日本东京，帝京大学医学院法律医学系
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DOI: 10.15761 / BRCP.1000135
最近有报道称，昼夜节律基因第二阶段（per2)调节血管内皮生长因子基因(Vegf)在某些肿瘤细胞中。然而，目前尚不清楚per2是否影响创面愈合过程中血管生成因子的表达。目的:探讨创伤组织和完好皮肤血管生成因子的昼夜节律per2-突变体小鼠和对照小鼠，我们采用皮肤切口创面模型per2，并分析了几种血管生成因子mRNA水平的昼夜节律。我们的研究结果显示了一个新的发现，对于一些血管生成因子，伤口组织中mRNA水平的昼夜节律存在per2在对照组小鼠中也发现了-突变体，这表明某些昼夜节律可能是完全独立的。我们在对照组小鼠完整皮肤中观察了per2和一些血管生成因子mrna的昼夜节律。在完好皮肤中，一些血管生成因子mrna的昼夜节律模式发生改变per2-突变小鼠相对于正常小鼠，说明存在per2依赖性和独立性调控血管生成因子的表达。
昼夜节律，per2，血管生成，老鼠，伤口
伤口愈合阶段的评价在法医病理学中具有重要意义。我们之前的研究主要集中在皮肤切口创面的血管生成和淋巴再生[1,2]。我们发现，血管内皮生长因子- a (VEGF)是一种重要的血管生成因子，在大鼠皮肤切口创面早期就产生了。我们进一步发现VEGF免疫组化定位于白细胞[1]，主要定位于创面[3]。
在一项聚焦VEGF分子机制的研究中，Koyanagiet al。结果表明，在小鼠体内植入的肿瘤细胞中，VEGF mRNA水平在缺氧条件下显著增加，有趣的是，其水平有节律地昼夜波动[4]。生理节奏基因第二阶段（per2)和另一个昼夜节律基因，Cryptochrome1，其在植入肿瘤细胞中的表达呈现昼夜振荡，抑制缺氧诱导Vegf启动子活性[4]。其他研究表明，期1（per1)，亦是期家庭,per2在人外周血白细胞mRNA表达中表现出昼夜节律振荡[5-8]。
Per2-突变小鼠已被证明对缺血性心肌损伤更有抵抗力，可能是通过干扰另一种昼夜节律基因产物Clock-Bmal1，其活性抑制转录靶，包括VEGF[9]。因此，可以想象，浸润在创面组织的中性粒细胞VEGF mRNA表达可能受到了昼夜节律基因的影响per2振荡。另一方面，per2-与野生型小鼠相比，突变型小鼠因心肌缺血而发生更大的梗死面积，并失去缺血预处理[10]所赋予的心脏保护作用。这种损伤很可能是由于缺氧诱导因子-1 α (HIF1a)[10]无法稳定引起的。Per2抑制Clock-Bmal1和依赖于clock - bmal2的纤溶酶原激活物抑制剂1基因的转激活(Pai1/Serpine1)体外启动子[11]。因此，per2在缺血性损伤中的作用尚不明确。
据我们所知，per2在伤口愈合过程中血管生成的可能作用尚未被探索。在本研究中，我们首先报道了正常皮肤中per2和血管生成因子mrna的昼夜节律。然后我们假设创面区域的白细胞和其他浸润细胞产生的血管生成因子受到per2的影响。为了验证这一假设，我们将切口模型应用于per2-突变体和对照小鼠检测血管生成因子mRNA表达水平:VEGF- a (VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、HIF1a、成纤维细胞生长因子1 (FGF1)、血管生成素1和2 (ANGPT1和2)、血管生成素样蛋白1和2 (ANGPTL1和2)、PAI1、粒细胞集落刺激因子(CSF3/G-CSF)、趋化因子(C-X-C motif)配体2 (CXCL2)、基质金属肽酶9 (MMP9)、转化生长因子β 1 (TGFb1)、集落刺激因子2 (CSF2)和抗血管生成因子筋调素(TNMD)[12,13]。
