加州大学分子，蜂窝和发育生物学系，美国圣巴巴拉大学
医学院，医学科学，印第安纳大学，布卢明顿，美国
电子邮件:jesstang@indiana.edu
加州大学分子，蜂窝和发育生物学系，美国圣巴巴拉大学
加州大学分子，蜂窝和发育生物学系，美国圣巴巴拉大学
加州大学分子，蜂窝和发育生物学系，美国圣巴巴拉大学
DOI: 10.15761 / ICST.1000119
富含抗氧化剂的水果，如浆果和石榴，已经被证明有许多生物效应，包括抗癌活性。我们之前报道过越橘(欧洲蓝莓)提取物对MCF7-GFP-Tubulin乳腺癌细胞具有细胞毒性作用。为了进一步研究越桔提取物的作用机制，我们重点研究了越桔中最丰富的两种花青素，飞燕花素和花青素。在本研究中，我们检测了飞燕草苷和花青素对MCF7乳腺癌细胞的自由基清除活性、抗增殖和凋亡作用，并与维生素E类似物Trolox进行了比较。DPPH自由基清除活性测定显示50%的抗氧化活性50对于德尔芬蛋白，青霉素和摩罗松分别为80μm，63μm，1.30μm。由SRB测定法测定，显示Delphinidin，CyanIndin和Trolex，以抑制IC的MCF7细胞增殖50分别为120µM、47.18µM和11.25µM。免疫荧光显示飞燕草素、花青素和Trolox可引起细胞聚集、假足回缩、染色质凝聚、细胞质细胞器轻微修饰和质膜起泡等凋亡特征。综上所示，飞燕草苷和花青素具有明显的自由基清除活性，抑制细胞增殖，增加MCF7乳腺癌细胞凋亡。
花青素，越桔提取物，乳腺癌，细胞凋亡，微管蛋白损伤
花青素的总量和四个氧自由基吸收能力Vaccinium蓝莓被发现是抗氧化植物营养素[1]最丰富的来源之一。越桔(Vaccinium myrtillus)含有几种花青素，其中含量最高的花青素，比花青素低2.5倍的飞燕花素和芍药花素，以及malvidin和peonidin[2]。
使用植物药物(如花青素)替代化学治疗或化学预防活动中使用的合成化合物的健康优势正引起公众越来越多的兴趣[3,4]。花青素具有多种抗癌作用，包括细胞毒性[5]、抗氧化[6-12]、抗炎症[13]、细胞周期扰乱[14]、清除活性氧自由基作用[11,15]、脂质过氧化[16]、抗增殖[5,17-19]、表皮生长因子受体抑制[20]和凋亡[21-24]。此外，碧萝芷，一种从松树树皮中提取的制剂，含有大量的原花青素，选择性地诱导人类乳腺癌细胞(来自人类乳腺纤维囊性组织)的死亡，但不诱导正常的人类乳腺MCF-10细胞[25]。
最近，我们已经证明了Bilberry提取物的MCF7人乳腺癌细胞的增殖，细胞周期骤停和凋亡样细胞毒性[26]。由于它们在胆汁中的丰富，检查了德尔芬蛋白和青霉素，以便在MCF7细胞中进行自由基清除能力，抗增殖效应和凋亡诱导效应。此外，将Delphinidin和Cyanidin与Trolox进行比较，维生素E类似物用作用于抗氧化能力的参考化合物。DPPH自由基清除测定，苏尔磺胺胺B增殖测定和免疫细胞化学测定用于检测Delphinidin，Cyanidin和Trolox对MCF7细胞的抗癌作用。
除非另有说明，本实验使用的所有化学药品和试剂均购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, usa)。在1mg花青素中分别加入30.98 μl和29.52 μl二甲基亚砜(DMSO)溶解花青素氯和飞翠素氯，获得100mM的原液浓度。Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基-2-羧酸)购自美国Calbiochem公司。
来自美国Rockville的American Type Culture Collection的人高加索乳腺腺癌(MCF7)细胞，在Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基(DMEM)中生长，DMEM添加10%胎牛血清(Atlanta Biological, Atlanta, GA, U.S.A.)、l -谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸液、碳酸氢钠、青霉素G (100U/mL)、链霉素(100 μg/mL)°在含95%空气和5% CO的潮湿环境中2[27]。每3-4天更换一次培养基，加倍时间为36h。
