日本京教大学临床检验科学系
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日本京教大学临床检验科学系
DOI: 10.15761 / BRCP.1000131
细胞膜上的脂质组成对许多细胞的活性调节起着至关重要的作用。在免疫细胞中，包括T细胞受体和先天免疫受体在内的多种受体的活性受脂质的调节。在膜内胆固醇存在的情况下，饱和脂肪酸(FAs)促进有序脂质微域的形成，并增强受体介导的信号传导和炎症，但饱和脂肪酸作用的机制细节尚不清楚。本研究表明，在联合原子力场的分子模拟中，与纯二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)双分子层相比，采用1:1:1棕榈酰酰磷脂酰胆碱(POPC)/二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)/胆固醇的脂质双分子层，多ile跨膜(TM)螺旋肽的自二聚态以约-2.2 kJ/mol稳定。能量分解分析表明，由于多肽二聚时蛋白质-脂质相互作用不理想(拟合性差)，DOPC双分子层相对于单体状态具有较高的Lennard-Jones (LJ)势能代价，但1:1:1双分子层在二聚体状态和单体状态之间的蛋白质-脂质LJ电位差异相对较小。在1:1:1双分子层中，POPC和DPPC都位于二聚多肽附近，胆固醇主要位于距离多肽表面3 Å的>。然而，势能分解分析并不支持从富含胆固醇的小室分离多肽对稳定二聚体很重要的观点。相反，磷脂溶剂化肽，即使在二聚体后保存相对完好，这可能是由于酰基链的拉直，是二聚体稳定的关键。总之，磷脂和胆固醇的饱和FAs似乎以一种序列非特异性的方式稳定跨膜螺旋肽二聚，通过这种脂类的能力，在肽二聚后间接协助脂类溶剂化多肽。
蛋白质聚类，蛋白质招募，动力学模拟，GROMOS，脂质筏
膳食脂肪酸(FAs)被纳入细胞膜的磷脂，并影响细胞功能[1,2]。免疫细胞中(磷脂)FA成分的改变已被证明可以调节细胞的活性[1,3,4]。多不饱和FAs (PUFAs)，包括n-3 PUFAs，如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，已被证明可以抑制T细胞增殖[5,6]，而富含饱和FAs的饮食与代谢疾病、胰岛素抵抗和动脉粥样硬化的发展有关，其中低级别炎症被认为与[7]有关。大量数据表明，饱和FAs和反式FAs倾向于一种促炎状态，有助于慢性炎症、自身免疫、过敏、动脉粥样硬化以及其他代偿性疾病[7]。相比之下，n-3 PUFAs在这种慢性炎症中的抗炎作用和整体效益已经得到了充分的证明。
FAs的差异效应机制一直在深入研究中。仅举几个例子，饱和FAs已被证明在t细胞不激活的情况下以剂量依赖的方式诱导t细胞分泌细胞因子，而不饱和FAs则不能这样做[8]。谢赫et al。报道称，饱和富含fas的饮食增加了小鼠CD4细胞中T细胞受体的纳米级聚集+而富含单不饱和FAs或n-3 PUFA的饲料则没有这种效果。在霍尔泽et al。[10]，高脂饮食导致小鼠脂肪细胞的洗涤不溶子结构域内c-Src(肉豆豆化蛋白)的分配和激活在体外分析支持了这一结果。值得注意的是，c-Src激活是c-Jun n -末端激酶(JNK)激活的关键事件，后者可以被饱和FA诱导，而不能被PUFA[11]诱导。我们建议回顾有关FAs对免疫细胞影响的文章[12-14]。
