美国，亚利桑那州，罗氏组织诊断公司，Ventana医疗系统公司，Companion Diagnostics制药服务公司
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DOI: 10.15761 / ICST.1000197
随着测序技术的成熟，下一代测序工作流程的需求正在迅速增加，并且作为诊断工具变得更加可行。用尽可能多的信息描述肿瘤特征对于确定对标准治疗反应不佳或可能受益于替代治疗策略的患者群体非常重要。受组织背景的驱动，测序结合特异性标记物的免疫组织化学检测可以提供全面的信息，告知临床医生潜在的治疗途径。我们开发了一个集成的工作流解决方案，该解决方案结合使用IHC、数字成像、FFPE和NGS的自动解剖，以捕获重要信息，推动治疗机会。为了评估工作流程，我们对同一病例的孤立肿瘤区域和全组织切除进行了测序。我们能够证明，从自动解剖获得的样本适合用于NGS工作流程，并且可以提供关于肿瘤特征和其他IHC诊断标记的全面信息。此外，我们发现使用肿瘤ROI的自动解剖可以检测到70%的病例中未被检测到的变异，其中一些是临床可行的。总的来说，这些结果表明，整合CDx是表征特定肿瘤样本的有效方法，有可能在个性化医疗领域识别有效的癌症疗法。
NGS，解剖，辅助诊断
缩写:CDx:伴随诊断，DAB:二氨基联苯胺，DNA:脱氧核糖核酸，FFPE:福尔马林固定石蜡包埋，FOV:变异频率，IHC:免疫组化，NGS:下一代测序，NSCLC:非小细胞肺癌，ROI:感兴趣区域
单一生物标志物的免疫组化(IHC)已被证明是识别患者作为靶向治疗候选人的有效机制。但是，这种方法在范围和应用上都有局限性。单次免疫组化染色显示肿瘤中生物标志物表达的快照，但不能描述完整的情况。通常情况下，患者的肿瘤样本有限，肿瘤异质性非常普遍[1-3]。肿瘤内异质性是指在一个肿瘤内存在多个克隆亚型的肿瘤，并在多种肿瘤类型中被发现是常见的[4-6]。这种异质性会影响治疗反应，包括对药物的耐药性或仅部分反应[5,6]。最近深度测序的发展通过强调遗传异质性支持了这一观点[7,8]。然而，单凭测序，可能会失去组织背景。肿瘤精密解剖已成功应用于处理肿瘤异质性[9]。
这些因素表明，综合诊断将是一种有吸引力的方法来询问肿瘤生长的生物驱动因素，同时保留样本来评估患者的候选性，以进行额外的个性化研究治疗。这一综合诊断途径可以通过结合分子表征和免疫组化染色来确定最佳治疗方案来实现。
在这项“原理证明”研究中，我们评估了基于单一免疫组化染色显示肿瘤内异质性的多个肿瘤病例的分子谱。我们成功地对肿瘤内特定感兴趣区域(ROI)进行了靶向测序。在某些病例中，在测序数据分析的基础上进行了额外的免疫组化染色。总之，我们能够证实，分子数据结合免疫组化数据可以用来充分描述肿瘤标本，并且额外的数据可以影响治疗选择。
人福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织块(非小细胞肺癌、前列腺癌和头颈部癌)取自内部来源。block被去识别，不能与治疗或生存联系起来。
所有免疫组织化学均在Ventana Medical Systems的BenchMark Ultra自动化染色平台上进行，使用OptiView Universal DAB Detection Kit (VMSI, Catalog No. 760-500)。染色前，将4µm切片置于superfrost +玻片上。根据包装插入条件使用Ventana Medical Systems的以下抗体:抗egfr (5B7)兔单抗(790-4347)，抗egfr L858R (SP125)兔单抗(790-4649)，抗her -2/neu (4B5)兔单抗(790-2991)，抗p53 (Bp53-11)一抗(760-2542)。在Ventana Medical System的CAP/CLIA实验室，所有免疫组化染色方案均已验证用于临床标本。肿瘤ROIs由合格的读者注释。在自动解剖之前，将4µm切片安装在载玻片上并进行脱蜡处理。在罗氏自动化解剖平台上进行解剖，roi收集到基于tris的缓冲液中。用切片机从FFPE块上切下的两个20µm卷轴中收集整个切除的组织。
从捕获的FFPE中提取DNA，使用罗氏MagNA Pure 96仪器，使用DNA组织FFPE SV 2.0协议和MagNA Pure 96 DNA和病毒NA小体积试剂盒(罗氏，目录号06543588001)。可扩增的DNA通过罗氏Lightcyler 480和Kapa Biosystem的hgDNA定量和QC试剂盒(Kapa Biosystems，目录编号:No. 4705)进行定量。KK4963)。