通过与DPPH(2,2-二苯基-1-苦肼基)自由基反应，比较了飞燕草苷、花青素和Trolox (Calbiochem)对自由基的清除能力。DPPH (Sigma-Aldrich)溶于甲醇，最终浓度为4mg/ml。在DMSO中从500 μM开始稀释花青素和飞燕花素的浓度。在20 μM乙醇中制备Trolox。飞燕花苷、花青素和Trolox稀释溶液置于96孔微量滴定板中。将1:20稀释的DPPH原液100 μL注入每孔，置暗室静置。所有井的光密度测量在490nm (OD490)，在加入DPPH前后均有微版读卡器。反应溶液的吸光度值在490nm和30min用分光光度法测量，并转换成百分比抗氧化活性(AA)，使用以下公式:
AA％= 100 - {[（ABS样本——Abs空白) x 100) / Abs控制｝
DPPH溶液和乙醇为阴性对照。绘制% AA与浓度的曲线，建立标准曲线，计算IC50值采用线性相关公式。
MCF7细胞以2x10的密度播种5/mL(每孔0.1mL)在96孔微量滴定板上固定24小时后再处理。在添加10%胎牛血清的DMEM中(乙醇最终浓度为1.4%或以下)，飞翠花素、花青素和Trolox分别从1000 μM、250 μM和20 μM开始稀释。进行了初步实验(数据未列明)以确定剂量范围。在对照孔中单独添加1.4%的70%乙醇时，不影响细胞的增殖。孵育72h后，用10% (wt./vol.)三氯乙酸固定细胞，用0.4% SRB溶液染色30min，然后用1% (wt./vol.)乙酸反复洗涤去除多余染料。用Tris缓冲液洗脱染料，并在490nm处进行光度定量。生长抑制率计算为:
(OD最高浓度x 100）/ od最低浓度
mcf7 - gfp -微管蛋白细胞在6孔板的盖玻片上生长，分别用浓度为100μM、250μM和20μM的飞翠素、花青素和Trolox处理24小时。对花青素和Trolox给药的MCF7细胞进行肌动蛋白、微管蛋白和DNA染色的免疫荧光显微镜，而飞翠素处理的MCF7细胞仅进行DNA和微管蛋白染色。细胞被固定在3.7%甲醛和沾兔单克隆抗体-α微管蛋白(1:50 0)0.5% BSA-PBS或Alexa488 -α兔子BSA(施用)的1.0%,其次是增加FITC-conjugated anti-mouse二级抗体染色微管和rhodamine-conjugated phalloidin(表达载体,卡尔斯巴德,CA)染色肌动蛋白丝。用DAPI培养基(Invitrogen公司)将细胞固定在含有40,6-二氨基-2-苯基吲哚的延长金的显微镜载玻片上。显微镜使用旋转圆盘共聚焦显微镜(IX81 DSU型，奥林巴斯，东京，日本)。在SlideBook软件(Olympus)的控制下，使用ImagEM相机(日本静冈县滨松)采集图像。
结果报告为至少三个独立实验的平均值。将各组平均值换算为控制值的百分比，表示为平均值±标准差。
采用DPPH抗氧化测定法，比较飞燕草苷和花青素对自由基的清除能力与参比标准抗氧化剂特乐丝的清除能力。cyanidin和delphinidin的浓度(500μM)近似于预先确定的可比Trolox浓度(20μM)，以确定抗癌作用是纯粹的抗氧化作用还是其他一些特殊的作用机制。飞燕草苷和花青素清除DPPH自由基的能力与对照相比呈浓度依赖性。DPPH孵育30min后，测定吸光度和IC值50使用抗氧化活性百分比的线性相关性计算值。IC <50delphinidin、cyanidin和Trolox分别为80μM、63μM和1.30μM(图1)。
图1所示。Delphinidin，Cyanidin和Trolex的根治灭菌活性。允许DPPH自由基清除不同浓度的（a）玻璃蛋白，（b）cyanidin，（c）rotox 30min。测定抗氧化活性（AA％）的百分比。在30分钟，IC50飞燕草苷、cyanidin和Trolox分别为80μM、63 μM和1.30μM。
MCF7细胞用德尔菲蛋白，花青蛋白和木质蛋白处理，分别以1000μm，250μm和20μm开始顺序稀释。在24小时孵育后，滴水蛋白，花青蛋白和滴鼻菌的治疗表现出对MCF7细胞生长的浓度依赖性抑制。IC.50delphinidin、cyanidin和Trolox对DPPH自由基的清除率分别为120μM、47.18μM和11.25μM(图2)。低浓度的1μM甚至0.1μM Trolox抑制了40%的MCF7细胞生长。
图2。MCF7细胞暴露于飞燕草、花青素和Trolox的增殖。(A) Delphinidin、(B) Cyanidin和(C) Trolox暴露24h后，在490 nm处测量SRB染色的MCF7细胞。百分比抑制显示和估计的IC50delphinidin、cyanidin和Trolox分别为120μM、47.18μM和11.25μM。