FAs的免疫调节作用被认为是通过几种方式介导的，包括:1)对脂质中介分子的干扰，其中环加氧酶是一个关键角色;2)特异性受体蛋白介导的信号传导导致基因表达调控;3)对膜物理特性的影响，包括生物膜中脂质介导微域的形成[15,16]。2)从toll样受体(TLRs)到转录机制的各种机制协同作用。其中包括最近发现的n-3 FAs的G蛋白偶联受体(GPCRs)，如GPR120[17,18]。n-3 PUFAs (DHA和EPA)，而不是饱和FAs，通过GPR120[18]发挥有效的抗炎作用。模式3通过修饰脂质膜的理化性质来假定其作用。饱和脂肪酸和胆固醇一般会增加脂质次序和硬度，这种模式可能与脂质膜微畴形成的异质性有关。当细胞受到刺激时，质膜中富含胆固醇和鞘磷脂的微域(称为脂筏)融合成更大的平台，促进一些受体与其信号分子的相互作用[19-21]。pufa处理Jurkat T细胞导致不仅在大块膜中，而且在分离脂筏(基于蔗糖梯度分离)中磷脂中的PUFAs增加，并导致蛋白质[22]脂筏的置换。众所周知，脂筏中富集的细胞质和跨膜(TM)蛋白通常与饱和FAs酰基化。有趣的是,在Stulniget al。[22]，对Lck和T细胞(LAT)两个棕榈酰化蛋白的活化连接子的分析表明，即使蛋白质被棕榈酰残基酰化，脂质筏上的蛋白质也发生在pufa处理的T细胞中。
二聚是激活单跨TM蛋白受体[23]的常见机制。在许多情况下，二聚发生在配体结合后，随后是蛋白激酶活性的激活。包括GPCRs在内的多跨受体蛋白的二聚/寡聚也被认为是正常信号传导过程[24]的一部分。例如，黄体生成素(LH)受体位于与[25]结合的配体上的膜型脂质微域。在某些情况下，受体的寡聚化与它们转位到特定的膜微域有关。例如，单粒子示踪和生化方法都强烈表明，未与配体结合的LH受体位于非筏中，并在配体结合后转位到脂质筏中。因此，TLR4的二聚和募集到脂筏中可能是导致TLR4激活的两个关键事件，它们之间可能相互耦合。寡聚状态可能是控制受体蛋白分配成脂质筏[21]的重要因素。
然而，关于FAs对膜蛋白相互作用的影响，目前还不清楚FAs通过调节脂质筏性质和微畴间异质性的间接作用在多大程度上是重要的。由于液体有序(lo)和液体紊乱(ld)相比合成体系中要小得多[16,26]，因此FAs对蛋白质二聚/多聚的物理化学影响可能并不完全取决于微畴内外的预先形成的差异。也就是说，饱和FAs的促炎作用可能作用于具有一定脂质次序和硬度的膜。然而，通常很难用活细胞来解决这些问题，因为在蛋白质[25]中，饱和SA对木筏的吸收和酰化作用的意义是不同的。
近年来，我们一直致力于利用联合原子(UA)或全原子(AA)力场(FFs)对TM二聚反应的自由能进行分子动力学(MD)模拟分析[27,28]。一个主要的挑战是对密集计算的要求(参见方法部分)，但是，联合原子(UA) FFs的使用可以将计算成本降低到AA FFs的约20-25%。在此，我们对一个多ile TM肽在UA - FF条件下的自二聚进行了自由能分析。与纯DOPC双分子层相比，饱和FA-和胆固醇双分子层的二聚状态明显稳定。尽管胆固醇主要分布在离多肽很远的地方，多肽也被DPPC和POPC溶剂化，但筏状(饱和脂肪酸和富含胆固醇)双分子层的强脂质-脂质相互作用特征并不是促进多肽分离和二聚的原因。事实上，当将总势能分解为肽-肽相互作用势能、肽-脂质相互作用势能和脂质-脂质相互作用势能时，脂质-脂质相互作用势能的分布并不支持上述分离在二聚体稳定中起关键作用的情况。相反，脂质-蛋白质相互作用的势能项显示出一个有趣的特征;在DOPC双分子层中，脂-蛋白LJ项在肽二聚时产生了高能消耗，而在筏状双分子层中，它在肽二聚时产生了相对较小的能量消耗(溶剂化效果更好)。因此，二聚体稳定的关键因素似乎是一些结构特征，可能涉及到木筏状双分子层的脂酰链的高阶参数，这使得二聚后的多肽能够被脂类保持溶剂化，并降低了二聚后从脂类中溶解多肽的能量成本。
