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摘要

5-氟尿嘧啶(5-FU)广泛用于癌症治疗，无论是单独使用还是与其他抗癌药物联合使用。然而，由于5-FU在体内代谢迅速，其膜通透性差，半衰期短(5-20分钟)，因此需要持续给予高剂量5-FU以维持最低治疗血清浓度。这与显著的副作用和可能的严重毒性作用有关。本研究旨在制备负载5-FU的ph敏感脂质体纳米颗粒(pHLNps-5-FU)，并评价其5-FU的释放特性和抗癌作用。采用粒度分析仪测定颗粒大小和zeta电位。在37°C、pH 3、5、6.5和7.4条件下，评估了pHLNp -5- fu制剂的释放模式，同时评估了pHLNp中5- fu的药物释放动力学_3.^＿在不同时间点(37°C) pH值为3和7.4时测定5-FU的配方。通过细胞活力和克隆性研究来评估pHLNps-5-FU对HCT-116和HT-29细胞系的有效性，同时通过流式细胞术和共聚焦成像检测罗丹明标记的pHLNps-5-FU的细胞摄取。pHLNp的平均大小₁^＿研究者用,pHLNp₂^＿5-FU和pHLNp_3.^＿5-FU脂质体分别为200 nm±9.8 nm、181.9 nm±9.1 nm和164.3 nm±8.4 nm。在体外pH为3.8时，不同pHLNps-5-FU制剂的5-FU释放量最高。用pHLNps-5-FU处理的两种细胞系都表现出活力降低，比5- fu处理的细胞低两到三倍。流式细胞术和共聚焦成像证实了罗丹明标记的pHLNps-5-FU在两种细胞系中的高摄取。所选pHLNp的药物释放谱_3.-5-FU在pH值为3时释放效果最佳，在pH值为7.4时释放效果最差。pHLNp的发布概要_3.-5-FU在pH值为3时的释放量是pH值为7.4时的2倍。本研究证明了pHLNp_3.-5-FU可能是治疗结直肠癌的潜在候选药物。

关键字

ph敏感脂质体，纳米颗粒，5 -氟尿嘧啶(研究者用)，结直肠癌，克隆性测定

介绍

结直肠癌(CRC)是在结肠或直肠组织中形成的异常生长或息肉。结直肠癌是世界上第三常见的癌症，也是西方世界癌症相关死亡的第二大常见原因[1-5]。据估计，2015年将诊断出93,090例结肠癌新病例和39,610例直肠癌新病例;预计49,700例癌症相关死亡可归因于结直肠癌[6]。

除了放疗、手术和生物疗法(免疫疗法和激素疗法)外，细胞毒性药物是临床上用于治疗癌症的主要化疗方案[7]。目前使用的大多数化疗药物以某种方式干扰细胞复制，要么像核苷类似物一样起作用(导致s期阻滞)，要么破坏脱氧核糖核酸(DNA)。由于癌细胞经历快速的细胞分裂，它们通常比正常细胞更容易受到这些药物的影响。此外，癌细胞往往缺乏识别和/或修复DNA损伤的能力，导致细胞DNA复制不当，最终导致细胞死亡。该疗法的负面影响是广泛的，包括化疗耐药和干扰正常细胞分裂，造成严重的药物毒性[7]。下一代靶向药物可能没有什么副作用，因为它们被设计成更准确地针对特定因素，比如在正常细胞中几乎不存在或从不存在的过度表达的受体或蛋白质。这些药物大部分仍处于临床试验阶段，大多数患者无法获得这些药物，或者除了一些众所周知的例外，它们几乎没有在临床中普遍使用(即。靶向人表皮生长因子受体2 (HER2)的曲妥珠单抗和各种表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂[7,8]。