我们还对皮肤切口后7天收集的组织进行组织学分析，以评估内皮细胞在伤口愈合过程中的作用per2-突变体和对照小鼠，观察其作用per2血管生成的时钟基因[1,2]。
6周大的男性B6。Cg-Per2tm1Brd Tyrc-Brd/J小鼠per2-突变小鼠)和B6(Cg)-Tyrc-2J/J小鼠(对照小鼠)购自Jackson实验室(Bar Harbor, Maine, USA)，并保存在我们的机构[12]。突变小鼠在PAS结构域(在Per, Arnt和Sim中发现的二聚结构域)[12]中存在缺失突变。这些老鼠在白天(上午8点到晚上8点)暴露在发光的光线下，晚上则处于黑暗中。白天的光照强度约为600勒克司。在ZT18实验中，白天时间被移到了晚上8点到早上8点本实验经研究所动物伦理委员会批准(批准号12-043)。
我们之前报道了皮肤切口后24小时伤口组织中各种血管生成因子的mRNA表达水平[13]。因此，在本研究中，我们也选择皮肤切口后24小时作为时间点，测量各Zeitegeber时间(ZT)点[13]组织中mRNA的表达水平。值得注意的是，ZT是一个12小时亮-12小时暗周期，ZT0表示开灯时间，ZT12表示关灯时间。(图1)
图1所示。创面实验设计。per2 -将突变小鼠和对照小鼠分为4组:1 (ZT2)、2 (ZT6)、3 (ZT11)和4 (ZT18)。白色条表示亮期，而填充条表示暗期。每组在特定的ZT时间点(填充箭头)进行切口创口。24小时后同一ZT时间点(白色箭头)采集皮肤组织。
用异氟醚吸入麻醉小鼠，在ZT2、ZT6、ZT11和ZT18时间点用无菌手术刀和剪刀在背侧皮肤5厘米处深入皮下组织底部。皮肤切开24小时后，在异氟醚吸入下收集切开的皮损和完整的皮肤区域，进行mRNA和组织学研究(图1)。
CD31免疫组化研究于ZT2制作皮肤创面组织，并于皮肤切开后7天收集[1,2]。
使用QIAMP RNeasy纤维组织试剂盒(QIAGEN, Tokyo)从完整皮肤和真皮伤口组织中分离总RNA。使用StepOne Plus (Fischer Scientific, USA)实时PCR系统[13]，采用TaqMan基因表达法和TaqMan快速病毒1步Master Mix (Fischer Scientific, USA)检测各种血管生成和淋巴发生因子的相对表达。研究的因子如下，括号中为TaqMan基因表达测定引物id: VEGF (Mm01281449_m1)， HGF (Mm01135193_m1)， TGFb1 (Mm01178820_m1)， HIF1a (Mm00468869_m1)， FGF1 (Mm00438906_m1)， ANGPT1 (Mm00456503_m1)， ANGPT2 (Mm00545822_m1)， ANGPTL1 (Mm01291815_m1)， ANGPTL2 (Mm00507897_m1)， PAI1 (Mm00435860_m1)， CSF2 (Mm01290062_m1)， CSF3 (Mm00438335_g1)， CXCL2 (Mm00436450_m1)， MMP9 (Mm00442991_m1)， TNMD (Mm00491594_m1)。
昼夜节律的评估，RNA来自完整的皮肤per2将ZT2处的-对照小鼠集合起来作为校准器。以actin mRNA为内参基因计算delta CT，计算完整皮肤在不同ZTs与校准器的delta CT (delta-delta CT)差值。数据用相对量(2到负delta-delta CT)[14]表示。
为评价创面mRNA，以actin mRNA为内参基因计算delta CT，计算创面与对照完整皮肤组织delta CT (delta-delta CT)的差异。数据表示为相对量折变(2到负delta-delta CT)[14]。