所有分子动力学模拟都使用Gromacs套件4.5.4[29]进行。的GROMOS53 a6从自动力场拓扑构建器(ATB)站点[30]下载，并在Gromacs中实现了DOPC、POPC、DPPC和胆固醇。使用Gromacs提供的简单点充电(SPC)水。初始结构和GROMOS53 a6参数拓扑文件的多ile(即，(I)21)是通过修改我们最近分析中使用的文件而制备的[27,28]。N端和c端结构为- nh2和羧基。采用Berendsen耦合使温度恒定在323 K，采用Berendsen算法在1 bar下进行半各向同性压力耦合，如我们最近的论文[28]中所述。其他条件包括键长约束和长时间库仑和LJ相互作用的处理也与[28]相同。
采用伞状采样模拟(基于Gromacs的拉码模块)和随后通过加权直方图分析方法(WHAM)[31]进行合并，使用前面描述的方法计算TM肽二聚的平均力势(PMF)剖面[27,28]。简而言之，对于伞式采样，力常数为3000kj /mol/nm的谐波电位2对螺旋肽质心之间的距离(r)进行了应用。在1.1 ~ 1.6 nm的螺旋间距范围内，生成了16个间距为0.1 nm的初始窗口。然后，将两个多肽以反平行的方向插入平衡的双层中，手动移动重叠的脂质。为了减少初始结构的影响，每个螺旋间距离r对应8个独立结构，对应表1所示的每个集合。对于DOPC系统(#1)，在进行100 ns的平衡运行后，再进行400 ns的生产运行。对于1:1:1的POPC/DPPC/胆固醇体系(#2，表1)，我们简单地称为“1:1:1的双分子层”，在每个窗口500 ns的生产运行(表1)之前执行100 ns的平衡运行及(r)，二聚自由能∆G昏暗的螺旋多肽的计算为∆G昏暗的= -RTlnK一个,在那里K一个是两个多肽处于二聚体状态的时间长度与它们处于单体状态的时间长度之比。K一个等于关联常数估计为K一个=[∫πrg博士(r))/ P米，其中积分从0到Rc,Rc作为定义二聚态的截止点。g(r)是通过补偿玻尔兹曼因子exp(-)得到的二维径向分布函数(rdf)剖面βG及(r))相对于可用相空间中依赖于r的增加，以及归一化因子P米给药P米= [v/{π(R马克斯2-Rc2)}] *[∫πrg(r) dr]，其中v为标准浓度下肽单体可用的双分子层面积，积分从Rc来R马克斯．值得注意的是,P米表示归一化v，即v加权于两个多肽在单体中的时间长度，通过积分估计。在目前的研究中，Rc=1.6 nm, v=1.66 nm2被使用。在30个Intel四核2.8 GHz中央处理器(cpu)上，一组DOPC PMF分析(500 ns/窗口，n=6)(表1的do-S)耗时约60天，而1:1:1双分子层分析的计算时间翻倍。在由于分子之间严重碰撞而导致暂停模拟的偶尔运行时间错误的情况下，运行将使用10 ns之前的时间框架的坐标恢复，并重新播撒速度。
ID |
伞集名称 |
成分 |
仿真时间 |
∆G昏暗的（焦每摩尔) |
1 |
Gr-Ile21-dopc / w |
do-S: 56 DOPC/2047水 |
6 × 500ns × 6 |
-0.01 |
2 |
Gr-Ile21-1-1-1 / w |
1-1-1-raft: 24 POPC/24 DPPC 24 Chol/1835水 |
8 × 500ns × 6 |
-2.23 |
表1。模拟系统和结果