5-FU是一种嘧啶类似物类型的抗代谢物，对实体肿瘤具有广谱活性，无论是单独使用还是与其他化疗方案联合使用。由于其结构是一种类似于尿嘧啶和胸腺嘧啶的碱基类似物，5-FU通过与核糖核酸(RNA)和DNA结合而干扰核苷代谢，导致细胞毒性和细胞死亡。尽管具有治疗效果，但5-FU也有局限性，包括:1)肿瘤细胞耐药;例如，晚期结直肠癌单独使用5- fu的总有效率为10-20%，而5- fu联合其他抗肿瘤药物的总有效率为40-45% [9];ii)生物半衰期短(5 -20分钟)，这是由于体内代谢迅速所致;因此，维持治疗性血清浓度往往需要持续高剂量给药，这可能导致严重的毒性[7,10]。

这些问题可以通过在递送系统中配制5-FU来缓解，该系统会导致药物在肿瘤区域的积累，并增加在癌细胞中的暴露时间。具有这些特性的合适的5-FU给药系统应具有以下特性:A)物理稳定性;B)体积小，允许毛细血管分布和均匀灌注在所需的目标部位;c)携带足量药物的能力，可以忽略不计或低药物泄漏，d)保护5-FU不被降解的能力，以及e)载体在所需靶点的5-FU释放率可控(或可预测)[11,12]。

最近，脂质体研究的重点是如何提高脂质体介导生物活性分子在细胞内传递的能力[13]。这导致了脂质体的出现，称为隐形脂质体(脂质体与聚乙二醇(PEG)立体稳定)。隐形脂质体比聚合物更适合作为5-FU的递送系统，因为它们稳定，生物相容性，可生物降解，缺乏免疫原性反应，并且总体上具有上述良好递送系统的特性，而聚合物可能会导致天然分解产物的严重毒性。此外，美国食品和药物管理局(FDA)此前已批准隐形脂质体用于递送阿霉素用于治疗乳腺癌和卵巢癌[14]。

pH敏感脂质体是隐形脂质体的一种改良形式，在生理pH (pH 7.4)下稳定，但在酸性条件下不稳定。据报道，由于它们的促聚变特性，它们在递送抗癌药物方面比传统的或长循环的脂质体更有效[13]。ph敏感的隐形脂质体被适当的部分功能化(即。一种抗体)靶向表达癌细胞的受体，如EGFR，已被证明可显著增加其脂质体含量的细胞内递送[15]。

在这项研究中，我们描述了负载5- fu的ph敏感脂质体纳米颗粒的开发，该脂质体具有表面修饰的抗egfr抗体偶联的pHLNps-5-FU，并提供了一种新的方法在体外评价其在癌症化疗中的治疗潜力。的在体外利用建立的结直肠癌细胞培养模型HCT-116和HT-29细胞系，分析并比较了pHLNps-5-FU的摄取和细胞毒活性。

材料与方法

材料

所有化学药品包括5-FU和试剂均购自Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)。二油基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS)、磷脂酰胆碱(L-α- pc)、1,2-二油基-3-三甲基丙烯酰胺(DOTAP)、胆固醇(CH)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- n-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- n-[叶酸(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG))脂质均来自Avanti Polar lipids, Inc. (Alabaster, AL, USA)。肿瘤细胞系HCT-116和HT-29于2013年1月从美国类型培养收集(ATCC)获得。

负载5-FU ph敏感脂质体纳米颗粒的制备

不同的含5-FU和pHLNp的ph敏感脂质体纳米颗粒(pHLNp₁研究者用_，pHLNp₂-5-FU和pHLNp_3.-5-FU)采用薄膜水化法制备[16]。简而言之，以不同的摩尔比测量不同数量的脂质(表1)，并将其放置在不同的圆底烧瓶中。然后将脂质溶解在氯仿中并彻底混合。然后将氮气通过通风柜内的烧瓶内壁除去氯仿。得到的薄膜进一步在真空下干燥过夜以去除任何残留物。然后在高于脂质转变温度(60℃)的温度下，用2ml pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)水化干燥的膜，其中含有19µM 5-FU。然后将水合膜涡旋1分钟，浴声5分钟。然后将得到的多层脂质体囊泡通过200 nm聚碳酸酯过滤膜挤压，以进一步减小其尺寸。最后用分子量为12 kDa的切断透析管对PBS透析24小时，除去游离的5-FU。

