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摘要

成人骨髓间充质干细胞（MSCs）在炎症性肠病（IBD）患者中具有抗炎特性，但全身给药与安全性相关。局部给药MSCs是否能提供与全身给药相似的疗效尚不清楚。在结肠炎动物模型中，比较局部给药MSCs与全身给药和非MSC治疗。三硝基苯磺酸（TNBS）在Wistar大鼠中诱导结肠炎。在该模型中，局部MSCs与静脉MSCs、阿达木单抗、英夫利昔单抗和对照进行比较。使用临床标准（即体重、粪便特征）和血清白细胞介素6（IL-6）的系列测量TNF测量和宏观和微观评分用于评估治疗效果。局部和静脉注射干细胞治疗可显著防止TNBS小鼠在结肠炎第3天的体重减轻。有更多证据表明主要在第3天存在差异（p<0.001）.IV或PR干细胞还可将血清IL-6和TNF水平降低至与抗TNF治疗动物相似的水平。在肠道，干细胞治疗可改善TNBS引起的微观和宏观损伤。直肠输送的干细胞产生与IV输送的干细胞相似的结果。本研究表明直肠干细胞ls在动物模型中治疗结肠炎的程度与静脉注射干细胞和全身抗TNF疗法相似。其作用机制值得进一步研究。

关键字

局部干细胞，静脉注射干细胞，阿达木单抗，英夫利昔单抗，结肠炎模型

介绍

炎症性肠病的病理生理学基础是与肠腔相关或不相关的环境因素相关的遗传，并产生加剧的炎症反应，导致肠或肠外临床表现[1-4]。

近年来，实验模型极大地促进了对这些疾病的理解，使特异性高的药物得以开发，直接作用于靶炎症介质，如肿瘤坏死因子(TNF-alpha)和粘附分子等。这一进展使治疗提供者能够改变这些疾病的自然史，提高受影响患者的生活质量，降低住院和手术干预率。尽管这些药物已经改变了治疗方案，但多年来已经观察到由于失去反应而导致的主要药物失败。原发性失败率超过40%，系列临床研究表明原发性失败率为10 - 20%。在一年内，这种反应丧失可能在23 - 43%的病例[6]之间。遗传因素、疾病持续时间、吸烟甚至抗药物抗体的产生都与原发性失败有关[6,8]。

相反，最近的研究表明，在对传统药物治疗不耐受或治疗失败的患者中，有可能使用与药物治疗不同的免疫途径(细胞治疗)进行治疗。

细胞治疗可以代表间充质干细胞产生的肠道因子的优化，这些因子通过调节错误加剧的免疫反应和诱导肠道稳态，抑制tnf - α和白介素6 (IL-6)的能力，在实验模型和人类中，对结肠黏膜的愈合产生重要的临床反应[9-11]。这种治疗的限制因素之一与机会性感染和不受控制的细胞发育有关，从而导致肿瘤[12,13]。除了这些数据外，这些细胞还有迁移到病变部位的能力，即使应用在远离病变的地方[1,14]。

这些证据鼓励了有关这些细胞在结肠局部应用的研究，这有可能成为一种新的药物策略，并可能减少这种疗法[1]的副作用。

目标

本研究旨在评估间充质干细胞移植在实验性结肠炎动物中的适用性和结果，并比较干细胞在英夫利昔单抗和阿达木单抗治疗动物中的效果。

材料和方法

根据Morris[15]，用三硝基苯磺酸（TNBS）在体重约250g的雄性Wistar大鼠身上产生实验性损伤。在TNBS损伤形成前和TNBS给药后24小时对动物进行评估。本研究由六个不同的组组成，n=30只动物。第1组（仅生理盐水）2（TNBS）、3（TNBS+阿达木单抗）、4（TNBS+英夫利昔单抗）、5（TNBS+尾干细胞）和6（TNBS+直肠干细胞）。所有组均采用相同的评估方法，采集血样以评估对照组（TNBS）和（仅生理盐水）的IL6和TNF水平TNBS损伤后1小时和治疗组中TNBS损伤后24小时。对动物进行细胞治疗或抗TNFs治疗，1小时后采集血样。用抗TNFα大鼠集Elisa（BD Pharmigen）和IL6大鼠集Elisa测定这些炎症标记物（IL6和TNFα）的血清分数（BD Pharmigen）和血浆水平根据制造商的说明进行测量。同时应用临床标准，如动物体重和粪便特征。第四天，对动物实施安乐死，并记录宏观和微观评分。评分遵循Yugo e col[16]定义的标准.

按照Reis的模型获得干细胞et al。［17］．采用方差分析(ANOVA)和Tukey检验进行统计分析，以评估所有处理在不同时期观察到的差异。统计学意义为p<0.05。所有的统计分析和图表都是在Minitab中生成的^®16.1.1（小型选项卡^®是Minitab Inc.）的商标。

结果

实验性TNBS结肠炎模型与对照组（仅生理盐水）相比，其疗效得到证实我们可以观察到，与盐水对照组相比，实验性TNBS结肠炎的动物体重显著减轻，IL6和TNF-α水平升高，宏观和微观评分也更高（p<0.01）。

与抗肿瘤坏死因子治疗组相比，TNBS单独治疗组的动物体重依次显著下降，这一观察在实验第三天更加明显(p<0.005)，证明了治疗的有效性(图1)。有更大的证据表明这种差异，主要在第三天(p<0.001)。在粪便特征方面，TNBS组直到第4天都有腹泻，与所有接受治疗的组相比(图1)。在炎症介质方面，TNBS组(对照组)检测到的TNF和IL6水平高于抗TNF或干细胞组。Adalimumab (p=0.024)、英夫利昔单抗(p<0.01)、静脉和局部干细胞治疗(p<0.001)均可观察到显著差异(见图2和3)。TNBS组与抗tnf组及干细胞组之间得分最高(p<0.001)(图4)。显微镜下，TNBS组与抗tnf组和干细胞组比较有显著差异(p<0.001)(图5)。