为了分析脂质成分对肽二聚倾向的影响，我们使用伞状取样方法(图1)对两个相同的聚二聚多肽进行了总计42微秒的UA模拟，以不同的距离(分离)放置在双分子层中，并获得了平均力(PMF)的自二聚势(图2)。也就是说,聚ile)是基于我们最近的发现，聚ile(而不是Leu和Val)在GROMOS之间表现出类似的二聚自由能分布53 a6和CHARMM36 FFs(西泽，手稿准备)。作为脂膜，我们选择了DOPC双分子层和1:1:1的POPC/DPPC/胆固醇双分子层，我们称之为1:1:1的双分子层(表1)。后一种成分的选择是基于其与Niemela的相似性et al。[32]，使用1:1:1的POPC/棕榈酰-鞘磷脂(SM)/胆固醇(S一个的Niemelaet al。[32])以及相应的实验数据显示混相(也就是说,没有相边界出现)下降到283 K[33]。值得注意的是，根据C5-C7的顺序参数，DOPC双分子层显示年代CD=-0.20和1:1:1双分子层(如POPC和DPPC) -0.29。后者被发现没有变化的存在多肽。它们的有序程度比S体系中的磷脂的有序程度低一个的Niemelaet al。[32]显示年代CD-0.41，但高于62:1:1的POPC/棕榈酰- sm /胆固醇(年代CD= -0.18)。因此，我们的1:1:1双分子层被认为具有介于DOPC双分子层和它们的体系S之间的中间特性一个双分子层。我们没有使用SM，因为我们发现在UA FFs下头群和肽相互作用的微妙性(Nishizawa，未发表的结果)，而且在这方面SM头群的信息有限。
图1所示。多ile肽的自二聚PMF模拟的代表性快照。（一个) DOPC系统(表1中的#1)。在本例中，螺旋间距离r保持在1.3 nm。表示方案:青色甘草，脂酰链;中等大小的球体(红色和蓝色)，磷脂头团原子(分别是氧原子和氮原子);小球体(银色和红色)，水原子;黄条，肽骨架痕迹;绿色和青色的球体，Ile边链。只有位于2.5纳米厚切片中的脂质分子被显示出来。（b) r=1.6 nm的1:1:1双层体系(表1中的#2)。表示为(一个)，而胆固醇则以粉红色表示。
得到的自由能曲线如图2所示。在DOPC双分子层中，多肽之间的距离r=~1.3 nm处的自由能水平相对于r=1.6 nm处的自由能水平相当高，表明多肽之间没有自二聚的倾向。这对应的二聚自由能为-0.01 kJ/mol。值得注意的是，对相空间中依赖于r的增加的补偿(参见方法)导致了这样一个非正的值，这有点违反直觉。相比之下，同样的多肽放在1:1:1的双分子层中，在r=1.2-1.3 nm处显示出自由能分布。合成的二聚能为-2.23 kJ/mol。两种曲线的标准误差(分别基于每个伞窗的DOPC和1:1:1双分子层的6和8个轨迹)都足够小，且1:1:1双分子层的结合自由能明显大于DOPC双分子层(t以及,P < 0.01)。
图2。TM螺旋二聚聚PMF的概况。结果显示DOPC双分子层和1:1:1双分子层。误差条表示来自6个(DOPC)和8个(1:1:1)独立伞形分析集的se。这些值相对于r=1.6 nm处的值被绘制出来。
为了检验模拟中脂类的分布，计算了多肽周围脂类的径向分布函数(rdfs);1)螺旋间距r=1.3 nm的DOPC双分子层(图3A, 3B)， 2) r=1.6 nm的DOPC双分子层(图3C, 3D)， 3) r=1.3 nm的1:1:1双分子层(图3A, 3B)， 4) r=1.6 nm的1:1:1双分子层(图3C, 3D)。重要的是，在1:1:1双分子层中，无论是二聚态还是单体态，胆固醇都很少与多肽直接接触(来自多肽表面的<2.2 Å)(图3B, 3D)。另一个特点是DOPC在多肽附近的分布与磷脂的分布大致相当(也就是说,POPC和DPPC)在1:1:1双分子层中(图3B, 3D)。因此，尽管DOPC和1:1:1体系之间的脂-肽相互作用势能存在差异(如下图所示)，但基于接触或分布等指标来解释这种差异似乎是不切实际的。还注意到，在我们的1:1:1体系中，当多肽二聚时，POPC在多肽附近的密度比DPPC更高(图3B，黑色和灰色线)，但在r=1.6 nm处看到相反的趋势(图3D)，支持了二聚与多肽从胆固醇/DPPC丰富的子区域分离有关的观点。