表1。5-FU负载ph敏感脂质体纳米颗粒的表征

数据以均数±SEM表示，n = 3(二油基磷脂酰乙醇胺(DOPE)，半琥珀酸胆固醇(CHEMS)，胆固醇(CH)， 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- n-[氨基(聚乙烯乙二醇)-2000](DSPE-PEG)₂₀₀₀)、磷脂酰胆碱(PC))

ph敏感性脂质体纳米颗粒的表征

尺寸测量:毛坯的粒径和zeta电位，pHLNp_1，pHLNp_2，和pHLNp_3.以及相应的5-FU、pHLNp₁研究者用_，pHLNp₂-5-FU和pHLNp_3.-5-FU采用zeta电位/粒度仪(NICOMP™380 ZLS)动态光散射测定(表1)。所有测量均为三次，结果以平均直径±SEM报告。

捕集效率(EE %):10毫克冻干pHLNp₁研究者用_，pHLNp₂-5-FU，或pHLNp_3.-5-FU悬浮于2ml PBS (pH 7.4)中。加入100µL 30% Triton X-100搅黄脂质体悬液，轻轻混合2 min，在室温下6000 rpm离心5 min。收集上清液，用反相高效液相色谱(HPLC)分析5- fu。反相HPLC:制备由95% PBS和5%甲醇组成的流动相溶液，按所述方法进行过滤[17]。内标品或样品进样量为20µL，泵入XB-C18柱，流速1.0 mL/min (250 mm × 4.6 mm;安捷伦，圣克拉拉，加州)在室温下。用Waters 996光电二极管阵列探测器(Waters, Columbia Maryland)在270 nm处检测5-FU。美国)。捕集效率计算公式如下:

(1)

红外光谱分析:通过高效液相色谱分析，得到pHLNp_3.发现配方中5-FU的EE(%)最高(表1)。进一步对pHLNp进行FTIR分析_3.确认5-FU的掺入。物理混合物(冻干空白pHLNp)_3.和5-FU)，冻干空白pHLNp_3.5-FU和冻干的pHLNP_3.-5-FU在740 ~ 4000 cm的光谱范围内分析¹使用FTIR分光光度计(PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Connecticut, USA)。然后用获得的光谱来确定pHLNP中是否存在5-FU_3.

体外药物释放评价

5-FU在不同pH值下的释放:制备不同pH值(3.0、5.0、6.5、7.4)的缓冲溶液，并取含2.5 mg/ml pHLNp的脂质体纳米悬浮液1ml₁研究者用_，pHLNp₂-5-FU，或pHLNp_3.将-5-FU放入透析袋中;将其完全浸入不同pH值的溶液中，在37℃下连续搅拌24小时(100 rpm)。24小时后，从每个接收腔中取出500µL溶液，使用如上所述的反相高效液相色谱分析5-FU的存在。

5-FU在不同时间点的释放:制备pH为3.0的缓冲溶液和1 ml含有2.5 mg/ml pHLNp的脂质体纳米颗粒悬浮液₁研究者用_，pHLNp₂-5-FU，或pHLNp_3.将-5-FU置于透析袋中，完全浸入pH 3的溶液中，在37℃下以100 rpm连续搅拌24小时。在预定的时间间隔1、5、10、15、30、60、120、240、480、720和1440 min，抽取500µL的接收器溶液，在37℃下用等体积的新鲜PBS代替。采用反相高效液相色谱法测定各样品溶液中5-FU的含量。

细胞生存能力

的在体外游离5-FU、pHLNp的细胞毒性₁研究者用_，pHLNp₂-5-FU，或pHLNp_3.用HCT-116和HT-29结肠癌细胞系对-5-FU进行评价。将HCT-116和HT-29细胞系以5 × 10的密度接种于12孔板中^3.在DMEM/F12培养基中添加2 mM l -谷氨酰胺、10 mM HEPES、10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素。用不同浓度的5-FU或其等同物在pHLNp中处理细胞₁研究者用_，pHLNp₂-5-FU或pHLNp_3.-5-FU后，达到75%的汇合。48小时后，终止实验，分离细胞，用2%台盼蓝染色，用自动细胞计数器(Bio-Rad TC- 20™)计数。测定相对于对照的细胞存活率(%)。