采用AmpliSeq/PGM测序技术比较肿瘤谱。从捕获的肿瘤或整个标本中提取DNA，使用Ion AmpliSeq构建TMThermo Fisher的癌症热点小组v2。面板包含207对引物和允许报道的热点地区50基因(ABL1 AKT1, alaska airlines, APC,自动取款机,BRAF,背景,CDKN2A, CSF1R, CTNNB1,表皮生长因子受体,ERBB2, ERBB4, EZH2, FBXW7, FGFR1、FGFR2, FGFR3, FLT3, GNA11,玲娜,GNAQ, HNF1A,极品,IDH1, JAK2, JAK3, IDH2, KDR,装备,喀斯特,满足,一种MPL, NOTCH1, NMP1,国家管制当局方面,PDGFRA, PIK3CA, PTEN、PTPN11, RB1,Ret, smad4, smarcb1, smo, src, stk11, tp53, vhl)。面板和检测条件进行了优化和内部验证。使用10ng的输入DNA，在Thermo Fisher’s ION Chef上，利用AmpliSeq进行文库制备和条形码鉴定TMDL8试剂盒(Thermo Fisher，目录编号;A29024)，并遵循制造商推荐的方案。在ION Chef(软件版本5.0.2)上进行模板制备和芯片加载，使用Hi-Q Chef Kit (Thermo Fisher, Catalog No. 5)。A25948)，集合图书馆的浓度为下午35点。一个318BC芯片使用了最多8个条形码样本。测序采用Thermo Fisher 's Ion Torrent PGM，使用Torrent Suite(软件版本5.0.4)和Variant Caller Plugin进行分析。在分析中使用的过滤器包括≥500X覆盖率和≥1%变异频率(FOV)。
综合诊断方法的发展能够提供有关临床样本的全面信息，以帮助作出治疗决定和预后。我们的集成伴随诊断(ICDx)工作流是一个多步骤的方法，通过对下一代测序(NGS)的深入分析，充分利用了IHC的有效性和上下文优势。在对切片进行主要生物标记物染色后，可在后续未染色的连续切片中通过自动解剖切除感兴趣的肿瘤区域。捕获的FFPE组织经过一个完全自动化的NGS工作流程，包括DNA提取、文库准备和QC。通过对测序结果的分析，可以识别出可能作为肿瘤驱动因素的候选生物标志物和靶向治疗的候选蛋白，从而扩展相关诊断假说，开发新的单一标志物或多重免疫组化检测方法。
基于PTEN、EGFR或PD-L1的免疫组化标记物染色选择roi。原发性标记阴性(PTEN阳性)的肿瘤区域被注释以进行分离。选择这些区域是因为主要标记物不是该肿瘤区域的驱动因素。通过自动化解剖(基于qPCR测量有足够的DNA)从FFPE中分离出的大部分区域在下游的文库准备和测序中使用Ion Torrent PGM成功。从用于分离和DNA提取的初始样本中，10/11(90.9%)通过癌症热点小组在PGM上成功测序。从自动MagnaPure96中分离出的总ROI组织大小、肿瘤类型和产生的DNA量见表1。DNA产量从15ng - 337ng不等，尽管用于分离的区域大小相似。这表明FFPE组织的DNA质量存在变异。测序失败的单个样本为非小细胞肺癌标本，总DNA仅为18ng。
表1。关于ROI和DNA测量的标本细节总结
| 样本 | 标本类型 | 总ROI隔离(mm2) | DNA (ng) | 主要包含IHC标记 |
| 1 | 前列腺癌 | 196 | 57 | PTEN |
| 2 | 前列腺癌 | 240 | 37.5 | PTEN |
| 3. | 前列腺癌 | 256 | 240.0 | PTEN |
| 4 | 前列腺癌 | 245 | 160.0 | PTEN |
| 5 | 非小细胞肺癌 | 241 | 15．0 | 表皮生长因子受体 |
| 6 | 非小细胞肺癌 | 239 | 18．0 | 表皮生长因子受体 |
| 7 | 非小细胞肺癌 | 241 | 78.5 | 表皮生长因子受体 |
| 8 | 等 | 223 | 188.5 | PD-L1 |
| 9 | 等 | 166 | 69.0 | PD-L1 |
| 10 | 等 | 267 | 337.5 | PD-L1 |
| 11 | 等 | 232 | 198.0 | PD-L1 |
