日本三重大学医学院胃肠和儿科外科
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DOI: 10.15761 / BRCP.1000121
以c反应蛋白(CRP)升高为证据的系统性炎症的结直肠癌患者预后明显较差。最近的报道表明，resolvin D1，一种由二十二碳六烯酸(DHA)产生的新型脂质介质，可以激活减轻炎症的因子。本研究旨在探讨CRP与resolvins (resolvin D1和resolvin E1)之间的关系，以及DHA对伴有全身炎症反应的结直肠癌患者CRP的影响。
采用市售检测试剂盒，研究结直肠癌患者血清CRP水平与化解蛋白之间的关系。用结直肠癌细胞系评价了DHA和/或二十碳五烯酸(EPA)对细胞增殖的影响。本临床研究旨在检查在晚期或复发性结直肠癌患者中，补充2.2 g/天富含dha的鱼油1周是否能改善全身炎症反应。
CRP≧0.5 mg/dL的结直肠患者血清resolvin D1水平明显低于无CRP≧0.5 mg/dL的结直肠患者。在在体外研究表明，DHA比EPA更有效地抑制细胞增殖。选取10例化疗中的大肠癌患者进行临床补充研究。10例患者中有8例在服用一周后CRP水平较服用前有所下降。此外，10名患者中有8名患者在补充后与补充前相比显示resolvin D1水平增加。
综上所述，这些数据表明富含dha的膳食补充剂至少部分通过上调resolvin D1来改善癌症相关的全身炎症反应。
结直肠癌、全身炎症反应、c反应蛋白、二十二碳六烯酸和resolvin D1
结直肠癌是目前最常见的癌症死亡原因之一[1]。虽然各种化疗方案和生物药物已经开发出来，但结直肠癌的疗效并不充分。过度炎症已成为包括癌症在内的许多人类流行疾病的关键组成部分[2,3]。越来越多的证据表明，包括结直肠癌在内的各种实体肿瘤中c反应蛋白(CRP)的升高是一个独立的预后因素[4-6]。既往报道显示，结直肠癌患者肿瘤和血清中的白细胞介素-6 (IL-6)在CRP升高等全身炎症反应中起关键作用[7-9]。然而，目前尚不清楚这种与癌症相关的炎症是否可逆。
-3脂肪酸(-3 FAs)主要促进抗炎活性[10]。海洋食品对癌症的治疗效果已经被几项实验研究所证实，这些实验研究的重点是omega-3脂肪酸[11-15]。Resolvin家族是由二十碳五烯酸(EPA)或二十二碳六烯酸(DHA)衍生的新型酶氧化脂质介质，最近在分解渗出物[16]中被发现。越来越多的基础研究证据表明，resolvin家族具有强大的抗炎和免疫调节作用[16-19]。然而，关于resolvin家族对癌症患者全身炎症(如CRP升高)的缓解作用的临床资料很少。
在这项研究中，首先，我们检查了通过升高CRP和化解蛋白证明的全身性炎症之间的关系。接下来，我们研究了DHA和/或EPA对人结肠腺癌细胞的细胞毒性作用。第三，我们确定了在接受化疗的晚期或复发性结直肠癌患者中补充富含dha的补充剂一周是否会改变炎症标志物，如CRP。
为了确定血清CRP水平与化解蛋白(化解D1和化解E1)之间的相关性，我们收集了35名确诊结直肠癌患者和10名健康志愿者的血液样本。使用N-Assay TIA CRP- s试剂盒(Nittobo Medical, Tokyo)，用浊度免疫分析法测定血清CRP水平。使用市售ELISA试剂盒测定血清中resolvin D1和E1的水平(resolvin E1;MyBiosource, Inc，圣地亚哥，加利福尼亚州，resolvin D1;开曼化工，密歇根州，美国)。
人类结直肠癌细胞系HT29和LoVo来自日本仙台东北大学发育、衰老和癌症研究所生物医学研究细胞资源中心。这些细胞株在添加10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素和100µg/ml链霉素的RPMI-1640培养基中，在37℃5%的湿化CO中保存2的气氛。DHA和EPA来自Sigma-Aldrich Inc. (Buchs, Switzerland)，稀释在乙醇中，在-80°C下以10mg/ml的浓度储存。
用WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2,4-二硫苯基)- 2h -四唑，单钠盐]比色法评价细胞毒性。WST-8是MTT测定法的改进，该方法使用一种商用试剂盒(细胞计数试剂盒，Dojindo Laboratories, Japan)用于估计细胞活力。HT29和Lovo细胞(5000个/孔)被接种到96孔细胞板(Becton Dickson Labware, NJ, USA)中100 μl的培养基中，在脂肪酸(FA)暴露前24小时，然后用不同浓度的DHA和/或EHA处理48小时。FA暴露到指定浓度和时间后，丢弃培养基，用90 μl新鲜培养基代替。取10 μl WST-8试剂溶液(细胞计数试剂盒;加入Dojindo Laboratories，熊本，日本)，在37℃的培养箱中孵育4小时。细胞活力由光密度(OD)比色法测定，波长为450 nm，使用microplate阅读器测量。根据制造商说明使用细胞计数试剂盒评估细胞毒性。从Lovo细胞系培养中获得的上清液在24、48、72小时收集，保存在−80℃，直到测定。使用市售IL-6 ELISA试剂盒(研发系统，Minneapolis, USA)测定IL-6上清浓度。
参与研究的是在日本三重大学医院接受治疗的结直肠癌患者。符合条件:年龄≥20岁;结直肠癌的组织病理学诊断;CRP≧0.5 mg / dL;以及化疗适应证。不包括那些在姑息治疗;服用他汀类或消炎药;对鱼类及其衍生物过敏;无口服摄入条件;曾经接受过化疗的; or patients with autoimmune diseases and; those who had used supplements containing fish oil or omega-3 FAs during the three months prior to study initiation. Individual energy requirements for patients were estimated by Harris-Benedict equation [20]. Based on these requirements, patients were advised to follow a diet based on standardized menus of 1600, 1800, or 2000 kcal. No extra calories were provided, and patients were given isocaloric diets.
鱼油补充剂以胶状微胶囊的形式提供，每胶囊20毫克(日本东洋胶囊公司)。每个胶囊含有11毫克n-3多不饱和脂肪酸(7.6毫克DHA和0.84毫克EPA)。研究人员要求参与者在日常饮食摄入的基础上，每天摄入200粒鱼油胶囊(2.2克/天)，持续一周。研究人员要求受试者在两顿正餐前约20-30分钟，以剂量分级的形式(100粒× 2次)摄入胶囊，并配以液体。此外，他们被要求以指定的形式记录胶囊摄入量。分别在补药前一天和一周后禁食约8小时后采集血液样本(9 ml)。用分离凝胶管收集材料，用于血清CRP和resolvin D1的测定。该研究方案得到了该机构人类研究和伦理委员会的批准，并符合《赫尔辛基宣言》。所有参与者都同意签署一份同意书。
曼-惠特尼U检验用于未配对组之间的比较。配对分析采用Wilcoxon符号秩检验。P值小于0.05为有统计学意义。
背景如表1所示。所有健康志愿者的CRP水平均低于0.5 mg/dL。28% (n=10)的结肠直肠癌患者CRP水平达到或大于0.5 mg/dL。当患者根据CRP水平被分为三组时，也就是说,CRP <0.5 mg/dl, 0.5≦CRP < 1.0 mg/dl, CRP≧1.0 mg/dl，健康志愿者、CRP <0.5 mg/dl、0.5≦CRP < 1.0 mg/dl、CRP≧1.0 mg/dl的溶E1中位数分别为1,802、1,902、2,688、1,174 μg/ml。各组间无显著差异(图1a)。健康志愿者、CRP <0.5 mg/dL患者、0.5≦CRP < 1.0 mg/dL患者和CRP≧1.0 mg/dL患者的D1分辨率中值分别为8,241、9,193、3,107、2,599 μg/ml。0.5≦CRP < 1.0 mg/dL和CRP≧1.0 mg/dL的患者resolvin D1水平明显低于健康志愿者(图1b)。健康志愿者与CRP <0.5 mg/dL的患者之间无显著差异。
表1。收集患者血清样本的人口学和临床特征，分析c反应蛋白和溶解蛋白之间的关系。