分别以100μM、125μM和20μM浓度处理MCF7-GFP-Tubulin细胞24小时。DAPI、微管蛋白和肌动蛋白荧光显微镜检测表明，飞燕草苷、花青素和Trolox均能对MCF7细胞产生一定程度的形态学损伤。对照MCF7细胞显示圆形、均匀染色的细胞核，完整的微管蛋白和肌动蛋白聚合物从细胞核完全延伸(图3A,3E,3I)。在50μM delphinidin处理24小时后，观察到细胞聚集和底物分离，微管蛋白和染色质冷凝(图3B)。在75μM和100μM delphinidin时，大部分细胞不是死亡就是分离，但在死亡的过程中，出现假极缩回、染色质缩聚、微管蛋白聚集(图3C,3D)。62.5μM、125μM和250μM花青素处理24h后，微管蛋白和肌动蛋白微丝严重碎片化，可见细胞聚集、染色质凝聚和质膜起泡，呈剂量依赖性(图3F,G,H)。在最低浓度1.25μM Trolox下，只有部分MCF7细胞有凋亡特征，即使有，也比较高浓度下的MCF7细胞凋亡程度低(图3J)。Trolox处理5μM和20μM时，假足细胞缩回，质膜受损，染色质缩聚(图3K,3L)。在集成电路50=11.25μM Trolox, MCF7细胞出现典型的凋亡特征。细胞呈圆形，染色质凝聚，质膜起泡。飞燕花素、花青素和Trolox的细胞学损伤与我们的近似IC一致50在SRB抗增殖试验中可见。
图3。在不同浓度的飞燕草素、花青素和特罗洛丝下拍摄细胞图像。在没有或有飞燕花素、花青素或Trolox孵育24小时后，固定MCF7细胞的微管(绿色)、肌动蛋白(红色)和DNA(蓝色)免疫荧光图像显示飞燕花素、花青素和Trolox对MCF7细胞微管、肌动蛋白和核组织的影响。A-D: Delphinidin - Control, 50μM, 75μM, 100μM;E-H: Cyanidin - Control, 62.5μM, 125μM, 250μM;I-L: Trolox - Control, 1.25μM, 5μM, 20μM。
我们之前报道过越桔提取物抑制MCF7细胞增殖并诱导细胞凋亡[26]。本研究以MCF7人乳腺腺癌细胞为模型，研究越桔中常见花青素、飞燕花素和花青素的抗癌作用。在以往的研究中，越橘[15]中丰富的飞燕草苷和花青素通过各种含花青素的提取物或纯化的花青素组分体外抑制癌细胞生长[20,28,29]。
鉴于Delphinidin和Cyanidin是抗氧化剂，将Delphinidin和Cyanidin的自由基清除能力与Trolex，参考标准抗氧化剂的清除作用进行比较，DPPH抗氧化剂测定。飞燕草苷和花青素清除DPPH自由基的能力与对照相比呈浓度依赖性。IC.50值分别为80μM、63μM、1.30μM(图1)。cyanidin清除DPPH自由基的能力强于飞燕草，而Trolox清除DPPH自由基的能力最强。Kahkonen等．[6]的DPPH自由基清除能力分别为42μM、33μM和35μM。田中等．[30]还报告了32.3μm和31.2μmdpphic50花青素和特洛克斯的值。Rice-Evens和他的同事报告说，花色素B环的三羟基化既不会增强也不会减弱Trolox等量的抗氧化能力[25]。尽管Trolox只有两个羟基，但其巨大的潜力仍有待阐明。总的来说，DPPH检测结果与之前关于B环羟基化和甲氧基化对[6]水相自由基清除能力影响的观察结果一致。
采用SRB细胞毒性试验测定飞燕草苷和花青素的抗增殖作用50这两种花青素的值。花青素的IC较低50值为47.18μM，而花翠素为120 μM，这与花翠素较强的DPPH清除能力有关。Trolox的IC最低50值为11.25μM也与DPPH检测结果相关。已有研究证实，天然食物色素和花青素对乳腺、结肠、胃、中枢神经系统和肺肿瘤细胞具有剂量依赖性的生长抑制作用[16,31,32]。未来的研究包括用飞燕草苷和花青素治疗正常乳腺细胞，以发现细胞毒性作用是否针对乳腺癌细胞。赵和同事证明富含花青素的提取物可以抑制癌症，但不能抑制正常的结肠癌细胞生长[32]。此外，阐明花青素[33]的细胞机制摄取和生物利用度非常重要，因为花青素的替代模式影响细胞增殖信号级联[33,35]，可能是表皮生长因子受体[20]的有效抑制剂。