图3。脂质径向分布函数(rdf)分析。所示的每个脂类是位于距离肽的最近原子的指定距离的脂原子的非归一化密度分布。DOPC的图谱基于PMF分析的DOPC集，而POPC、DPPC和胆固醇图谱则来自1:1:1的图谱集。(一)以r=1.3 nm处螺旋间距约束下的二聚态模拟为例。蓝线表示的是在1:1:1伞形模拟中POPC、DPPC和胆固醇密度的总和。(b)一样(一),但近距离(<0.28 nm)强调了清晰度。(c)模拟r=1.6 nm，代表单体状态。(d)一样(c)但是强调了近期。
图4。将势能(即库仑能和LJ能)分解为脂质-脂质、肽-脂质和肽-肽相互作用能。基于PMF分析的模拟结果显示:(得了)为DOPC双分子层和(d-f)为1:1:1双分子层。（,维)比肽-肽势能。（b, e)比肽脂能。（c、f脂脂比势能。
富含DPPC和胆固醇的双分子层(图2)的高二聚倾向是由某些降低蛋白质-蛋白质相互作用势能的因素引起的吗?热力学参数的考虑在这类讨论中变得很重要。理论上，自由能分布可分解为焓和熵分量[34]。ΔG昏暗的是由我们上面看到的PMF剖面推导出来的。焓的变化ΔH昏暗的由系统的总能量推导而来，忽略了压力-体积项。熵分量TΔ年代昏暗的是从的关系中推断出来的ΔG昏暗的＝ΔH昏暗的- TΔ年代昏暗的．在这里，我们承认伞势可能改变总能量的影响可能导致窗口间的差异被忽略了。在这项研究中，我们估计ΔH昏暗的使用r=1.3和1.6 nm处的值。在1.6 nm处的截断可能产生特定的误差，需要在未来的研究中进行关键评估。从我们画的曲线来看，ΔH昏暗的(±SE)估计为3(±22)kJ/mol和-TΔ年代昏暗的当多肽在DOPC双分子层中从1.6 nm到1.3 nm位置接近时，为-3(±22)kJ/mol(详情未显示)。对于1:1:1的双分子层，对应的值为ΔH昏暗的=-25(±41)kJ/mol和-TΔ年代昏暗的41 = 23(±)焦每摩尔。最近,矢野et al。[35]表明(AALALAA)的二聚3.是一个焓驱动的过程(ΔG昏暗的= -13.2焦每摩尔,ΔH昏暗的=-23.7 kJ/mol， -TΔ年代昏暗的=10.4 kJ/mol)和胆固醇添加到POPC双分子层增加的无符号值ΔG昏暗的而且ΔH昏暗的从而稳定肽二聚(ΔG昏暗的= -22.6焦每摩尔,ΔH昏暗的=-84.1 kJ/mol， -TΔ年代昏暗的= 61.4焦每摩尔)。因此，虽然我们的计算长度有限，导致SE值较大，但我们的结果与二聚体是一个由焓驱动的过程的实验结论一致，表明胆固醇和饱和FA链通过增加焓的无符号值加强了二聚体稳定效应。我们的计算与实验的差异可能是由UA模型的焓熵补偿、脂质组成和二聚定义的差异以及参数不准确等多方面因素造成的。
一般来说，TM肽的二聚主要由接近焓的总能量的三个组成部分决定:肽-肽、肽-脂和脂-脂相互作用势能。如果肽-脂质相互作用成分较弱或不具吸引力，那么肽很容易从脂质中脱溶，有利于二聚。这是二聚体稳定在1:1:1双分子层的情况吗?或者，筏状双分子层的强脂质-脂质相互作用是否起到分离多肽的作用，从而稳定二聚体状态?为了更好地解决这些问题，我们将总势能分解为三个特定的分量:肽-肽相互作用比势能Vpept-pept肽-脂质相互作用Vpept-lipid、脂质相互作用Vlipid-lipid．例如，我们让Vpept-pept(r)为螺旋间距为r nm时的肽-肽位能。这可以进一步分解为LJ能量VLJpept-pept(r)和库仑能项V外壳pept-pept(r).这里，跟着卡斯蒂略et al。[34]，这个分解处理的是势能(LJ和静电能的总和)，忽略伞势和压力-体积项，这通常是可以忽略不计的小[34]。