创面组织在4%多聚甲醛中固定3小时，石蜡包埋，制备3微米石蜡切片。使用ImageJ软件(http://imagej.nih.gov)在图像上用苏木素和伊红(HE)染色的样本上计数创面区域的白细胞数量，结果以每平方毫米的白细胞数表示。
内皮标志物CD31的免疫组化采用Histofine简单染色小鼠MAX-PO(大鼠)(Nichirei #414311，日本)。简单地说，6微米厚的切片在二二烯中脱蜡，在10mm柠檬酸缓冲液(pH6.0)中于121℃高压灭菌器中10分钟。然后，切片在3%羟过氧化氢中预处理，室温下10分钟，在0.05M磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH7.6)中洗涤3次，并用Blocking I (Nakaraitesk #03953-95，日本)堵塞10分钟。切片与大鼠单克隆抗小鼠CD31 (PECAM-1)抗体孵育，克隆SZ31 (Dianova #DIA-310，日本)在4°C下用DAKO抗体稀释剂(DAKO，日本)稀释20 - 100倍。PBS洗涤后，切片用Histofine简单染色小鼠MAX-PO(大鼠)(日本立雷)在室温下孵育30分钟。PBS洗涤后，切片用四氢二氨基联苯和过氧化氢染色。用ImageJ软件计算图像上血管面积占总面积的百分比。50像素及以上的尺寸由软件计算。
数据以均数±SEM表示。为了排除外部数据，GraphPad Prism软件对。使用了6和7 (La Jolla, CA, USA)。然后采用Kruskal-Wallis非参数检验对数据进行评价。p值小于0.05为有统计学意义。
我们研究了per2是否在损伤后组织愈合中起作用。首先，我们分析了完整小鼠皮肤上的per2 mRNA水平。根据之前的报告[15]，根据一天中的时间，per2 mRNA水平出现振荡(图2)。在光照条件开始时，ZT11检测到最高水平的per2 mRNA, ZT2检测到最低水平的per2 mRNA。在最高点和最低点之间，水平急剧下降和上升。
图2。mRNA的表达per2信使核糖核酸在完整的皮肤以及对照组小鼠的伤口组织在4个不同的ZT时间点实线指的是完整的皮肤，而虚线指的是伤口组织。数据表示为从ZT2(相对数量，N = 12到14)的折叠级变化。
对照组小鼠完整皮肤中血管生成因子的mRNA水平也表现出昼夜节律性(图3)。不同因子的mRNA水平在对照组小鼠完整皮肤中表现出不同的昼夜节律模式。有趣的是，ANGPTL1、ANGPTL2、CSF2、MMP9和TNMD的mRNA水平反映了per2 mRNA模式;ZT11的相对辐射水平最高，正好在黑暗期开始之前。其他血管生成因子表现出不同的模式(图3)。
图3．对照小鼠完整皮肤中不同血管生成因子的mRNA水平。血管生成因子mRNA水平分析。值得注意的是，根据一天中的时间，检测到四种不同的模式，由四个面板表示(N=4到5;* p <0.05， ** p <0.01)
然后我们比较了两者之间血管生成因子mrna的昼夜节律per2在ZT11有峰的血管生成因子中，ANGPTL1和CSF2 mrna在ZT11处失去峰per2这表明per2在这些血管生成因子的昼夜节律中发挥作用。
图4．不同血管生成因子的mRNA水平per2 -变异小鼠皮肤与对照小鼠皮肤的比较。实线对应控制鼠皮肤，虚线对应per2-突变鼠皮肤。所示为完整皮肤的mRNA分析。per2 -与对照小鼠相比，突变小鼠在某些血管生成因子上表现出明显的昼夜节律模式。(N = 5 - 9;* p <0.05， ** p <0.01)。
然后我们设计了一个实验来检测损伤后各种血管生成因子的水平，如图1所示。