在我们之前发表的越桔提取物研究中，免疫荧光显微镜显示，高浓度的飞苔素和花青素导致微管蛋白和肌动蛋白解聚，胞体呈圆形，核浓缩。与DPPH和SRB检测结果类似，低浓度Trolox (5μM)对微管有显著损伤。这是我们所知的第一个观察飞燕花素和花青素对细胞中MCF7微管和肌动蛋白结构的影响的报道。
2021年版权燕麦。所有权利reserv总体而言，Delphinidin，Cyanidin和Trolex能够有效地清除DpPH自由基，抑制MCF7细胞生长，并诱导在免疫荧光图像中所见的特征凋亡特征。尖锐的是，在其结构上仅具有2个羟基的滴油，能够清除DPPH自由基，抑制细胞生长，并使细胞凋亡与具有6和5个羟基的Delphinidin和Cyanidin一起引起更低的浓度。这些实验的目的是阐明花青素是否作为抗氧化剂是导致MCF7乳腺癌细胞中细胞毒性的关键机制。Trolox，维生素E衍生物和抗氧化剂，更有效地诱导细胞毒性对导致我们的细胞的细胞效应，以思考Delphinidin和Cyanidin等花青素可能导致MCF7细胞的细胞凋亡，而不是不同的机制。未来的研究来检查替代司蛋白和青霉素的作用机制包括阐明生化特征，例如促凋亡Bcl-2家族蛋白的活化，胱天蛋白酶的激活，线粒体膜电位，oglion核糖囊组片段，血浆膜破裂和ROS的活化。
构思和设计:Jessica Tang, Emin Oroudjev, George Ayoub, Leslie Wilson。
方法论的发展：Jessica Tang，Emin Oroudjev，George Ayoub，Leslie Wilson
数据获取:Jessica Tang。数据分析和解释:Jessica Tang, Emin Oroudjev, George Ayoub。手稿的写作、审查和/或修订:Jessica Tang, George Ayoub。学习指导:George Ayoub, Leslie Wilson。
Catherine Zheng和Breanna Duplisea的技术援助非常承认。Cyanins在美国专利6,783,754覆盖的防晒应用中的使用。许可机会的联系是：Roy Mankovitz，Montecito Wellness LLC，1482东谷Rd，Suite 808，Santa Barbara，CA 93108，USA，1-805-969-4604。
这项工作得到了圣巴巴拉小屋医院研究资助计划、加州大学圣巴巴拉分校本科生研究和创新活动资助计划(#S3993)以及Roy Mankovitz先生的支持，以感谢他为这项研究提供了资金。
音)山口
埃默里大学医学院
研究文章
收稿日期:2015年1月20日
录用日期:2015年2月07日
发布日期:2015年2月9日
©2015杰西卡唐。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。
Jessica Tang, Emin Oroudjev, Leslie Wilson, George Ayoub(2015)飞燕草苷和花青素在MCF7人乳腺癌细胞中表现出抗增殖和凋亡作用。整合癌症科学治疗。2:DOI: 10.15761/ICST.1000119
图1所示。Delphinidin，Cyanidin和Trolex的根治灭菌活性。允许DPPH自由基清除不同浓度的（a）玻璃蛋白，（b）cyanidin，（c）rotox 30min。测定抗氧化活性（AA％）的百分比。在30分钟，IC50飞燕草苷、cyanidin和Trolox分别为80μM、63 μM和1.30μM。
图2。MCF7细胞暴露于飞燕草、花青素和Trolox的增殖。(A) Delphinidin、(B) Cyanidin和(C) Trolox暴露24h后，在490 nm处测量SRB染色的MCF7细胞。百分比抑制显示和估计的IC50delphinidin、cyanidin和Trolox分别为120μM、47.18μM和11.25μM。
图3。在不同浓度的飞燕草素、花青素和特罗洛丝下拍摄细胞图像。在没有或有飞燕花素、花青素或Trolox孵育24小时后，固定MCF7细胞的微管(绿色)、肌动蛋白(红色)和DNA(蓝色)免疫荧光图像显示飞燕花素、花青素和Trolox对MCF7细胞微管、肌动蛋白和核组织的影响。A-D: Delphinidin - Control, 50μM, 75μM, 100μM;E-H: Cyanidin - Control, 62.5μM, 125μM, 250μM;I-L: Trolox - Control, 1.25μM, 5μM, 20μM。