健康的志愿者 |
结直肠患者 |
|
N = 10 |
N = 35 |
|
年龄、中值(范围) |
60 (44 - 72) |
66年(42 - 81) |
男性(%) |
7 (70) |
22 (63%) |
c反应蛋白(mg/dL)，中位数(范围) |
0.085 (0.01 - 0.2) |
0.14 (0.01 - 16.42) |
c反应蛋白(%) < 0.5 0.5 - 1.0 > 1.0 |
10 |
25 (72%) 6 (17%) 4 (11%) |
阶段(%) 我 2 3 4 |
6 (17%) 15 (43%) 3 (9%) 11 (31%) |
图1所示。健康志愿者与结直肠患者CRP与化解蛋白水平的相关性a: resolvin E1, b: resolvin D1。正常健康志愿者;CRP<0.5，结肠直肠癌患者CRP<0.5mg/dl;0.5≦CRP<1.0，结直肠患者CRP<1.0mg/dl;1.0≦CRP, CRP≧1.0mg/dl的结直肠患者。
为了阐明DHA或EPA对细胞生长抑制的影响，我们分别评估了暴露于每种FA (DHA或EPA)后的细胞存活率的剂量依赖性。在HT29细胞暴露48小时后，采用WST-8比色法评估DHA或EPA对HT29细胞的细胞毒性作用。观察到单独使用DHA或EPA的生长抑制作用，其剂量和时间依赖于方式(图2和我们未发表的数据)。此外，与EPA相比，较低浓度时DHA对细胞生长的抑制作用不明显(图2a和b)。为了阐明DHA和EPA对细胞生长抑制的最佳组合比例，我们接下来分别评估了暴露在不同EPA和DHA组合比例下的细胞存活率。200 μM DHA的细胞毒性最为显著(图3)。关于DHA/EPA组合的临床应用，这些结果表明，高浓度的DHA可以有效抑制癌细胞生长。
图2。补充omega-3脂肪酸(DHA和EPA)对ht29结直肠癌细胞系细胞增殖的影响。一个DHA,b美国环境保护署。
由于IL-6的产生只在Lovo细胞中观察到，所以我们在本次检查中选择了Lovo细胞。在对照组(未处理)细胞的培养上清中，IL-6浓度随时间而升高。在孵育72小时后，经DHA处理的Lovo细胞中IL-6的产生明显比未经DHA处理的Lovo细胞更受抑制(图4)。
图3。不同组合比例DHA和EPA对ht29结直肠癌细胞系细胞增殖的影响。
图4。IL-6浓度的定量。200μM/L DHA处理细胞72 h。在24、48和72小时测定上清液中IL-6的浓度。
我们研究了dha富集补充剂对CRP升高的结直肠患者血清CRP水平的影响。本研究共纳入10例患者。患者的基线特征见表2。所有患者都能按照方案服用补充剂。虽然有一名患者出现大便疏松，但未观察到严重的不良事件。与补充前相比，有8例患者在补充一周后CRP水平降低(图5a)。其中5例患者补充后CRP <0.5 mg/dl(图5a)。虽然中位数降低率((补充前CRP -补充一周后CRP)/补充前CRP) × 100计算为64.3%，但没有观察到CRP水平在前后的显著差异(补充前CRP中位数为3.46 mg/dL;补充后中位CRP, 1.25 mg/dL;Wilcoxon符号秩检验:P=0.160)。 The levels of resolvin D1 after 1 week supplementation were increased in 8 patients compared with that before supplementation (Figure 5b). Seven of those eight patients showed the decreased CRP levels during supplementation. However, the significant difference between the levels of resolving D1 between before and after supplementation was not observed (median resolvin D1 before supplementation, 4431 μg/ml; median CRP after supplementation, 5830 μg/ml; Wilcoxon Signed-Rank test: P=0.193).