与单体态(r= 1.6 nm)相比，二聚肽(r=1.3 nm)表现出更负(有利)的肽-肽相互作用势能(图4A, 4D)，即Vpept-pept(1.3) < Vpept-pept(1.6)，对于LJ和库仑能。这并不奇怪，因为LJ和静电能函数基本上都有这样的性质。还有人指出，微分{VLJpept-pept(1.3) - VLJpept-pept(1.6)}在两个双分子层之间相似(图4A, 4D)，因为差异仅取决于肽的结构和位置。{V外壳pept-pept(1.3) - V外壳pept-pept(1.6)}对DOPC的影响大于对1:1:1双分子层的影响，但这一库仑项并不能解释肽二聚体在1:1:1双分子层中的稳定性增加。
更重要的是，比肽-脂质相互作用能VLJpept-lipid对于DOPC双分子层，在r=1.3 nm处比r=1.6 nm处增加117 kJ/mol，这表明肽二聚伴随着肽和脂质之间的不利或稀疏(不合适)相互作用(图4B，黑色箭头)。直观地说，这意味着肽二聚化排除了许多脂质分子，这些脂质分子可能与位于大螺旋间分离处的肽接触。引人注目的是,VLJpept-lipid(1.3)“在较小程度上”高于VLJpept-lipid(1.6)在相对于DOPC双分子层的1:1:1双分子层中，其差值为100 kJ/mol(图4B, 4E，黑色箭头)。值得注意的是，这可能是一种保守的解释;由于PMF曲线(图2的y轴)通常随着r的增大而减小，这是由于空间的增大，根据图2所示的结果，VLJpept-lipid(1.3)和VLJpept-lipid(1.2)可以更好地表示二聚态的值，相应的也可以表示V中两个双分子层的差值LJpept-lipid(r)应该更清楚。有趣的是,V外壳pept-lipid(r)项与DOPC双分子层相反，也有助于在1:1:1条件下二聚体的稳定(图4B, 4E)，尽管只有多肽的主原子和脂质头团的原子参与了这一项。这表明，以单体状态为参考时，与DOPC双分子层相比，1:1:1双分子层脂即使在多肽二聚后也能更好地溶剂化(贴合)多肽。
上述关于从胆固醇分离的多肽的发现(图3)使我们预期脂质-脂质电位Vlipid-lipid也可能是稳定肽二聚体的重要因素。然而，微分{VLJlipid-lipid(1.3) - VLJlipid-lipid(1.6)}对于DOPC是-84 kJ/mol，对于1:1:1双分子层是-78 kJ/mol(图4C, 4F)，反对这一项在1:1:1双分子层中对二聚体稳定的作用。V外壳lipid-lipid也不能解释二聚体在1:1:1双分子层中的稳定性(图4C, 4F)。因此，对于两种双分子层，脂质-脂质组分均表现出肽二聚体稳定效应，但DOPC的这种效应略大于1:1:1双分子层。因此，与我们预期的筏状1:1:1双分子层具有紧密的脂脂相互作用，从而分离多肽相反，脂脂相互作用势能不能解释1:1:1双分子层的高二聚倾向。
综上所述，这些发现表明，与DOPC双分子层相比，富含饱和脂肪酸链的1:1:1双分子层稳定了螺旋型TM多ile肽的自二聚。这种差异主要是由于当肽二聚体形成时，磷脂在1:1:1双分子层中比DOPC双分子层更能溶剂化肽。从磷脂/胆固醇聚集物中去除多肽可能对二聚体稳定有支持作用，但我们的势能分解分析不支持其对二聚体稳定的重要性。相反，POPC和DPPC分子的一些结构特征，可能是高度有序的酰基链，被富含胆固醇的子室包围，可能赋予这些磷脂更好地溶剂化二聚肽的能力。在DOPC双分子层中，较低阶的脂酰链可能使肽二聚时肽脂接触非最佳，从而增加肽二聚的能量消耗。