细胞吸收

共焦成像:HCT-116和HT-29癌细胞以2 × 10的细胞密度生长在6孔板(带盖片)中^3.，在37°C下放置24小时。然后用罗丹明标记的phlnp在生长培养基中处理细胞(Rho-pHLNp)_1，Rho-pHLNp_2，或Rho-pHLNp_3.)。3小时后，Rho-pHLNp_1，Rho-pHLNp₂或Rho-pHLNp_3.取出细胞，用PBS (pH 7.4)轻洗两次。加入0.75µg/ml 4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)进行核染色;最后，用4%多聚甲醛固定细胞，然后用徕卡SP2多光子系统安装和成像。

pHLNP溶酶体给药Lyso Tracker Red ddn -99将HT-29和HCT-116细胞以2.5 × 10的密度接种在盖片上⁵在6孔板中每孔。培养24小时后，用500µg/ml的Lucifer黄标记的pHLNP孵育细胞_3.研究者用(LY-pHLNP_3.-5-FU)在37℃下孵育4 h，然后用LysoTracker Red ddn -99 (200 nM)孵育1 h。然后用冷PBS (pH 7.4)洗涤细胞三次，用4%多聚甲醛固定细胞，用载玻片将盖片细胞侧向下安装，使用蔡司LSM 880共聚焦显微镜观察[18]。

流式细胞仪:将HCT-116和HT-29细胞以5 × 10的密度涂于6孔板上，测定细胞对负载5- fu的脂质体纳米颗粒的摄取⁵在生长培养基中培养至75%汇合。细胞用不同的罗丹明标记脂质体(Rho-pHLNp)孵育_1，Rho-pHLNp₂或Rho-pHLNp_3.)在37°C下放置24小时。孵育后，用0.25%胰蛋白酶- edta溶液将细胞从培养板上分离，用PBS洗涤三次，以3000 rpm离心5分钟。最后，将细胞重新悬浮在500µl PBS中，用4%多聚甲醛固定，并保存在冰中，直到使用BD FACSCanto™Analyzer和BD FACSAria™Cell Sorter (BD Biosciences)进行分析。

菌落形成试验

将HCT-116和HT-29细胞系接种到T-25cm中进行集落实验²培养瓶的密度为5 × 10⁵DMEM/F12培养基中添加2 mM l -谷氨酰胺、10 mM HEPES、10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。当细胞达到75%的融合度后，将其暴露于不同浓度的游离5-FU和pHLNP中_3.研究者用。暴露48小时和两次处理后，终止实验，收获细胞，然后以每孔200、500和1000个细胞的密度重新镀于6孔板上，用生长培养基孵育。对照细胞达到75%汇合后，用0.5%结晶紫溶液固定染色，终止实验。使用Jenco™立体显微镜计数染色菌落(每个菌落50个);计算电镀效率(PE)和存活分数(SF)，生成存活曲线图[19]。

统计分析

所有实验一组三次，使用GraphPad Prism软件(GraphPad software Inc.， La Jolla, CA. USA)进行分析。5-FU治疗组与pHLNp治疗组的差异₁研究者用_，pHLNp₂-5-FU或pHLNp_3.-5-FU采用Student’s配对t检验，p<0.05为显著性。

结果

5-FU ph敏感脂质体纳米颗粒的表征

空白脂质体纳米粒子pHLNp的平均粒径_1，pHLNp₂，以及php_3.分别为189.3 nm±7.7 nm、155.4 nm±8.5 nm和136 nm±10.2 nm;pHLNp₁^＿研究者用,pHLNp₂^＿5-FU和pHLNp_3.^＿5-FU分别为200 nm±9.8 nm、181.9 nm±9.1 nm和164.3 nm±8.4 nm(表1)_3.^＿5-FU捕集效率最高，为54.17%，pHLNp捕集效率最高₁^＿5-FU和pHLNp₂^＿5-FU的等效EE分别为3.25%和4.74%。pHLNp的zeta电位值₁^＿研究者用,pHLNp₂^＿5-FU和pHLNp_3.^＿5-FU分别为5.16±1.4、1.98±0.5、1.23±0.8(表1)。