图5。补充dha前后血清c反应蛋白和resolvin D1水平
a，血清c反应蛋白水平;b，血清resolvin D1水平
表2。DHA丰富补充剂研究的基线特征
N = 10 |
|
年龄(年)(中位数，范围) |
61 (37 - 73) |
性别 |
|
男性 |
6 |
女 |
4 |
疾病状态 |
|
先进的 |
7 |
递归式 |
3. |
体重指数(kg/m)2)(中值、范围) |
21.8 (15.7 - 30.0) |
本研究表明，伴有全身炎症反应的结直肠癌患者血清resolvin D1水平明显降低，富含dha的补品有可能通过提高血清resolvin D1水平来改善结直肠癌患者的全身炎症反应。
omega-3脂肪酸的一个亚组，主要是EPA和DHA，是必需的脂肪酸，长期以来被认为对代谢功能障碍很重要。Resolvins是一种新型的autacoids家族，在分解炎症渗出液中酶促生成，由前体必需的omega-3 FAs生物合成，如EPA和DHA[21]。它们与一系列疾病有关，包括炎症性疾病[22,23]。Resolvins是一个新的研究领域，可能有助于解决各种疾病的炎症。有涉及CRP升高的全身性炎症反应的结直肠癌患者的预后比无CRP升高的患者差[4-6]。据我们所知，还没有分析CRP升高与resolvins之间的相关性。有趣的是，该研究表明CRP水平升高的患者resolvin D1水平明显低于没有CRP的患者或健康人群。结果提示，resolvin D1可能在解决癌症相关的全身炎症中发挥关键作用。
Omega-3脂肪酸也被证明可以抑制几种恶性癌细胞的生长。Habermannet al。发现DHA是包括EPA[24]在内的FAs中细胞毒性最强的。这与我们的协议是一致的在体外在HT29细胞中，DHA比EPA更有效地抑制细胞存活，可能是由于在结直肠细胞系中DHA的细胞内吸收率高于EPA。
众所周知，白细胞介素(IL) -1-IL-6网络刺激CRP的急性期表达，而CRP与Fc受体的相互作用导致促炎细胞因子的产生，增强炎症反应[25]。IL-6-IL-6受体自分泌环先前被发现存在于结直肠癌中，创造了一个更有利于肿瘤生长的局部环境[26,27]。IL-1的生物学效应β自IL-1以来，与il -6诱导细胞生长的几个实验特征密切相似β以自分泌方式诱导IL-6。此外，急性期反应物(如CRP升高)的存在，通过上调局部IL-1-IL-6网络系统[9]，导致肿瘤微环境适合结直肠癌细胞的生存。目前尚不清楚DHA是否有减少癌细胞产生IL-6的潜力。最近，在炎症的消退阶段发现了新的介质，如resolvin和protectins，它们都是DHA和EPA的产物。DHA是否抑制结直肠癌细胞产生IL-6的报道较少。有趣的是，我们的研究表明DHA具有降低结直肠肿瘤细胞IL-6的潜力。
在人体中补充omega-3脂肪酸的结果普遍显示治疗效果改善，对患者的风险和副作用更小[28-30]。因此，DHA和/或EPA可以与化疗或放疗结合使用，具有潜在的有益效果。Bougnoux等人发现，在[31]化疗的乳腺癌患者中，DHA存在临床益处。这种肿瘤进展抑制和生存延长与血浆中DHA的吸收水平有关。根据我们的研究结果在体外在研究和之前的临床研究中，我们假设富含dha的omega-3游离FAs可能改善全身炎症反应，如CRP升高。
为了在人体环境下进行补充研究，有两个问题:omega-3游离FAs的最佳剂量和最佳持续时间。从以前的研究来看，EPA和DHA的组合剂量通常以鱼油的形式存在，从每天600毫克到3.6克不等，EPA和DHA的比例不同。基于临床效益，n-3长链PUFA (EPA和/或DHA)的最佳安全剂量约为2克/天[29,32,33]。在以前的研究中，补充的持续时间从1到12周不等。因此，在临床环境中使用富含dha的补充剂(2.2 g/天，一周补充)。由于我们的目的是评估富含dha的补充剂对全身炎症反应的影响，且血清CRP水平的半衰期较短(6 ~ 8小时)，所以我们的研究将补充时间定为一周。