在本研究中，与DOPC双分子层(-0.01 kJ/mol)相比，含有富含胆固醇和饱和脂肪酸成分的双分子层稳定了二聚化(二聚化能为-2.23 kJ/mol)，对于一个只有21个Ile残基序列的TM螺旋肽。势能分解表明，在二聚之后，肽-脂质相互作用能变得很高(不利)(图4B, 4E)。这是可以理解的，因为多肽的二聚或多或少会排出脂类，部分阻碍脂类与多肽的接触(溶剂化)。有趣的是，对于LJ和库仑能，由于肽-脂质相互作用势能项(也就是说,与DOPC双分子层相比，1:1:1双分子层由于脂质中肽脱溶的成本并不高(图4B, 4E)。这意味着，即使在多肽二聚之后，在1:1:1的双分子层中，多肽的一些溶剂化(贴合)是可能的，减少了二聚时因脱溶而产生的成本。与我们的预期相反，脂质-脂质势能的分布并不能解释1:1:1双分子层的高二聚倾向(图4C, 4E)。因此，尽管从富含胆固醇的子区域观察到多肽的分离，但磷脂/胆固醇聚集物的热力学有利的形成不太可能直接增加多肽二聚的倾向。相反，磷脂/胆固醇聚集物增加了系统的脂质序参数，这可能为肽二聚后的溶剂化提供一些优势，降低了从脂质中分离肽的能量成本。尽管需要进一步的分析来找出其优点，但理顺脂链(高阶参数)可能直接改善肽的溶剂化。
饱和脂肪酸和胆固醇的这种二聚体稳定效应是多ile肽特有的还是许多螺旋TM肽共有的?计算负担使我们无法测试许多肽，但是，当我们测试带有I(VI)序列的TM螺旋时，10, (也就是说,21残基肽交替Ile和Val)，每个窗口300 ns，它也表现出类似的二聚体稳定性-1.8 kJ/mol相对于DOPC双分子层1:1:1。I(VI)的分解分析10多肽与聚ile有相似的趋势，{VLJpept-lipid(1.3) - VLJpept-lipid(1.6)}为110 kJ/mol的DOPC和98 kJ/mol的1:1:1双分子层(Nishizawa未发表的数据)。当VLJpept-lipid用(1.2)代替VLJpept-lipid(1.3)。库仑能的微分{V外壳pept-lipid(1.3) - V外壳pept-lipid(1.6)}在1:1:1 (25 kJ/mol)时也低于DOPC双分子层(60 kJ/mol)，表明这一项对二聚体稳定性的贡献。我(VI)10肽也是，Vlipid-lipid并不能解释相对于DOPC双分子层1:1:1的二聚稳定作用。因此，在PMF分析和势能分解分析中，I(VI)10显示出与聚ile相似的特征。我们推测，大部分螺旋TM肽表现为饱和FA和胆固醇在二聚体后通过相对有利的脂-蛋白相互作用降低脱溶能量消耗的趋势，从而导致这些脂类的二聚体稳定效应。
多跨受体蛋白的二聚/寡聚也被认为是正常信号传递过程的一部分，如LH受体(见导论)。作为另一个例子，Hwang和同事表明饱和FAs激活TLR4，但DHA抑制脂多糖(LPS)诱导的TLR4的激活，这一现象的分子靶标是受体本身或导致TLR4激活的上游事件[36]。最近黄et al。使用巨噬细胞RAW264.7细胞，结果显示月桂酸，而不是DHA，促进TLR4及其适配器分子与脂筏的结合(基于蔗糖梯度分馏)，也促进TLR4[37]的二聚和激活。因此，低聚状态可能是控制受体蛋白划分成脂质筏[21]的一个因素。