对照组小鼠伤口组织中的per2 mRNA表现出与完整皮肤中相似的昼夜节律模式(图2)。
我们的比较mRNA表达水平在伤口组织per2-突变小鼠与对照组小鼠在以下条件下表现出显著差异:VEGF在ZT6, angptl2在ZT11, ANGPTL1在ZT18(图5)per2对CXCL2、MMP9、TGFb1、HGF和ANGPTL2进行了观察(图5)。其他血管生成因子mrna在CXCL2、MMP9、TGFb1、HGF和ANGPTL2之间显示出不同的节律模式per2-突变小鼠和对照小鼠(图6)。
烧伤患者的创面组织分析per2-突变小鼠在皮肤切开24小时后发现VEGF、CXCL2、MMP9、TGFb1、ANGPTL2 mRNA表达水平有统计学差异，提示存在per2血管生成因子昼夜节律的-独立机制(图5)。FGF1, ANGPT1, CSF3和PAI1在ZT中也显示出统计学上显著的变化per2-突变小鼠(图6)。
另一方面，CXCL2、MMP9、TGFb1、ANGPTL2的mRNA表达水平在对照组小鼠ZT中差异有统计学意义(图5)，FGF1、ANGPT1、TNMD、CSF3的mRNA表达水平在对照组小鼠中差异有统计学意义(图6)。
图5。血管生成因子mrna的昼夜节律模式(相对数量;伤口组织减去完整组织)的per2 -变异小鼠和对照小鼠。前三组(VEGF、ANGPT2和ANGPTL1)之间差异有统计学意义per2 -突变体小鼠和对照小鼠，而较低的五组之间显示相似的模式per2 -变异小鼠和对照小鼠。实线指控制鼠标，虚线指控制鼠标per2 -突变的老鼠。数字符号(#)是指对照和相同ZT点的比较per2 -突变的老鼠。(n = 10-15;* p <0.05， ** p <001， *** p <0.001， **** p <0.0001;# p <0.05， ## p <0.01)。
图6。其他各种c血管生成因子mrna的昼夜节律模式(相对数量;伤口组织减去完整组织)的per2 -变异小鼠和对照小鼠。实线指控制鼠，虚线指控制鼠per2 -突变的老鼠。(n = 9-15;* p <0.05， ** p <001， *** p <0.001)。
我们之前的研究表明，损伤后，VEGF的表达局限于白细胞[3]。我们还发现环磷酰胺的白细胞耗尽状态导致VEGF表达[3]的降低。由于白细胞数量可能是血管生成因子水平波动的一个因素，我们对伤口区域样本的白细胞数量进行了量化。组织学研究显示，两组创面区白细胞数量无统计学差异per2-突变小鼠和对照小鼠。伤口部位的白细胞数与ZT组间无统计学差异per2-突变体和对照组小鼠(图7)。
图7．低浓缩铀c皮肤伤口样本中细胞的定量．A.伤口区域白细胞数量per2-突变小鼠和对照小鼠(每组N = 7 - 13只)。B.对照组和对照组he染色伤口组织的代表性图片per2突变的老鼠。比例尺显示100微米。
上述结果表明，血管生成因子mrna之间的表达水平/表达模式存在显著差异。这些变化可以转化为伤口损伤后愈合过程中的解剖差异。因此，我们使用内皮标记CD31进行组织化学染色，分析创面的血管化情况。两组间cd31阳性血管区占整个创面面积的比例差异无统计学意义per2-突变体和对照小鼠在皮肤切口后7天(图8)，这表明损伤后血管生成因子水平的变化没有早期影响。
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数字8.创伤区血管区cd31阳性的评价per2-突变小鼠和对照小鼠。A.创面区cd31阳性血管区百分比。每组9只。B. cd31染色组织的代表性图片per2-突变小鼠和对照小鼠。