无论是对一个分离的ROI还是对同一样本的整个组织进行测序，通常都会得到非常不同的分子谱。样本测序8/10(80%)的增加肿瘤的突变确定ROI比确定在整个标本(表2)。有一些重叠的突变出现在ROI和整个标本,一般为单核苷酸多态性在更高的视场(数据没有显示)。在分离的ROI相对于整个样本中存在的突变中，7/10(70%)的病例在对整个样本测序时未识别的ROI中存在可操作的热点突变。其中包括3例前列腺标本，2例非小细胞肺癌标本和2例H&N标本。
表2。在ROI与整个样本中识别的总变异的总结
| 样本 | ROI单核苷酸多态性 | 整个样品单核苷酸多态性 | 重叠SNPs(一致性%) | 整个标本ROI % |
| 1 | 20. | 8 | 7 (35%) | 21％ |
| 2 | 12 | 10 | 7 (58%) | 15％ |
| 3. | 19 | 14 | 5 (26%) | 17％ |
| 4 | 13 | 7 | 2 (15%) | 16% |
| 5 | 25 | 8 | 8 (32%) | 11％ |
| 6 | N/A | N/A | N/A | 26％ |
| 7 | 26 | 12 | 11 (42%) | 50％ |
| 8 | 10 | 18 | 7 (39%) | 54％ |
| 9 | 16 | 18 | 11 (61%) | 51％ |
| 10 | 8 | 6 | 6 (75%) | 29％ |
| 11 | 17 | 6 | 6 (35%) | 82％ |
在所选ROI的测序图谱中发现了多种突变（图1）。由于ROI是不受初始主要IHC标记物驱动的肿瘤区域，因此对测序图谱进行评估，以确定潜在诊断标记物的其他适应症，这些潜在诊断标记物可通过临床验证的IHC方法进行测试。在4例（40%）的病例中，至少有一种蛋白的异常表达被证实，这些病例的编码基因也有突变。这些基因包括EGFR、ERBB2、EZH2和TP53。在这些病例中发现的并非所有突变都证实了通过IHC染色检测到的相应蛋白的异常表达。
图1所示。利用Thermo Fisher的targeted Cancer Hotspot Panel评估样本ROIs中基因特异性突变的发生。分析包括4例前列腺癌标本，3例非小细胞肺癌标本，4例H&N鳞状细胞癌标本
我们对3例PTEN缺失的杂合子前列腺癌标本进行了注释，并分离出PTEN阳性的肿瘤区域进行了解剖和测序。1例在ROI中发现20个SNPs，包括ERBB2 (FOV = 4.3%)和EGFR (FOV = 36.4%)的SNPs。当对整个组织标本进行测序时，这些突变未被识别出来。随后对前列腺标本进行HER2和EGFR染色，证实在分离和测序的肿瘤ROI中过表达(图2A)。另一个PTEN杂合子前列腺标本被发现有19个snp。EZH2突变(FOV = 3.4%)仅存在于PTEN阳性的ROI中。经染色证实EZH2在分离并测序的肿瘤ROI中过表达(图2B)。第三例PTEN杂合子前列腺标本有12个SNPs, ROI中包含KIT多突变(FOV = 3.2%， 15.2%)。经染色证实，KIT在肿瘤ROI中表达异常(图2C)。
图2。集成CDx工作流的案例示例。突出显示的区域代表被切除并测序的注释的肿瘤区域。(A)抗pten一抗染色的前列腺癌标本，呈异质性染色。突出的ROI显示HER2和EGFR异常。(B)抗pten一抗染色的前列腺癌标本，呈异质性染色。突出的ROI对EZH2异常为正。(C)抗pten一抗染色的前列腺癌标本，呈异质性染色。突出显示的ROI为cKIT异常阳性。(D)抗egfr L858R突变的NSCLC标本，显示异质性染色。突出显示p53存在时ROI为阴性。
对EGFR L858R突变杂合子的肺癌标本进行注释，并对EGFR突变阴性的肿瘤区域进行解剖和测序。病例共发现26个SNPs，其中7个在TP53中，其中6个在整个标本测序时不存在(FOV = 1.7% ~ 35.7%)。染色证实整个肿瘤失去p53蛋白表达(图2D)。
在这项原理证明研究中，我们的ICDx方法在70%的肿瘤病例中成功识别出了可行动的生物标志物。此外，在前列腺癌标本中鉴定HER2和EGFR过表达(图2A)是通过临床验证的免疫组化试验验证可操作标记物的最有力例子，具有指导治疗的潜力。这些测试基于测序结果的数据确定潜在的候选生物标志物。使用这种综合配套诊断方法，患者可以使用抗egfr和/或抗her2药物治疗，这在传统方法中可能会被忽视。随着样本数量的增加，需要进一步的研究来证实这些理论。
对特定roi进行测序以识别潜在可操作突变的重要性可以通过对整个样本与肿瘤roi进行测序时特异性突变的缺失得到证明。总的来说，我们发现在感兴趣的区域使用肿瘤特异性分离允许检测突变，否则在大多数情况下无法检测，其中一些是临床可操作的。通过使用自动化解剖技术，实现了对这些roi的分离，从而实现了精确检测和标准化流程。