然而，脂质对蛋白质行为的非特异性和特异性作用相互混淆，使分析和解释困难。特定的相互作用可能有助于将蛋白质招募到特定的微域，微调一些细胞信号。然而，除了FA衍生化(修饰)外，对这类微域的清晰的招募信号尚不清楚[15,16]。在活细胞中，浮筏微域和非浮筏微域有相当小的差异，提出了FA和胆固醇对蛋白质动力学的影响至少在部分上不依赖于特定类型微域的存在的可能性。在生理系统中，胆固醇不仅存在于筏区，也存在于非筏区。对不同组分的分析可以进一步深入了解所观察到的结果是否与广泛的双分子层(包括筏层和非筏层)有关。在这项研究中，我们选择了极端的成分，也就是说,一个1:1的POPC/DPPC/胆固醇双分子层和纯DOPC双分子层，但更多的成分可能值得分析。尽管有限的分辨率阻碍了本研究中饱和脂肪酸和胆固醇的相对重要性的讨论，但专注于每一种脂肪酸和胆固醇的不同组成将会提供信息。这个项目的延伸线正在进行中。
那种Nishizawa
军事大学
研究文章
收稿日期:2017年2月05日
录用日期:2017年3月10日
发布日期:2017年3月13日
©2017 Nishizawa M.这是一篇基于创作共用署名许可条款发布的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
Nishizawa M, Nishizawa K(2017)胆固醇和饱和脂肪酸通过降低二聚时脂质肽脱溶相关的能量成本来稳定螺旋跨膜肽的二聚:来自原子模拟的洞见。生物医学医学临床应用2:DOI: 10.15761/BRCP.1000131
特教大学医学技术学院，东京，板桥，加贺，173-8605，电话:+81-3-3964-1211;传真:+ 81-3-5944-3354。
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伞集名称 |
成分 |
仿真时间 |
∆G昏暗的（焦每摩尔) |
1 |
Gr-Ile21-dopc / w |
do-S: 56 DOPC/2047水 |
6 × 500ns × 6 |
-0.01 |
2 |
Gr-Ile21-1-1-1 / w |
1-1-1-raft: 24 POPC/24 DPPC 24 Chol/1835水 |
8 × 500ns × 6 |
-2.23 |
表1。模拟系统和结果
图1所示。多ile肽的自二聚PMF模拟的代表性快照。（一个) DOPC系统(表1中的#1)。在本例中，螺旋间距离r保持在1.3 nm。表示方案:青色甘草，脂酰链;中等大小的球体(红色和蓝色)，磷脂头团原子(分别是氧原子和氮原子);小球体(银色和红色)，水原子;黄条，肽骨架痕迹;绿色和青色的球体，Ile边链。只有位于2.5纳米厚切片中的脂质分子被显示出来。（b) r=1.6 nm的1:1:1双层体系(表1中的#2)。表示为(一个)，而胆固醇则以粉红色表示。
图2。TM螺旋二聚聚PMF的概况。结果显示DOPC双分子层和1:1:1双分子层。误差条表示来自6个(DOPC)和8个(1:1:1)独立伞形分析集的se。这些值相对于r=1.6 nm处的值被绘制出来。
图3。脂质径向分布函数(rdf)分析。所示的每个脂类是位于距离肽的最近原子的指定距离的脂原子的非归一化密度分布。DOPC的图谱基于PMF分析的DOPC集，而POPC、DPPC和胆固醇图谱则来自1:1:1的图谱集。(一)以r=1.3 nm处螺旋间距约束下的二聚态模拟为例。蓝线表示的是在1:1:1伞形模拟中POPC、DPPC和胆固醇密度的总和。(b)一样(一),但近距离(<0.28 nm)强调了清晰度。(c)模拟r=1.6 nm，代表单体状态。(d)一样(c)但是强调了近期。
图4。将势能(即库仑能和LJ能)分解为脂质-脂质、肽-脂质和肽-肽相互作用能。基于PMF分析的模拟结果显示:(得了)为DOPC双分子层和(d-f)为1:1:1双分子层。（,维)比肽-肽势能。（b, e)比肽脂能。（c、f脂脂比势能。