根据CRP水平，在一些研究中观察到补充omega-3 FAs后，系统炎症水平降低[30,32,35 - 37]。这些先前的研究证实了鱼油FAs的抗炎活性，并进一步表明这种补充剂可能有益于肿瘤患者。尽管一些研究表明-3脂肪酸FAs有助于管理持续的慢性炎症状态，但入选的受试者都是有全身炎症反应和没有全身炎症反应的患者。因此，omega-3 FAs对全身炎症反应的影响尚未完全了解。虽然在我们的研究中没有观察到CRP水平在补充前后的显著差异，但富含dha的补充可以改善大多数结直肠患者的全身炎症反应。为了证实这一发现，需要在未来进行大规模的前瞻性研究。
总之，对于结直肠癌患者来说，富含dha的补充剂能够改善因血清resolvin D1水平降低而恶化的全身炎症反应。这种补充对伴有全身炎症反应的结直肠癌的治疗具有辅助作用。
那种Nishizawa
军事大学
研究文章
收稿日期:2016年10月24日
录用日期:2016年11月14日
发布日期:2016年11月16日
©2016 Mohri Y.这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可协议发布，该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。
Mohri Y, Tanaka K, Imaoka H, Miki C, Fujikawa H等(2016)dha富集补充剂通过产生resolvin D1改善癌症相关的全身炎症反应:一项单一机构研究。生物医学医学临床应用1:DOI: 10.15761/BRCP.1000121
日本三重大学医学院胃肠与儿科外科，三重514-8507,tsusu Edobashi 2-174，电话:+81-59-231-5294;传真:+ 81-59-232-6968。
表1。收集患者血清样本的人口学和临床特征，分析c反应蛋白和溶解蛋白之间的关系。
健康的志愿者 |
结直肠患者 |
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N = 10 |
N = 35 |
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年龄、中值(范围) |
60 (44 - 72) |
66年(42 - 81) |
男性(%) |
7 (70) |
22 (63%) |
c反应蛋白(mg/dL)，中位数(范围) |
0.085 (0.01 - 0.2) |
0.14 (0.01 - 16.42) |
c反应蛋白(%) < 0.5 0.5 - 1.0 > 1.0 |
10 |
25 (72%) 6 (17%) 4 (11%) |
阶段(%) 我 2 3 4 |
6 (17%) 15 (43%) 3 (9%) 11 (31%) |
表2。DHA丰富补充剂研究的基线特征
N = 10 |
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年龄(年)(中位数，范围) |
61 (37 - 73) |
性别 |
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男性 |
6 |
女 |
4 |
疾病状态 |
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先进的 |
7 |
递归式 |
3. |
体重指数(kg/m)2)(中值、范围) |
21.8 (15.7 - 30.0) |
图1所示。健康志愿者与结直肠患者CRP与化解蛋白水平的相关性a: resolvin E1, b: resolvin D1。正常健康志愿者;CRP<0.5，结肠直肠癌患者CRP<0.5mg/dl;0.5≦CRP<1.0，结直肠患者CRP<1.0mg/dl;1.0≦CRP, CRP≧1.0mg/dl的结直肠患者。
图2。补充omega-3脂肪酸(DHA和EPA)对ht29结直肠癌细胞系细胞增殖的影响。一个DHA,b美国环境保护署。
图3。不同组合比例DHA和EPA对ht29结直肠癌细胞系细胞增殖的影响。
图4。IL-6浓度的定量。200μM/L DHA处理细胞72 h。在24、48和72小时测定上清液中IL-6的浓度。
图5。补充dha前后血清c反应蛋白和resolvin D1水平
a，血清c反应蛋白水平;b，血清resolvin D1水平