数字1采用不同疗法的TNBS诱导结肠炎后体重随时间的平均值(p小于0.005)。

数字2. 治疗组间TNBS诱导结肠炎后的平均血清TNF（p˂0.001）。

数字三。治疗组间TNBS诱导结肠炎后的平均血清IL6（p˂0.001）。

数字4.诱导TNBS结肠炎后第4天的结肠肉眼评分(p<0.001)。

数字5.诱导TNBS结肠炎后第4天的结肠镜评分。

讨论

目前的研究是前所未有的，应用于Wistar动物，并比较了间充质干细胞通过灌肠和静脉注射与其他已知疗法，如抗肿瘤坏死因子[18]．

传统上，炎症性疾病的药物治疗主要是修复因抑制细胞因子，特别是tnf - α而引起的组织损伤。除此之外，多药疗法在治疗中持续存在高水平的失败，经常观察到副作用[19]。

本研究确定了在Wistar使用间充质干细胞的新治疗途径，以最大限度地减少静脉细胞治疗的副作用，并比较这些治疗与生物治疗的有效性[12]。

这项研究表明，与正常组（生理盐水）相比，TNBS在产生组织损伤方面的有效性并不显著，在正常组（生理盐水）中，患病动物体重显著减轻，血清IL6和TNF-α水平显著升高（图1-3）.在宏观和微观上，与未经治疗的动物相比，患病组的得分较高（p<0.001）（分别见图4和图5）。

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相反，当动物接受生物制剂治疗时，体重开始恢复，在英夫利昔单抗治疗后阿达木单抗治疗的动物中，这种差异更明显(p<0.001)。在临床上，与英夫利昔单抗治疗相比，阿达木单抗治疗的动物往往需要更长的时间来恢复体重(p<0.05)，这可能是因为阿达木单抗是一种人源化的生物制剂，而英夫利昔单抗是一种嵌合体，对小鼠tnf -具有更大的特异性。与TNBS组相比，细胞治疗组直肠和静脉应用均开始恢复体重;第3天的差异尤其显著(p<0.001)。

总的来说，与疾病组相比，使用生物制剂或干细胞（静脉或局部）治疗组的血清炎症参数（TNF-α和IL6）较低。在组间分析（生物组）中未发现显著差异（p<0.05），这表明两种治疗方法均能有效阻断细胞因子。当比较抗肿瘤坏死因子和细胞治疗药物时，抗肿瘤坏死因子被证明比干细胞更有效（p<0.01）。

在宏观和显微镜下，与患病组相比，所有治疗的动物都表现出更好的评分(图4和5)。抗tnf制剂之间没有观察到差异(p<0.995和p<0.994)，两者对黏膜愈合的效果相似。

干细胞的组织学和宏观恢复也得到了观察，两种治疗方法之间没有差异（分别为p<0.995和p<0.604）。因此，我们观察到，即使通过灌肠应用，干细胞也有治疗效果。

以往的研究表明，细胞反应最初是通过这些细胞迁移到目标位置和这些细胞在目标组织中的分化来解释的。这一事实解释了为什么当通过灌肠在结肠中进行治疗时，细胞反应是足够的[1]。Hezet al。证明间充质细胞抑制IL6和TNF-α并诱导组织修复的能力，与t软管演示在这里[1]。

从生理学角度来看，这些效应似乎与旁分泌信号直接相关，旁分泌信号有利于干细胞迁移到病变部位，无论其位置如何。另一种假设是基于细胞间的接触，结合类似于基质的细胞增殖，炎症免疫反应的调节特性，以及对炎症级联[20]起扫描作用的细胞因子抑制剂和活性氧(NO)的释放。其他研究也报道了细胞治疗在TNBS损伤[7]存在时的预防作用。

最近，Stavely et col.研究表明，在结肠炎动物模型(豚鼠骨髓间充质干细胞)中，间充质干细胞能够有效渗透和白细胞浸润黏膜和肌丛，并分泌TGF-β1，从而能够免疫调节炎症反应[21,22]。因此，这些因素的联合已经证明是TNBS引起的实验性结肠炎可以减弱[22]的机制之一。

间充质干细胞灌肠实验已应用于豚鼠，证明这些细胞在治疗神经病变和丛状炎的有效性。以及来自脂肪组织的间充质干细胞[23,24]。

众所周知，与Wistar大鼠的实验模型相比，在豚鼠身上的研究似乎更有效地模拟了炎症疾病，因为它发生在人类身上。然而，这两项研究可以通过灌肠[25]加强这些细胞的适用性的新途径。

我们只在损伤已经确定的情况下才使用细胞治疗，但最近的研究表明，这些细胞可以防止组织损伤[26-29]。

结论

这项研究提出了治疗炎症性肠病的新方法，与使用局部和静脉应用干细胞有关。虽然我们通过静脉注射获得了更好的结果，但我们相信，在未来，通过灌肠可以提供副作用更少的干细胞应用。临床参数、微观和宏观评分以及炎症化学介质(包括IL-6和tnf - α)的评估都支持这些结论。还需要进行更多的研究以获得这些关联的进一步证据。

确认

Alan Moss医学博士，BIDMC，哈佛/波士顿。

工具书类

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