我们的研究结果显示，在完整皮肤和伤口组织中，每2个mRNA水平存在昼夜节律(图2)。我们的数据还显示，在对照组小鼠的完整皮肤中，血管生成因子mRNA水平存在昼夜节律振荡(图3)。与对照组小鼠相比，在小鼠的完整皮肤中，ANGPTL1和CSF2 mRNA水平per2-突变小鼠在ZT11处失去峰值(图4)per2-某些血管生成因子mRNA水平的昼夜节律依赖性。ANGPT2在ZT6处出现峰值per2-突变小鼠(图4)。在小鼠完好皮肤中的CSF2和MMP9 mrnaper2-突变小鼠的ZT2升高(图4)per2昼夜节律的-独立机制。昼夜节律由几种分子机制维持。因此，我们的结果提出了一种可能性，每2中断per2-突变小鼠可能激活其他昼夜节律机制，这反过来可能影响mRNA表达的昼夜节律变化。未来的研究将需要分析完整皮肤昼夜节律的机制per2突变的老鼠。
在本研究中，我们观察到创面中VEGF mRNA的相对数量在ZT6时显著降低per2(图5)。另一方面，ZT 6和18的差异有统计学意义per2观察创面中-突变小鼠的VEGF mRNA表达(图5)。结合下面总结的最新发现，我们的结果表明创面区域浸润中性粒细胞的VEGF mRNA表达可能受到per2蛋白的影响。已知VEGF在伤口愈合过程中起着重要作用。已知白细胞是VEGF[17]的来源之一。我们前期研究显示[1]白细胞中存在VEGF。环磷酰胺可显著降低皮肤切口后1、3天伤口内白细胞数量。在这种情况下，VEGF的表达受到抑制，提示创面浸润的白细胞可能是VEGF[3]的来源。一些研究表明VEGF昼夜振荡。VEGF在人滋养层细胞系[18]中表现出受生物钟影响的昼夜节律。森野奎et al。结果表明，在小鼠体内植入的肿瘤细胞中，VEGF mRNA的水平随着缺氧的反应而大幅上升，但其水平有节律地昼夜波动。Per2在植入的肿瘤细胞中表现出昼夜振荡，并抑制缺氧诱导Vegf启动子活性[4]。詹森et al。显示Bmal1直接结合并激活Vegf发起人通过电子盒子[19]。因为它表明per1而且per2如果小鼠外周血白细胞[5]的mRNA表达呈现昼夜节律振荡，那么可以想象，白细胞中VEGF的产生可能受到per2的影响。
在之前的研究中，per2-突变小鼠表现出无法稳定HIF1a[10]。Per2抑制了Clock-Bmal1-和clock - bmal2依赖的转激活Pai1体外启动子[11]。先前的研究表明，TGFb1的表达在per2-突变型胆汁淤积性肝[20]。因此，我们研究了伤口组织中其他各种血管生成因子。
我们从伤口组织分析的结果显示，在ZT11中angpt2mrna有统计学意义上的升高per2-突变小鼠与对照小鼠比较。在ZT18中ANGPTL1 mRNA表达明显升高per2-突变小鼠(图5)。这些新发现表明per2参与ANGPT2和ANGPTL1昼夜节律。
另一方面，ZT之间的差异有统计学意义per2在创面-突变小鼠中观察VEGF、CXCL2、MMP9、TGFb1、ANGPTL2、FGF1、ANGPT1、CSF3、PAI1的mRNA表达(图5、6)，提示存在per2血管生成因子的昼夜节律独立机制。
包括VEGF在内的一些血管生成因子由白细胞产生[1,3]。我们的组织学研究显示，在伤口区域的白细胞积累没有统计学上的显著波动per2-突变体小鼠和对照小鼠(图7)。这表明mRNA的振荡可能是由于细胞内mRNA的波动。
的per2已知该基因在小鼠[21]心肌梗死后维持早期内皮祖细胞功能和血管生成。per2-突变小鼠血管衰老加剧，内皮祖细胞功能受损[22]。因此，我们采用免疫组化方法对创面内cd31阳性内皮细胞进行分析。两组cd31阳性血管面积差异无统计学意义per2-突变体小鼠和对照小鼠在皮肤切口后7天的伤口组织中。因此，在组织学上，7天后评估的创伤血管生成反应在每2突变体小鼠和对照小鼠之间没有差异(图8)et al。证明了生物钟缺陷per1/per2无足轻重的人而且Bmal1-/-小鼠显示伤口愈合缺陷[23]。需要进一步的研究来彻底了解per2伤口愈合过程不足。