在我们CAP/CLIA认可的实验室中，有超过300种IHC检测，可以更快地用靶向测序板对样本进行筛选，以确定可能导致异质癌症形成的潜在标记物。虽然大多数通过测序确定的突变不会导致相应的异常蛋白表达，但我们已经证明，测序数据可以成功地用于提示潜在的感兴趣的生物标志物。这是除了从测序中获得的一般知识，以帮助在分子基础上描述肿瘤，特别是关于肿瘤异质性。
作者:HG进行了萃取、测序和数据分析。NT行免疫组化染色分析。HG起草了手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。
资助:研究是由私人基金支持的。
相互竞争的利益:所有作者都是罗氏集团成员Ventana Medical Systems公司的员工。
2021年版权燕麦。所有权利reserv乔治敦大学医学中心
研究文章
收到日期：2016年6月26日
录用日期:2016年6月28日
发表:2016年7月1日
©2016 Gustafson H.这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可的条款下发布，该条款允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是原始作者和来源被注明。
Gustafson H, Theiss N, Hnatyszyn HJ(2016)用一种整合的伴诊断方法来描述异质性肿瘤特征。整合癌症科学治疗3:DOI: 10.15761/ICST.1000197。
图1所示。利用Thermo Fisher的targeted Cancer Hotspot Panel评估样本ROIs中基因特异性突变的发生。分析包括4例前列腺癌标本，3例非小细胞肺癌标本，4例H&N鳞状细胞癌标本
图2。集成CDx工作流的案例示例。突出显示的区域代表被切除并测序的注释的肿瘤区域。(A)抗pten一抗染色的前列腺癌标本，呈异质性染色。突出的ROI显示HER2和EGFR异常。(B)抗pten一抗染色的前列腺癌标本，呈异质性染色。突出的ROI对EZH2异常为正。(C)抗pten一抗染色的前列腺癌标本，呈异质性染色。突出显示的ROI为cKIT异常阳性。(D)抗egfr L858R突变的NSCLC标本，显示异质性染色。突出显示p53存在时ROI为阴性。
表1。关于ROI和DNA测量的标本细节总结
| 样本 | 标本类型 | 总ROI隔离(mm2) | DNA (ng) | 主要包含IHC标记 |
| 1 | 前列腺癌 | 196 | 57 | PTEN |
| 2 | 前列腺癌 | 240 | 37.5 | PTEN |
| 3. | 前列腺癌 | 256 | 240.0 | PTEN |
| 4 | 前列腺癌 | 245 | 160.0 | PTEN |
| 5 | 非小细胞肺癌 | 241 | 15．0 | 表皮生长因子受体 |
| 6 | 非小细胞肺癌 | 239 | 18．0 | 表皮生长因子受体 |
| 7 | 非小细胞肺癌 | 241 | 78.5 | 表皮生长因子受体 |
| 8 | 等 | 223 | 188.5 | PD-L1 |
| 9 | 等 | 166 | 69.0 | PD-L1 |
| 10 | 等 | 267 | 337.5 | PD-L1 |
| 11 | 等 | 232 | 198.0 | PD-L1 |
表2。在ROI与整个样本中识别的总变异的总结
| 样本 | ROI单核苷酸多态性 | 整个样品单核苷酸多态性 | 重叠SNPs(一致性%) | 整个标本ROI % |
| 1 | 20. | 8 | 7 (35%) | 21％ |
| 2 | 12 | 10 | 7 (58%) | 15％ |
| 3. | 19 | 14 | 5 (26%) | 17％ |
| 4 | 13 | 7 | 2 (15%) | 16% |
| 5 | 25 | 8 | 8 (32%) | 11％ |
| 6 | N/A | N/A | N/A | 26％ |
| 7 | 26 | 12 | 11 (42%) | 50％ |
| 8 | 10 | 18 | 7 (39%) | 54％ |
| 9 | 16 | 18 | 11 (61%) | 51％ |
| 10 | 8 | 6 | 6 (75%) | 29％ |
| 11 | 17 | 6 | 6 (35%) | 82％ |
