的[38,39]。这种多功能蛋白有十种亚型[40,41]，已知只有两种(ndpak - a和-B)出现在乳腺癌患者的细胞外[21]中。NM23分布在细胞质、线粒体、质膜和[42]核中。NM23最初被描述为n在- - - - - -米etastatic23在小鼠黑色素瘤细胞中发现的基因与果蝇同源awd蛋白质。基因表达被认为与转移潜能[14]呈负相关，尽管不是完全相关[43-45]。然而，很少有人注意到NM23在维持血流中ATP/ADP水平方面的酶促功能。尽管如此，循环嘌呤核苷酸在局部调节血流[46,47]和调节血小板聚集[48]的能力是已知的。

虽然我们在近十年前就证明了细胞外NM23[18]的血管生成活性，最近又证明了NM23激活血管内皮生长因子受体以支持[21]的血管生成，但NM23的这些作用最近在在活的有机体内Weiland组[26]的血管生成模型，尽管这些作者没有区分激酶在细胞内和细胞外的作用。然而，NM23现在在癌症生物学中具有重要的意义;细胞外NDPK-A是肾细胞癌[49]的诊断性生物标志物，表达增加与胰腺癌[50]相关。这些作者证明了NM23 (NDPK-A)表达与较差的总生存率相关。也有研究表明，细胞内NM23 (NDPK-B)在肝细胞癌中过表达，NDPK-B shRNA在异种转质肿瘤[51]中抑制肿瘤生长。

只关注NM23基因表达之间的相关性;细胞失活，或突变酶在细胞内的表达与癌症预后，我们错过了细胞外NM23在预测乳腺癌进展为惰性疾病的可能性方面的额外作用。我们在此展示的工作记录了植入小鼠的人乳腺癌细胞NM23的细胞外分泌，以及我们早期的工作证明了NM23的血管生成效应和它反式激活VEGFR2的分子基础，为理解NM23作为肿瘤发生中的细胞外信号的重要性奠定了基础，并可能在转移龛中提供生存因子。我们的数据不一定反驳细胞内NM23作为一种转移抑制因子的作用，而是扩展了对细胞外NM23作用的机制理解。

在血流中保留嘌呤核苷酸与ATP/ADP水平激活内皮嘌呤能受体(P2Y₁R). P2YR被认为是致癌和内皮细胞功能的调节因子，是血小板聚集和血流调节的调节因子[10,53]。细胞外ATP和ADP激活内皮细胞P2Y₁受体释放血管活性介质，如一氧化氮、前列环素和额外的ATP[10,47]，以引发血管松弛剂、增殖和血管生成效应[54]。人类内皮P2Y₁受体反式激活内皮VEGFR-2，表明细胞外核苷酸生成和生长因子信号[21,26,55]之间存在直接联系，这符合我们的假设，因为在没有VEGF的情况下，鞣花酸抑制nm23将阻止VEGFR-2的激活，正如我们[18,21,34]和其他人[56]所显示的那样。

细胞外NM23在转移过程中的作用是由CD39的破坏所支持的。EC3.6.1.5)是一种主要的血管外核苷酸酶，已被观察到可抑制肿瘤血管生成和转移[57,58]。这将导致毛细血管中ADP水平降低，P2Y降低₁R激活。正如我们在这里记录的，人乳腺癌细胞植入免疫缺陷小鼠的乳腺脂肪分泌血清中可测到的NM23。我们认为，NM23通过内皮细胞激活使转移小生境可接受，并通过支持[21]的播散和血管生成来预测进展为惰性疾病的可能性。服用氯吡格雷(一种血小板P2Y)的妇女没有证实我们的假设₁₂拮抗剂[59]不能阻断内皮细胞P2Y₁受体。

通过收集原发肿瘤生长不同阶段的血液，我们确定NM23水平从肿瘤形成的第一个时间点开始就很高，并在第16周有急剧积累的趋势(图1)²=0.85)的NM23分泌与肿瘤大小之间的关系与其在转移进展中的作用相一致(图1C)。乳腺癌患者血清中发现了NM23(图2)，转移性乳腺癌患者血清中NM23水平升高，DCIS患者血清中NM23水平较低，而非癌症患者血清中几乎没有NM23。我们认为乳腺肿瘤细胞修饰NM23可能是一种普遍现象。我们发现，在nu/nu免疫缺陷小鼠中，NM23存在于携带Mary-X[60]型炎症性乳腺癌细胞和细支气管肺泡细胞癌(BAC)的小鼠血清中(图3b)。在血清中NM23蛋白和肿瘤中mRNA表达的比较中，我们没有观察到明确的相关性(图3)，尽管Mary-X肿瘤中最高的信息表达与血清中发现的最高水平相吻合。在携带Mary-X或BAC肿瘤的动物血清中发现NM23水平，以及在支气管系统肿瘤患者的支气管灌洗液中发现NM23的相关性[61]是，细胞外NM23可能在其他癌症的肿瘤发生中发挥作用。

我们的数据得到Oncomine数据库的支持，显示NM23 mRNA表达上调与乳腺癌患者不良预后呈正相关(图4a,4b)。NM23 mRNA表达也与乳腺癌患者较差的总生存期和无复发生存期密切相关(图4c,4d)。考虑到NM23对VEGFR细胞外转激活的影响，而VEGFR是乳腺癌血管生成和转移的基础，我们的数据表明NM23可能是乳腺癌治疗的一个靶点。如果乳腺癌患者中基因表达的增加意味着NM23细胞外表达的增加，那么公共数据库通过提供mRNA表达与乳腺癌的无偏正相关来支持我们的假设，这符合我们在实验乳腺癌和人类乳腺癌患者中检测到的NM23分泌的概念(图1-3)。

能够成像MDA-MB-231Luc⁺SCID小鼠肿瘤中明显显示阻断NM23:P2Y的作用₁随着时间的推移，初发MDA-MB-231Luc⁺用NM23抑制剂鞣花酸[62]或P2Y治疗小鼠可抑制肿瘤₁拮抗剂MRS2179[18]。原发性肿瘤抑制在NM23和MRS2179联合使用后没有明显改善(图6)，可能是因为P2Y中的任何一种₁或NM23封锁也会达到同样的效果。当这些治疗在研究结束时进行比较时，肺转移的存在明显减少(图6)。与内皮抑素相比，已知内皮抑素可防止小鼠转移[63,64]，现在已知其具有atp酶活性[65]，与NM23:P2Y中的作用一致₁R途径，是令人鼓舞的，既提供了比较效益，也表明内皮抑素的机制作用与我们的假设一致。

Acknowlegements

我们的研究得到了美国国立卫生研究院HD 053028和GM 104944的资助，以及比尔和梅琳达·盖茨基金会对ILOB的资助。机构支持由INBRE拨款P20 RR-016464和NIH 8 P20 GM103440提供。SN得到了Mick Hitchcock博士研究基金的奖学金支持。

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