我们的研究证明了一个新的发现，血管生成因子mRNA的表达在小鼠皮肤伤口受到影响per2基因。我们的结果也表明per2某些血管生成因子mrna的昼夜节律独立机制。为了更清楚地了解昼夜节律如何影响愈合过程，还需要进行更多的研究。
本研究得到了日本jsp KAKENHI基金15K08883的支持。
那种Nishizawa
军事大学
研究文章
收稿日期:2017年3月5日
录用日期:2017年4月11日
出版日期:2017年4月14日
©2017 Hoshi T.这是一篇根据创作共用署名许可条款发布的开放获取文章，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
胡晓东，田凯林，杨晓明，杨晓明(2017)小鼠皮肤和伤口组织血管生成因子的昼夜节律研究。生物医学研究临床实践2:DOI: 10.15761/BRCP.1000135
日本东京板桥区加贺2-11-1，帝京大学医学院法律医学系
图1所示。创面实验设计。per2 -将突变小鼠和对照小鼠分为4组:1 (ZT2)、2 (ZT6)、3 (ZT11)和4 (ZT18)。白色条表示亮期，而填充条表示暗期。每组在特定的ZT时间点(填充箭头)进行切口创口。24小时后同一ZT时间点(白色箭头)采集皮肤组织。
图2。mRNA的表达per2信使核糖核酸在完整的皮肤以及对照组小鼠的伤口组织在4个不同的ZT时间点实线指的是完整的皮肤，而虚线指的是伤口组织。数据表示为从ZT2(相对数量，N = 12到14)的折叠级变化。
图3．对照小鼠完整皮肤中不同血管生成因子的mRNA水平。血管生成因子mRNA水平分析。值得注意的是，根据一天中的时间，检测到四种不同的模式，由四个面板表示(N=4到5;* p <0.05， ** p <0.01)
图4．不同血管生成因子的mRNA水平per2 -变异小鼠皮肤与对照小鼠皮肤的比较。实线对应控制鼠皮肤，虚线对应per2-突变鼠皮肤。所示为完整皮肤的mRNA分析。per2 -与对照小鼠相比，突变小鼠在某些血管生成因子上表现出明显的昼夜节律模式。(N = 5 - 9;* p <0.05， ** p <0.01)。
图5。血管生成因子mrna的昼夜节律模式(相对数量;伤口组织减去完整组织)的per2 -变异小鼠和对照小鼠。前三组(VEGF、ANGPT2和ANGPTL1)之间差异有统计学意义per2 -突变体小鼠和对照小鼠，而较低的五组之间显示相似的模式per2 -变异小鼠和对照小鼠。实线指控制鼠标，虚线指控制鼠标per2 -突变的老鼠。数字符号(#)是指对照和相同ZT点的比较per2 -突变的老鼠。(n = 10-15;* p <0.05， ** p <001， *** p <0.001， **** p <0.0001;# p <0.05， ## p <0.01)。
图6。其他各种c血管生成因子mrna的昼夜节律模式(相对数量;伤口组织减去完整组织)的per2 -变异小鼠和对照小鼠。实线指控制鼠，虚线指控制鼠per2 -突变的老鼠。(n = 9-15;* p <0.05， ** p <001， *** p <0.001)。
图7．低浓缩铀c皮肤伤口样本中细胞的定量．A.伤口区域白细胞数量per2-突变小鼠和对照小鼠(每组N = 7 - 13只)。B.对照组和对照组he染色伤口组织的代表性图片per2突变的老鼠。比例尺显示100微米。
数字8.创伤区血管区cd31阳性的评价per2-突变小鼠和对照小鼠。A.创面区cd31阳性血管区百分比。每组9只。B. cd31染色组织的代表性图片per2-突变小鼠和对照小鼠。