红外光谱分析

虽然FTIR分析并不能完全确定5-FU在脂质体载体中的包裹性，但它可以用来评估5-FU与载体的关联。仔细检查5-FU光谱发现，与空白或空pHLNPs载体相比，5-FU(图A和D)的吸收峰完全不同(图1 A和D)。此外，5-FU(图A)和空白pHLNPs(图1 D)的吸收峰与pHLNPs-5-FU(图1 B)的吸收峰不相似。pHLNPs-5-FU峰的独特特征清楚地表明了5-FU与pHLNPs载体之间的密切联系。纯5-FU的FTIR光谱显示在3120 cm处有-N-H拉伸¹和-C =O拉伸在1644.9 cm¹。在分析的pHLNPs-5-FU样品中也看到了相同的拉伸，因此证实了5-FU与脂质体纳米载体的相互作用。

图1所示。红外光谱谱。

一个;研究者用。B;pHLNps-5-FU。C;物理混合(化学，化学，TWEEN 20, DSPE-PEG)₂₀₀₀)。D;空白pHLNPs。

体外5-FU释放

5-FU在不同pH值下的释放

随着pH值从3增加到7.4,5-FU的释放率下降。这是在所有pHLNPs-5-FU制剂中观察到的总体趋势，如图2A所示。然而,pHLNP_3.与pHLNP相比，-5-FU制剂的5-FU释放量要大得多(图2B)₁-5-FU和pHLNP₂-5-FU(图2A)。在所有配方中，pHLNP_3.-5-FU在pH为3时5-FU的释放量最高(30%)，而在pH为7.4时5-FU的释放量最高(15%)。此外,pHLNP_3.与pHLNP相比，-5-FU对ph最敏感₁-5-FU和pHLNP₂pH为3时-5-FU。

图2。体外释放5-FU。

A和B;体外pHLNP中5-FU的释放₁, pHLNP₂和pHLNP_3.在不同的pH值下C;pHLNP中5-FU的累积释放_3.pH为3时。

5-FU在不同时间点的释放

pHLNP中5-FU的累积释放谱_3.pH为3时-5-FU为双相，如图3C所示。在最初的100分钟内，5-FU的初始快速释放量为35%，随后在700分钟(从100到800分钟)内，额外释放15%。800min后，5-FU释放量不随时间增加而显著增加;从800分钟到1440分钟，只有3%的5-FU被释放(图2C)。

图3。5-FU和pHLNPs-5-FU对细胞活力的影响

5-FU和pHLNP的细胞毒性₁研究者用,pHLNP₂-5-FU和pHLNP_3.-5-FU作用于hct -29 (A)和HCT-116 (B)细胞系。(5-FU vs. pHLNP_3.研究者用;*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001)。p值由Student 's计算t以及。数据为均值±SD, n=3。

细胞生存能力

图3显示了增加5-FU、pHLNP浓度的效果₁研究者用,pHLNP₂-5-FU和pHLNP_3.-5-FU对HCT-116和HT-29癌细胞活力的影响。如图3A所示，pHLNP_3.与游离5-FU相比，-5-FU在所有浓度下均显著抑制HT-29细胞的生长。此外,pHLNP_3.-5- fu的效果是pHLNP的2 - 3倍₁-5-FU或pHLNP₂研究者用。如图3B所示，pHLNP_3.与游离的5-FU、pHLNP相比，-5-FU对HCT-116细胞系最有效₁-5-FU和pHLNP₂研究者用。

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图4。剂量响应曲线的非线性拟合

5-FU与pHLNP的剂量效应₁研究者用,pHLNP₂-5-FU和pHLNP_3.-5-FU作用于HT-29 (A)和HCT-116 (B)细胞系及其相应的IC₅₀值(µM)。

例如，1µM 5- fu负载的pHLNP_3.抑制HCT-116细胞生长的效果是pHLNP的4倍₁-5-FU或pHLNP_２－在抑制HCT-116细胞生长方面，5-FU的效果是游离5-FU的3倍。为了测量游离5-FU和3种pHLNPs-5-FU制剂在抑制HT-29和HCT-116细胞生长方面的有效性，我们使用不同浓度的pHLNP对细胞活力测试获得的数据进行了建模₁研究者用,pHLNP₂-5-FU和pHLNP_3.-5-FU产生半最大抑制浓度(IC)₅₀)，如图4所示。如所料，pHLNP_3.-5-FU是最有效的配方，与IC₅₀hct -29细胞为0.4114(µM)， HCT-116细胞为0.2041(µM)。相反,pHLNP₁研究者用(集成电路₅₀对HT-29细胞和IC的影响= 6.256(µM)₅₀= 69.26µM)对HCT-116细胞生长的抑制作用最弱，pHLNP对HCT-116细胞的抑制作用最强₂研究者用(集成电路₅₀= 8.150µM对HT-29细胞和IC₅₀= 0.4107µM对HT-116细胞)对HT-29细胞效果最差。

细胞吸收

共焦成像

用dope - rho偶联的pHLNPs在37℃下处理HT-29和HCT-116细胞3小时，测定pHLNP制剂的细胞摄取;Rho-pHLNP₁, Rho-pHLNP₂和Rho-pHLNP_3.。HT-29和HCT-116细胞共聚焦图像显示Rho-pHLNP摄取显著₁, Rho-pHLNP₂和Rho-pHLNP_3.如图5所示。合并后的图像清楚地显示，大多数内化的纳米颗粒定位在细胞核内。

图5。共聚焦激光成像

Rho-pHLNP的细胞摄取_1，Rho-pHLNP₂和Rho-pHLNP_3.hct -29和HCT-116细胞孵育3小时后。DAPI染色(比例尺= 20µM)。

pHLNP在溶酶体中传递红色ddn -99

我们还研究了LysoTracker Red ddn -99的内化和细胞内命运。图6A和D显示LY-pHLNP3-5-FU大部分被细胞占用(绿色)。细胞对LysoTracker Red DN-99的摄取呈红色(图6B和E)_3.和LysoTracker Red(图6C和F)，得到的黄色表示LY-pHLNP的积累_3.溶酶体中的-5-FU对HT-29和HCT-116细胞系进行了实验。

图6。内溶体摄取pHLNP_3.-5-FU在HT-29和HCT-116细胞中的表达

HT-29;(A) pHLNP的内部化_3.-5-FU， (B)溶酶追踪器染色细胞，(C)内化pHLNP共定位_3.-5-FU和内溶酶体。hct - 116;(D) pHLNP的内部化_3.-5-FU， (E)溶酶追踪器染色的细胞，(F)内化的pHLNP共定位_3.-5-FU和内溶酶体。

流式细胞术

为了进一步证实HT-29和HCT-116细胞对制剂的内化作用，采用流式细胞术分析。图7显示Rho-pHLNP的细胞摄取情况₁, Rho-pHLNP₂和Rho-pHLNP_3.37℃孵育24小时后。结果显示两种细胞对制剂的摄取显著，但HCT-116细胞比HT-29细胞对制剂的摄取更大。

图7。流式细胞术分析

Rho-pHLNP的细胞摄取_1，Rho-pHLNP₂和Rho-pHLNP_3.流式细胞术分析hct -29和HCT-116。

殖民地化验

用游离5-FU和pHLNp处理HT-29和HCT-116细胞株后，观察其增殖特性_3.^＿5-FU通过克隆测定法。图8A显示了游离5-FU和pHLNP存活率的差异_3.-5-FU处理HT-29细胞，游离5-FU和pHLNP浓度均为_3.-5-FU升高。随着浓度从0.01µM增加到10µM, pHLNP_3.-5-FU比游离5-FU更能破坏癌细胞的增殖特性。图8B所示的生存曲线进一步证实了这一点。图9显示了随着游离5-FU和pHLNP剂量的增加，HCT-116细胞中集落形成的减少_3.-5-FU升高。图9B显示了与图8A相似的生存曲线。它还显示了pHLNP_3.与游离5-FU相比，-5-FU在0.01-10µM浓度范围内更有效，显著降低存活率。

图8。5-FU和pHLNP处理HT-29细胞的克隆测定_3.研究者用

5-FU和pHLNP处理后的菌落图像(A)和生存曲线(B)_3.研究者用。(5-FU vrs pHLNP_3.研究者用;* * p < 0.01)。p值由Student 's计算t以及。数据为均值±SD, n=3

综合起来，结果表明pHLNP_3.可增加5-FU在HT-29和HCT-116结肠直肠癌细胞中的传递和抗癌活性。

讨论

5-FU是一种低分子量药物，作为胸腺嘧啶合成酶抑制剂，阻断嘧啶胸腺嘧啶的合成，胸腺嘧啶是DNA复制所必需的。目前临床上常用它单独或与其他抗癌药物合用治疗结直肠癌[20]。为了获得最佳的治疗效果，由于5-FU的半衰期短，癌症患者需要持续使用较长时间。然而，由于缺乏特异性，长期使用5-FU治疗可能导致严重的毒性[21]。本研究的目的是开发和研究负载5-FU的ph敏感脂质体纳米颗粒(pHLNps-5-FU)，具有表面修饰的抗egfr抗体，具有以下目的:i)增加5-FU的血浆循环半衰期，ii)增加5-FU的抗癌活性，iii)降低相关毒性，iv)提高特异性。ph敏感脂质体是一种很有吸引力的递送系统，因为肿瘤部位与正常组织部位相比是相对酸性的，并且脂质体可以在酸性条件下不稳定释放其含水成分[13,22]。

三种pHLNP -5- fu制剂(pHLNP₁研究者用,pHLNP₂-5-FU和pHLNP_3.制备了-5-FU)，并通过尺寸、zeta电位和包封效率对其进行了表征;pHLNP_3.我们选择-5-FU进行进一步研究，因为它具有最高的捕获效率(54.17%)(表1)。这是由于pHLNP中存在-CH片段_3.配方，这是必要的，以防止封装的5-FU从pHLNP泄漏_3.。由于脂质体配方中存在的不饱和脂链的扭结而形成的自由空间中填充了CH分子[23]。此外，pHLNP的一个组件CHEMS_3.据报道，在酸性pH下会导致脂质体膜的不稳定，从而增强5-FU在肿瘤部位的沉积[24]。FTIR也证实了5-FU在脂质体纳米颗粒中的包埋。纯5-FU的FTIR光谱显示在3120 cm处有-N-H拉伸¹和-C =O拉伸在1644.9 cm¹(图1)。在pHLNPs中也观察到类似的拉伸或吸收峰_3.-5-FU谱提示pHLNP中含有或存在5-FU_3.。正如所料,在体外pHLNP中5-FU的释放量最高_3.与pHLNP相比₁和pHLNP₂。这可能是由于pHLNP_3.与pHLNP相比，有更多的CHEM脂质₁和pHLNP₂，推测这可能会导致配方不稳定，并在酸性条件下改善5-FU的释放。pHLNP的迅速瓦解_3.与pHLNP相比，在pH = 3时，前100分钟5-FU的释放₂或pHLNP₂归因于同样的原因[25]。

比较5-FU与pHLNP的细胞毒性₁研究者用,pHLNP₂-5-FU和pHLNP_3.-5-FU制剂对HT-29和HCT-116癌细胞系的作用，评估其最有效的抗癌剂。从细胞活力和克隆结果来看，HT-29和HCT-116细胞对pHLNP最敏感_3.-5-FU与所有其他配方相比，pHLNP₁-5-FU和pHLNP₂-5-FU效果较差。pHLNP的抗癌活性较低₁-5-FU和pHLNP₂-5-FU很大程度上归因于5-FU的低捕获。相反，pHLNP的高负载和增加的5-FU的递送_3.，再加上pHLNP的快速中断_3.可能是pHLNP在酸性条件下抗癌活性增强的重要原因_3.研究者用。这也得到了国际商会的进一步支持₅₀pHLNP的结果_3.-5-FU是对HT-29和HCT-116细胞最有效的药物。目前还不清楚IC为什么这么做₅₀对于pHLNP₂-5-FU对HCT-116细胞的作用效果远优于5-FU。

流式细胞术和共聚焦研究结果显示，Rho-pHLNP对细胞的治疗效果良好₁, Rho-pHLNP₂和Rho-pHLNP_3.导致了相当水平的细胞总Rho荧光强度，这清楚地表明pHLNP的摄取₁, pHLNP₂，以及pHLNP_3.HCT-116对脂质体纳米颗粒的摄取略高于HT-29细胞。同时进行共聚焦和流式细胞术研究，以评估细胞对我们的配方的吸收，pHLNP的递送_3.对溶酶体腔室进行了研究，以评估溶酶体的积累。LY-pHLNP_3.选择-5-FU是因为它具有很高的捕获效率和极低的集成电路₅₀值。LY-pHLNP的存在_3.-5-FU在HT-29或HCT-116细胞中呈绿色，溶酶体区室呈红色。测定LY-pHLNP的积累量_3.-5-FU溶酶体，将两幅图像合并，观察到黄色(绿色和红色的结合)(图6)，确认LY-pHLNP的存在_3.溶酶体室中的-5-FU纳米颗粒。

在肿瘤中，克隆生成试验测量单个细胞增殖形成至少50个或更多细胞集落的能力，这是细胞活力的关键指标。只有克隆源性细胞才具有引起复发或转移的能力[26]。在此基础上，检测5-FU和pHLNP对HT-29和HCT-116细胞的增殖能力_3.研究者用。的pHLNP₁-5-FU和pHLNP₂由于5-FU包埋率低，抑制能力差，因此未对-5-FU配方进行测试。数据表明pHLNP_3.与5-FU相比，-5-FU更有效地使细胞无法增殖(图8和9)。然而，在比较HT-29和HCT-116细胞时，很明显pHLNP_3.与HT-29相比，-5-FU对HCT-116的增殖破坏作用更为明显。

图8。5-FU和pHLNP处理HT-29细胞的克隆测定_3.研究者用

5-FU和pHLNP处理后的菌落图像(A)和生存曲线(B)_3.研究者用。(5-FU vrs pHLNP_3.研究者用;* * p < 0.01)。p值由Student 's计算t以及。数据为均值±SD, n=3

图9。5-FU和pHLNP处理HCT-116细胞的克隆测定_3.研究者用

5-FU和pHLNP治疗后HCT-116癌细胞的菌落图像(A)和存活曲线(B)_3.研究者用。(5-FU vrs pHLNP_3.研究者用;* * * * * p < 0.01, p < 0.001)。p值由Student 's计算t以及。数据为均值±SD, n=3

结论

我们成功研制了ph敏感热敏脂质体纳米粒子pHLNp_3.，对pH值低于4的反应非常灵敏，在此条件下5-FU的释放增强。的pHLNp_3.与5-FU相比，-5-FU纳米颗粒对HT-29和HCT-116癌细胞的抗癌作用更强。这些发现为支持pHLNp可能的治疗应用提供了强有力的证据_3.作为5-FU的给药系统，它可以克服5-FU目前的一些局限性，如膜渗透性差和半衰期短。目前,pHLNp_3.-5-FU正在动物模型中进行研究以评估在活的有机体内对肿瘤生长的疗效。

确认

本出版物中报道的研究由美国国立卫生研究院(NIH)的国家少数民族健康和健康差异研究所(NIMHD)支持，奖励号为G12MD007582-28和U54MD008149。

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